苯吡唑酰胺类化合物的抗骨质疏松的应用

本发明属于生物制药技术领域，具体而言，涉及一种苯吡唑酰胺类化合物的抗骨质疏松的应用。

骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织的微细结构破坏为特征，能导致骨的脆性和骨折危险性增加的一种疾病[1]。骨质疏松症最重要的并发症是骨折，其中最严重的是髋骨骨折[2]，髋骨骨折女性多于男性，且发生率随年龄增加而呈指数级上升[3,4]。从全世界范围来看，白人妇女一生发生髋骨骨折的危险性是15.6％～17.5％，白人男性是5.2％～6.0％[3,5]。估计50岁以上黑人妇女的髋骨骨折发生率是5.6％，黑人男性则为2.8％[3]。据英国皇家医学院总结的情况，髋骨骨折患者在围术期及术后的死亡率很高，只有少数老年患者能恢复到以前的活动状态[6]。Chrischilles等[7]估计大约10％髋骨骨折的妇女直接因骨折原因日常生活不能自理，19％需要长期在护理中心照料。许多其他国家的情况也类似[8,9]。在我国，据流行病学不完全调查显示，60岁以上汉族人骨质疏松患病率为12.5％，其中髋部骨折为16％～20％，年患病人数达180万～200万[10]。随着我国步入老龄化社会，骨质疏松症已日益成为一个严重的社会问题，不但给患者造成了严重的身心摧残，同时也给家庭和社会增加了巨大的人力及财力负担[11]。因此，防治骨质疏松是抗衰老、延长寿命，保证人民生活质量的一个十分迫切的研究课题[12]。

骨质疏松症的发病因素有很多，但都可归结为骨重构失衡的结果，旧骨的吸收和新骨的形成之间达到动态平衡的过程就称为骨的重构。骨的重构与两种骨功能细胞有关，即成骨细胞和破骨细胞，成骨细胞负责骨的形成，破骨细胞负责骨的吸收。两种细胞在骨表面同一部位相继进行活动，即破骨细胞首先吸附在骨表面，吸收少量骨形成凹陷，再由成骨细胞进入凹陷形成新骨，随后发生骨基质的矿化完成一次骨的重构。成骨细胞和破骨细胞功能的平衡决定了骨重构的平衡，如果破骨细胞的骨吸收功能强于成骨细胞的骨形成功能，则破骨细胞吸收旧骨形成的凹陷就不能被新骨填满，新骨生成量少于旧骨被吸收的量，导致骨总量的丢失，引起骨质疏松症的发生[13,14]。

1997年，W.S.Simoent等研究人员在对取自大鼠胚胎肠组织的cDNA进行测序时发现了一个疑似肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族新成员的基因，该基因编码一个401个氨基酸的多肽，是一个分泌性的糖蛋白。进一步研究发现，过量表达这种蛋白的小鼠表现为不致命的骨硬化症，重组的这种蛋白能以剂量依赖的方式阻断体外培养的破骨细胞前体向破骨细胞分化的过程，重组的该蛋白还能够阻止卵巢去势大鼠的骨流失，基于该蛋白的以上特性，研究人员将其命名为骨保护素(osteoprotegerin)，简称OPG，OPG的一系列特性表明它可能对骨质疏松症发挥作用[15]。

随后，科研人员又发现了OPG的配体，命名为OPGL，它是一个TNF相关细胞因子，能够特异性与破骨细胞前体结合，激活破骨细胞分化的基因，OPGL还能够直接诱导体外培养破骨细胞的成熟，对正常的成年小鼠短期注射重组OPGL就能导致破骨细胞被激活并伴有全身性高钙血症。以上数据说明OPGL是一个破骨细胞分化与激活因子。而OPGL的上述功能能够被OPG所阻断，提示OPG和OPGL有可能是胞外调控破骨细胞分化的关键因子[16]。Hailing Hsu等[17]在分析破骨细胞前体细胞的cDNA文库时发现了一个能够介导OPGL诱导的破骨细胞分化过程的受体，通过比对，发现该受体就是TNFR家族成员RANK，该基因在体外分离的破骨细胞及体内成熟破骨细胞中高表达，重组OPGL能够特异性地结合RANK，该研究最终发现OPGL对破骨细胞分化的激活是直接由破骨细胞表面上的RANK所介导的。鉴于OPGL同时也是RANK的配体，且其作为 配体与RANK结合能够激活破骨细胞的分化，因此，也将OPGL称为RANK Ligand，即RANKL[18]。

