马链球菌马亚种HLJ2018D-LX株及其在制备马链球菌马亚种灭活疫苗中的应用

本发明涉及一种马链球菌马亚种其在制备马链球菌马亚种灭活疫苗中的应用，特别涉及一株自行分离得到的马链球菌马亚种HLJ2018D-LX株以及由该细菌株制备得到的灭活疫苗。属于生物疫苗领域。

腺疫(Strangles)，是由马链球菌马亚种(Streptococcus equi subspeciesequi)引起的以马属动物下颌淋巴结肿胀为主要症状的急性接触性传染病，其中马链球菌马亚种是主要病原菌，只对马属动物具有致病性，具有溶血素S，磷脂酶A2，表面抗原seM蛋白等多种抗原。除冰岛外，全球均有腺疫疫情出现，马链球菌马亚种主要感染马，驴骡次之。4个月至4岁的马均易感，其中2岁以下的幼驹发病最多，而2个月内的马驹及5岁以上的马不易感染。本病多发于春、秋两季，一般为九月至次年的四月间，此时气候较为寒冷，马匹较为集中，是本病多发的间接原因之一，其他季节呈散发性，并造成了比较严重的经济损失。关于驴得腺疫，我国报道相对较少。以往驴腺疫方面的研究不被关注，国内和国际的相关研究并不多见，也不深入，是一种被忽视的传染病。但随着以阿胶为代表的驴制品在中国乃至世界的热销，近年来我国出现了养驴热潮，传统的农户养驴方式已经满足不了市场需求，从而出现了越来越多的驴饲养场，逐渐形成了我国独有的驴集约化饲养方式。而随着集约化饲养的发展，传统的“驴不得病”的观念早已被打破，越来越多的驴场开始面临鸡场、猪场等集约化饲养场相同的疫病传播问题。很多驴场出现了一病病一，一倒倒一地的情况，我国山东、内蒙古等地区驴腺疫出现了不同程度的发病率，尤其是驴驹，发病率可高达80％。经过哈尔滨兽医研究所马传染病与慢病毒病创新团队对患腺疫病驴病料样品进行细菌分离鉴定，成功分离到溶血菌，经特异方法检测(生化检测，革兰氏染，电镜观察，基因测序分析)确定为马链球菌马亚种。该病的发生给养驴业造成严重的间接经济损失，而且该病还有蔓延的趋势，对我国驴业持续发展产生了潜在的威胁和巨大的影响，严重阻碍了我国驴业的发展。

本发明的发明人在2018年从某驴场疑似患腺疫驴驹鼻拭子中分离到一株马链球菌马亚种，经实验室鉴定为强毒株，命名为HLJ2018D-LX。利用HLJ2018D-LX株，开展了马链球菌马亚种驴源株灭活疫苗的研制开发工作，筛选培育出免疫原性良好、效价稳定的马链球菌马亚种强毒HLJ2018D-LX株，选择了符合制造疫苗的灭活剂、佐剂及其他条件。对制品的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等都进行了试验测定，并获得了大量的试验数据，证明本疫苗安全有效。在此基础上，进行了中试生产，经抽样检验，全部符合拟定的质量标准，并对中试产品进行了安全试验和效力试验，其结果也证实本疫苗能有效地预防由马链球菌马亚种导致的腺疫，在实验室试验、中间试制的基础上，本发明研制出了马链球菌马亚种(HLJ2018D-LX株)灭活疫苗，是首次制备出驴用马链球菌马亚种灭活疫苗，其结果也证实本疫苗能有效地预防由马链球菌马亚种导致的腺疫，进一步验证了本疫苗的各项质量标准。

本发明的目的之一是提供一种免疫原性良好、效价稳定的马链球菌马亚种驴源株；

本发明的目的之二是提供所述的马链球菌马亚种菌株在制备疫苗中的应用；

本发明的目的之三是提供一种由所述的马链球菌马亚种菌株制备得到的疫苗；

本发明的目的之四是提供所述的疫苗在制备由马链球菌马亚种引起的疾病的生物制品中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的发明人在某驴场患腺疫驴驹鼻拭子中分离到一株马链球菌马亚种驴源株，经鉴定为强毒株，命名为HLJ2018D-LX。本发明的HLJ2018D-LX株是从发生典型马链球菌马亚种感染导致驴驹粘脓鼻拭子中分离获得的。经哥伦比亚血平板培养基分离和实验室鉴定后可作为疫苗毒种，该毒株在1*103CFU/0.2ml攻毒6周龄18-21g Balb/c鼠时，9天内可以引起小鼠100％死亡。

本发明的一株马链球菌马亚种驴源株，经实验室鉴定后，命名为HLJ2018D-LX，分类命名为马链球菌马亚种(Streptococcus equi subsp.equi)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.19353，保藏日期为2020年1月14日。