Wong BR[19]等和Ishida N[20]等的研究成果表明，成骨细胞表达的细胞因子RANKL介导破骨细胞分化的具体途径是：首先RANKL与破骨细胞前体表面的RANK相结合，激活了膜接头蛋白肿瘤坏死因子相关因子(TRAFs)信号，导致MAPK的表达上调与激活，再反式激活NFATc1等破骨细胞特异性转录因子，启动破骨细胞分化相关基因的表达，最终导致破骨细胞的分化与成熟。在这个过程中，OPG作为RANKL的诱饵受体，当其与RANKL相结合时，就竞争性抑制了RANKL与RANK的结合，也因此抑制了破骨细胞分化的途径[21]。因此，骨微环境中OPG与RANKL的比值是调控破骨细胞分化程度的决定性因素，上调这一比值，将抑制破骨细胞的分化过程，从而降低骨吸收的程度，达到改善骨质疏松的效果。

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本发明首先涉及一种基于报告基因技术建立的，可以通过OPG表达量和OPG/RANKL表达量的比值进行高通量抗骨质疏松药物筛选的细胞模型。所述细胞为U-2OS-UORP，分类命名为人骨肉瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.10408，保藏日期2015年3月13日。

该细胞的构建方法如下：

(1)利用双荧光素酶报告基因技术，将OPG的启动子及RANKL启动子分别克隆至pGL4.17和pGL4.76报告基因载体的萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶表达序列的上游，构建出报告质粒pGL4.17-OPGp及pGL4.76-RANKLp；

(2)将pGL4.17-OPGp转染人成骨肉瘤U-2OS细胞，在G418的选择压力下得到了稳定转染的OPG表达上调剂筛选模型单克隆细胞系UOP；

(3)将pGL4.76-RANKLp转染UOP细胞，在G418和潮霉素的双重选择压力下得到稳定转染的OPG/RANKL比值表达调节剂筛选模型单克隆细胞系UORP；

(4)利用信号/背景比值(S/B)、信号/噪音比值(S/N)、信号本底变异系数(CV)和筛选窗相关系数(Z’因子)四个指标对UOP和UORP模型进行评价，选取评价结果满足高通量筛选的要求的细胞株。

进一步的，本发明还涉及一种筛选具有抗骨质疏松活性的化合物的方法，所述方法为，

(1)构建高表达受OPG启动子调控的萤火虫荧光素酶的模型细胞，在此基础上构建同时高表达受OPG启动子调控的萤火虫荧光素酶和受RANKL启动子调控的海肾荧光素酶的模型细胞；

(2)验证待筛选化合物对所述模型细胞的萤火虫荧光素酶表达的调节效果，或验证待筛选化合物同时对所述模型细胞中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达的调节效果；若待筛选化合物能够上调所述模型细胞的萤火虫荧光素酶表达水平，或待筛选化合物能够上调所述宿主细胞中萤火虫、海肾两种荧光素酶表达水平的比值，则表明该化合物为具有潜在抗骨质疏松活性的化合物。

优选的，所述的宿主细胞为UOP和UORP，最优选的，所述宿主细胞为U-2OS-UORP。

本发明还涉及通过所述的方法筛选获得的化合物，所述化合物具有如下通式结构：

优选的，所述化合物为化合物1-7，其结构见表1。

表1 化合物1-7的结构

本发明还涉及通过所述的筛选方法筛选获得的化合物1-7在制备用于细胞学研究的制剂或药物中的应 用，所述的应用基于所述化合物在调节OPG蛋白表达量的功能，所述的应用为：

(1)制备上调OPG蛋白表达量的调节剂的应用；

(2)制备上调骨形态形成蛋白-2(BMP-2)蛋白表达水平的调节剂的应用；

(3)制备骨吸收抑制剂的应用；

(4)制备促进成骨细胞分化的制剂的应用；

(5)制备抑制破骨细胞分化的制剂的应用；

(6)制备抗骨质疏松的药物的应用。

本发明还涉及通过所述的筛选方法筛选获得的化合物4、6、7在制备用于细胞学研究的制剂或药物中的应用，所述的应用基于所述化合物在调节OPG蛋白与RANKL蛋白表达量的比值的功能，所述的应用为：

(1)制备上调OPG蛋白与RANKL蛋白表达量的比值的调节剂的应用；

(2)制备上调骨形态形成蛋白-2(BMP-2)蛋白表达水平的调节剂的应用；

(3)制备骨吸收抑制剂的应用；

(4)制备促进成骨细胞分化的制剂的应用；

(5)制备抑制破骨细胞分化的制剂的应用；

(6)制备抗骨质疏松的药物的应用。

本发明还涉及基于化合物A(1-(2-氟苯基)-N-(6-甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-咪唑羧酰胺，结构见式1)对于OPG蛋白表达量的上调的功能，或对于OPG蛋白/RANKL蛋白的表达量的比值的上调的功能的如下应用：

(1)制备上调OPG蛋白表达量或上调OPG蛋白与RANKL蛋白表达量的比值的调节剂的应用；

(2)制备上调骨形态形成蛋白-2(BMP-2)蛋白表达水平的调节剂的应用；

(3)制备骨吸收抑制剂的应用；

(4)制备促进成骨细胞分化的制剂的应用；

(5)制备抑制破骨细胞分化的制剂的应用；

(6)制备抗骨质疏松的药物的应用。

式1：化合物1-(2-氟苯基)-N-(6-甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-咪唑羧酰胺的结构

化合物A的上述应用中，

化合物A以3.75nM到250nM的浓度上调OPG蛋白的表达量以及OPG蛋白与RANKL蛋白表达量的比值；

或，化合物A以0.01μM到10μM的浓度上调BMP-2蛋白表达量；

或，化合物A以1到10μM的浓度促进成骨细胞的体外分化；

或，化合物A以15nM到1000nM的浓度抑制破骨细胞的体外分化。

图1利用染料木素进行的UOP模型细胞的Z’因子试验结果

图2利用TGF-β1进行的UORP模型细胞的Z’因子试验结果

图3化合物1-(2-氟苯基)-N-(6-甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-咪唑羧酰胺(化合物A)在OPG表达上调剂筛选模型(UOP)上的量效关系

图4化合物A在OPG/RANKL比值表达调节筛选模型(UORP)上的量效关系 

图5化合物A对U-2OS细胞胞内OPG/RANKL蛋白表达水平的影响

图6化合物A对Saos-2细胞胞内OPG/RANKL蛋白表达水平的影响

图7化合物A对MC3T3-E1细胞胞内OPG/RANKL蛋白表达水平的影响

图8化合物A对U-2OS细胞OPG蛋白分泌水平的影响

图9化合物A对Saos-2细胞BMP-2蛋白表达水平的影响

图10化合物A对MC3T3-E1(Subclone 14)细胞体外成骨分化的影响(钙化结节茜素红染)

图11经化合物A处理后的MC3T3-E1细胞条件培养基对Raw264.7细胞MMP-9及NFATc1表达水平的影响(CM-条件培养基，R-RANKL)

图12经化合物A处理后的MC3T3-E1细胞条件培养基对Raw264.7细胞体外破骨分化的影响(耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染)