本发明还提供了所述的马链球菌马亚种驴源株在制备马链球菌马亚种灭活疫苗中的应用。

本发明的一种马链球菌马亚种灭活疫苗，其特征在于含有灭活后的本发明所述的马链球菌马亚种驴源株HLJ2018D-LX株。

在本发明所述的马链球菌马亚种灭活疫苗中，优选的，所述的马链球菌马亚种驴源株HLJ2018D-LX株采用以下方法进行灭活：0.2％(v/v)的甲醛(HCHO)在28℃、130rpm/min条件下灭活48小时，涂布哥伦比亚血平板，37℃，培养3天，无菌，则灭活合格，然后再继续灭活12h，利用PBS洗2遍，去除甲醛。

在本发明中，优选的，所述的马链球菌马亚种灭活疫苗是由5％(v/v)的法国赛比克公司的商品化MONTANIDE PET GEL A佐剂和0.2％(v/v)甲醛(HCHO)灭活的马链球菌马亚种(HLJ2018D-LX株)乳化后得到。

在本发明中，乳化工艺是采用法国赛比克公司的商品化MONTANIDE PET GEL A佐剂，除菌后可直接用于疫苗乳化制备；乳化前将灭活的同批马链球菌马亚种菌液混合，佐剂按照总体积5％的比例混合。

进一步的，本发明还提供了所述的灭活疫苗在制备预防由马链球菌马亚种引起的疾病的生物制品中的用途。

优选的，所述的疾病为由马链球菌马亚种导致的腺疫。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明的马链球菌马亚种驴源株HLJ2018D-LX株具有免疫原性好、培养特性好等优点，将本发明的马链球菌马亚种驴源株HLJ2018D-LX株接种于链球菌增菌液，培养后，用甲醛(终浓度0.2％)灭活后，制备成灭活疫苗。实验证明，使用本发明制备得到的马链球菌马亚种驴源株灭活疫苗免疫小鼠后，能够使小鼠免于强毒马链球菌马亚种的攻击，在驴体试验上大大降低发病率，此疫苗具有安全、低剂量免疫等优点，是首个驴用马链球菌马亚种灭活疫苗，可以作为一种预防由马链球菌马亚种引起的腺疫。

图1为马链球菌马亚种的分离与鉴定；

图2为16S rRNA基因的PCR扩增；

图3为HLJ2018D-LX生长曲线；

图4为HLJ2018D-LX攻毒后小鼠的生存曲线。

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1马链球菌马亚种驴源株HLJ2018D-LX株的分离及培养鉴定

根据新生物制品申报要求，结合本发明获得的大量的试验数据，参照《中国兽药典》(2005年版)，对制苗用毒种进行了鉴定，现将试行规程(草案)中毒种标准进行以下说明。

1毒种来源

本发明的HLJ2018D-LX株是从发生典型马链球菌马亚种感染导致幼驹流出的粘脓性鼻液中分离获得的。将患腺疫驴驹鼻拭子，划线接种于在哥伦比亚血平板培养基上出现典型的β溶血，如图1所示。

将分离纯化得到的β溶血菌菌株接种到血琼脂培养基中，37℃培养12h，用无菌接种环挑取单菌落接种于生化鉴定微管中，参考中华人民共和国农业行业标准《马腺疫诊断技术》(NY/T 571-2018)进行吡咯烷酮试验(PYR)、Voges-Proskauer试验(V-P)、精氨酸、二苯基膦(DPP)、磷酸葡萄糖变位酶(PMG)、七叶灵、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、替莫唑胺(TMZ)、蕈糖、蔗糖、山梨醇和溶血特征共12项生物学特性的鉴定。根据链球菌生化编码鉴定手册进行查询鉴定结果为1005，马链球菌马亚种认定指数96.8％，可确定分离菌为马链球菌马亚种(表1)。

表1马链球菌马亚种的生化鉴定

注：﹢阳性，﹣阴性

利用马链球菌马亚种16S rRNA引物，对HLJ2018D-LX菌株进行PCR扩增(图2)和测序，测序结果证实，该菌株为马链球菌马亚种。

测定HLJ2018D-LX菌在链球菌增菌液中的生长曲线，每小时进行细菌计数；结果表明，0-1h，处于平衡期；1-5h处于对数生长期，5h以后处于平衡期，结果如图3所示。

将马链球菌马亚种HLJ2018D-LX株分别以1*102CFU/0.2ml、1*103CFU/0.2ml、1*104CFU/0.2ml、1*105CFU/0.2ml、1*106CFU/0.2ml,腹腔注射小鼠，HLJ2018D-LX株在浓度为1*103CFU/0.2ml能使小鼠9天内全部致死，如图4。因此，HLJ2018D-LX株属于强毒株。

将该HLJ2018D-LX株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.19353，保藏日期为2020年1月14日。