图13化合物A结构类似物1～7对UOP模型细胞荧光素酶表达活性的影响

图14化合物A结构类似物4、6、7对UORP模型细胞荧光素酶表达活性的影响

实施例1.利用染料木素作为阳性化合物对UOP模型各项高通量筛选适用性指标进行评价

(1)荧光素酶表达活性的测定

采用Promega公司的Luciferase Assay System报告基因检测系统，利用Perkin Elmer公司的EnVision2104-0010型多功能读板仪测定荧光素酶表达活性。

(2)高通量筛选适用性指标的测定

消化对数生长期的UOP细胞，以50,000个/孔接种96孔板中的60孔，其中30个孔加入含有0.1％DMSO的无血清McCoy’s 5A培养基作为空白对照，其余30个孔的培养基中加入6.25μM的染料木素作为阳性对照，其余孔不接种细胞只加入相应量培养基作为背景对照。24小时后用CCLR细胞裂解液裂解细胞，按Luciferase Assay System报告基因检测系统说明书所述方法检测荧光素酶表达活性，按如下公式：

S/B＝信号平均值/背景平均值； 

S/N＝(信号平均值-背景平均值)/背景SD；

CV％＝标准偏差SD/信号平均值×100；

Z’＝1-(3×阳性对照SD+3×阴性对照SD)/(阳性对照平均值-阴性对照平均值)

计算各项指标，将计算结果与高通量筛选要求值进行比较，以确定模型是否适用于高通量筛选。

对由上述方法构建的合格的UOP细胞模型各项指标评价结果见附表1，Z’因子试验结果见附图1。

表1

实施例2利用TGF-β作为阳性对照对UORP模型各项高通量筛选适用性指标进行评价

(1)荧光素酶表达活性的测定

采用Promega公司的Reporter Assay System双报告基因检测系统，利用Perkin Elmer公司的EnVision 2104-0010型多功能读板仪测定荧光素酶表达活性。

(2)高通量筛选适用性指标的测定

消化对数生长期的UORP细胞，以50,000个/孔接种96孔板中的60孔，其中30个孔加入含有0.1％DMSO的无血清McCoy’s 5A培养基作为空白对照，其余30个孔的培养基中加入10nM的TGF-β作为阳性对照，其余孔不接种细胞只加入相应量培养基作为背景对照。24小时后用CCLR细胞裂解液裂解细胞，按 Reporter Assay System双报告基因检测系统说明书所述方法检测荧光素酶表达活性，按如下公式：

S/B＝信号平均值/背景平均值； 

S/N＝(信号平均值-背景平均值)/背景SD；

CV％＝标准偏差SD/信号平均值×100；

Z’＝1-(3×阳性对照SD+3×阴性对照SD)/(阳性对照平均值-阴性对照平均值)

计算各项指标，将计算结果与高通量筛选要求值进行比较，以确定模型是否适用于高通量筛选。

对U-2OS-UORP各项指标评价结果见附表2，Z’因子试验结果见附图2。

表2

实施例3化合物A(1-(2-氟苯基)-N-(6-甲基吡啶-2-基)-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-咪唑羧酰胺)在OPG表达上调剂筛选模型(UOP或U-2OS-UORP)上量效关系的测定

取对数生长期的UOP细胞，按5×104个/孔/100μL的密度接种96孔板。待细胞生长至70％～90％汇合时，移去原有培养基，用PBS轻轻漂洗细胞一次，以除去血清中各种活性因子的干扰。用无血清McCoy’s 5A培养基将化合物A从100μM(终浓度)开始，2倍逐级稀释至0.0001μM(后三个浓度为10倍稀释)，按150μL/孔加入细胞中，每个浓度均设立三个复孔，同时设立无化合物的培养基作为空白对照。37℃，5％CO2条件下培养18～24h后，用CCLR细胞裂解液裂解细胞并检测萤火虫荧光素酶表达活性。

按如下公式计算化合物在各个浓度下的荧光素酶表达活性调节率：

分析化合物A浓度与调节率之间的量效关系，利用GraphPad Prism 5.0软件做出量效关系曲线，并得出化合物作用的半数有效浓度(EC50)。

化合物A以剂量依赖的方式上调UOP细胞的荧光素酶表达活性，当其浓度为0.75μM时，达到最高上调倍数2.20倍，且在从0.05μM到6.25μM的区间内上调倍数均在2倍以上，其EC50为0.004μM(见图3)

实施例4化合物A在OPG/RANKL表达调节筛选模型(U-2OS-UORP)上量效关系的测定

取对数生长期的U-2OS-UORP细胞，按5×104个/孔/100μL的密度接种96孔板。待细胞生长至70％～90％汇合时，移去原有培养基，用PBS轻轻漂洗细胞一次，以除去血清中各种活性因子的干扰。用无血清McCoy’s5A培养基将化合物A从100μM(终浓度)开始，2倍逐级稀释至0.0001μM(后三个浓度为10倍稀释)，按150μL/孔加入细胞中，每个浓度均设立三个复孔，同时设立无化合物的培养基作为空白对照。37℃，5％CO2条件下培养18～24h后，用CCLR细胞裂解液裂解细胞并检测萤火虫荧光素酶表达活性。

按如下公式计算化合物在各个浓度下的荧光素酶表达活性调节率：

分析化合物浓度与调节率之间的量效关系，利用GraphPad Prism 5.0软件做出量效关系曲线，并得出化合物作用的半数有效浓度(EC50)。

化合物以剂量依赖的方式上调U-2OS-UORP细胞的荧光素酶表达活性，当其浓度为0.25μM时，达到最高上调倍数1.53倍，其EC50值为0.012μM。(见图4)

实施例5化合物A对U-2OS、Saos-2和MC3T3-E1三种细胞OPG/RANKL蛋白表达水平影响的测定

(1)蛋白样品的制备

U-2OS细胞以4×105个/孔(Saos-2和MC3T3-E1细胞为105个/孔)接种至6孔板，37℃，5％CO2条件下培养至汇合度70％～80％；用PBS漂洗细胞，加入用无血清培养基稀释成一定浓度的化合物，同时设立空白对照孔，其中加入与含化合物孔相同终浓度的DMSO，37℃，5％CO2条件下培养24h；将细胞培养上清收集到指定管中，1,000×g，离心15min，将上清液收集在指定管中，以备ELISA实验之用；用预冷的PBS漂洗细胞，胰酶消化细胞，加入一定量的含血清培养基终止消化并收集细胞至Ep管中；900rpm，离心4min收集细胞，再用PBS洗涤细胞沉淀，900rpm，离心4min再次收集细胞；向每管细胞沉淀中加入60μL左右的RIPA细胞裂解液(其中已加入100μg.mL-1的PMSF)，于冰上裂解细胞30min；12,000×g，4℃离心20min；收集上清，用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)测定总蛋白浓度；根据测定的总蛋白浓度，用ddH2O将各管样品调整成相同浓度，加入一定量的5×蛋白样品缓冲液；将蛋白样品置于沸水浴中10min充分变性，冷却后短暂离心，混匀后即可进行蛋白电泳，剩余样品于-80℃保存。

(2)Western blot

根据《分子克隆实验指南》所述方法配制12％变性聚丙烯酰胺凝胶，将上述制备的蛋白样品按每个样品30μg的量加入上样孔中，以浓缩胶8v/cm，分离胶12v/cm的电压进行电泳，当溴酚蓝前沿到达凝胶下边缘时，停止电泳。

将电泳后的凝胶从板上取下，切除浓缩胶和溴酚蓝前沿部分，与事先准备好的两张Western-blot专用的Bio-Rad滤纸一同浸泡在1×电转移缓冲液中平衡5min；取裁成适当大小的PVDF膜，先在甲醇中浸泡30s，再用蒸馏水漂洗1min，置于1×电转移缓冲液中平衡2min；在Bio-Rad半干式转膜仪的正极上涂上少量电转移缓冲液，在涂过的位置上放置一张平衡好的滤纸，在滤纸上小心放一张平衡好的PVDF膜，在膜上放置凝胶，凝胶上放置另一张滤纸，用一根小试管在整个叠层上方小心滚过，以除去气泡，在转膜仪负极的滤纸相应位置上也涂上少量电转移缓冲液，小心将负极盖在叠层上并锁紧；按5mA/cm2设定电流，恒流转膜30～60min。