2毒种(HLJ2018D-LX株)标准

2.1毒力

细菌代次为马链球菌马亚种HLJ2018D-LX株第2～10代。攻毒剂量为1*103CFU/0.2ml，程序是SPF级6周龄Balb/C雌性小鼠8只，采取腹腔注射方式，注射后观察两周左右，每天记录小鼠死亡情况；判定标准是攻毒后，小鼠应全部死亡，组内小鼠平均体重回升可判定不致死。

2.2免疫原性

将毒种接种于链球菌增菌液进行培养，利用离心管稀释，采用平板涂布法计数，用甲醛溶液灭活后，加MONTANIDE PET GEL A佐剂混合乳化制成水包油型灭活疫苗，用SPF级6周龄Balb/C雌性小鼠8只，腹腔注射菌苗1*10^7CFU/0.2ml，18天后，连同条件相同的对照鼠5头，腹腔注射强毒株C77-1各5个最小完全致死剂量/0.2ml(MLD)，攻毒后观察15天，对照组应7日内全部死亡，免疫组小鼠15天内，死亡不超过2只。

2.3毒种使用代次

利用显培养基，划线连续传代，传至40代，以20、30、40代，以最小完全致死剂量MLD去攻毒8只小鼠，观察15天，死亡率分别为87.5％、75％、75％。制备成灭活疫苗，以最低免疫剂量免疫8只小鼠，第19天，攻活菌，5MLD。每组小鼠死亡1只，小鼠免疫保护率均为87.5％，对照组100％死亡。为考虑菌株的毒力及疫苗免疫原性，将菌株最高代次定为20代。

实施例2灭活疫苗的制备

1灭活工艺

选择终浓度为0.1％(v/v)、0.15％(v/v)、0.2％(v/v)的甲醛溶液在4、28℃、37℃灭活，结果表明0.2％(v/v)甲醛在28℃灭活48小时，灭活效果完全。因而最终确定0.2％甲醛在28℃灭活48小时，涂布哥伦比亚血平板，37℃，培养3天，无菌，则灭活合格，然后再继续灭活12h。利用PBS洗2遍，去除甲醛。

2乳化工艺

采用法国赛比克公司的商品化MONTANIDE PET GEL A佐剂混合乳化制成水包油型灭活疫苗，乳化前将灭活的同批马链球菌马亚种菌液混合，佐剂按照总体积5％的比例混合。利用PBS定容。调pH值7.40±0.02。

3半成品检验质量标准

3.1无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

3.2灭活检验

取灭活后的原菌液，直接在哥伦比亚血平板涂布100μl，37℃观察3天，应无菌生长。

4关于成品检验质量标准

4.1安全检验标准

为了保证疫苗的安全性，本发明对实验室制备的3批疫苗先后进行了“对小白鼠的安全性试验”、“对无腺疫症状驴单剂量接种”接种的安全性试验。试验结果表明：各免疫动物单剂量接种、单剂量重复接种、驴状态均良好，体温、采食饮水正常，个别驴出现1-3天食欲下降或不采食情况，个别驴免疫部位出现肿胀情况，15天内逐渐消失。以上试验均证明疫苗是安全的。

4.2效力检验标准的制定

4.2.1小鼠最小免疫剂量和最小使用剂量试验

将安全性试验合格的3批灭活疫苗，按照不同剂量106CFU/0.2ml、107CFU/0.2ml、108CFU/0.2ml分别免疫6月龄balb/C小鼠8只，19天进行攻活菌5MLD剂量，结果显示，三组小鼠保护效果均为100％，未免疫对照组，100％死亡。106CFU/0.2ml可以使小鼠抵抗5MLD的致死剂量，符合制定标准，对照组，7日内应全部死亡，免疫组15天内，死亡不超过2只。小鼠免疫保护效果使用剂量确定为107CFU/0.2ml。

4.2.2最低免疫剂量下，最高攻毒剂量的确定

在最低免疫剂量下各免疫8只，19天后，各攻C77-1强毒5、10、15、20MLD，对照组攻5MLD，观察15天。对照组7天内100％死亡，免疫组小鼠15天死亡只数分别为0、1、1、1。死亡均不超过2只，符合要求。

5免疫程序的确定

根据驴腺疫的发病特点，以及以往报道，一般出生2月龄免疫注射。灭活疫苗一般1年4次，每隔4个月免疫一次。

6疫苗的保存期

本发明对实验室制备的灭活疫苗保存期在小鼠上进行了试验研究，将批疫苗在2～8℃条件下保存2、6、8个月，在各个时间段分别取样对其性状、安全性及免疫效力(以最小免疫剂量免疫)检测。结果显示，疫苗在2～8℃条件下保存6个月性状不发生明显变化，无菌检验和安全性都符合质量标准的要求。最低免疫剂量下，攻5MLD活菌株，死亡均不超过2只，对照组7天内100％死亡。考虑到疫苗在运输和使用过程中造成的效价损耗，本发明将疫苗的保存期暂定为2～8℃条件下暂定保存6个月。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。