转膜结束后，取出PVDF膜，记好点样方位，放入丽春红染液中，室温染5min，用蒸馏水漂洗膜至蛋白条带清晰可见，用铅笔标注所关注的蛋白条带位置，继续将膜在蒸馏水中漂洗，直至红完全褪去；将PVDF膜置于1×TBST缓冲液中漂洗1min，再置于甲醇中30s，用镊子小心将膜夹起，挥干甲醇，根据预染Marker和丽春红染所标注位置的指示，根据目的条带的大小将膜裁开，再放入甲醇浸润1min，最后再次放入1×TBST缓冲液中漂洗1min；用1×TBST缓冲液配制5％(w/v)的脱脂牛奶，作为封闭液，将膜放入封闭液，室温轻摇孵育1～2h；向杂交槽中加入适量新鲜封闭液，按一定比例加入一抗[目的蛋白为兔抗OPG多克隆抗体(Abcam)，兔抗RANKL单克隆抗体(Epitomic)，内参蛋白为兔抗GAPDH单克隆抗体(中杉金桥)]，摇匀，将封闭后的PVDF膜条放入相应的杂交槽中，室温轻摇孵育1～2h，转移至4℃冰箱孵育过夜；从杂交槽中取出膜条，用1×TBST漂洗三次，每次10min；向杂交槽中加入适量新鲜封闭液，按一定比例加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，摇匀，根据一抗的种属来源将漂洗后的膜条放入相应的杂交槽中，室温轻摇孵育1～2h；)从杂交槽中取出膜条，用1×TBST漂洗三次，每次10min；按底物与缓冲液之比为1:1的比例配制增强型HRP底物化学发光液(ECL)(现用现配)；将漂洗后的膜条上的残余液体用吸水纸吸干，向膜上均匀滴加发光液，立即放入凝胶成像仪中曝光显；将显结果(条带)用光密度扫描软件Quantity One进行扫描分析，并用相应的内参条带进行标准化处理，从而定量分析蛋白表达情况的变化。

结果表明，化合物A均能以剂量依赖的方式提高U-2OS、Saos-2和MC3T3-E1三种细胞内OPG蛋白表达水平及OPG与RANKL的比值。(见图5～7)

实施例6化合物A对U-2OS细胞OPG蛋白分泌水平的影响的测定

采用人OPG ELISA试剂盒测定U-2OS细胞培养上清中OPG蛋白表达量的变化，由于该ELISA试剂盒灵敏度较高，最低可检测低于1pg.mL^-1的OPG蛋白，因此需将细胞培养上清样品稀释再做测定，经多次预实验验证，将样品稀释400倍再进行ELISA试验效果最好。具体步骤如下：

(1)使用前将所有试剂和样品置于室温(18-25℃)，按照说明书配制1×样品稀释液及1×洗板液。

(2)用样品稀释液将标准品稀释成8个浓度梯度，分别为0pg.mL-1，1.23pg.mL-1，3.70pg.mL-1，11.11pg.mL-1，33.33pg.mL-1，100pg.mL-1，300pg.mL-1，900pg.mL-1。

(3)用样品稀释液将检测抗体及抗生蛋白链菌素稀释至工作浓度。

(4)用样品稀释液将化合物处理24h和48h的细胞培养上清样品稀释400倍。

(5)向待测孔中加入100μL标准品或样品，每个标准品或样品平行做两个复孔，盖上板盖，在室温中轻摇孵育2.5h或4℃过夜。

(6)弃去孔中液体，向每孔中加入300μL Wash Buffer清洗4次。注意每次洗完都要将孔中液体除净，最后一次洗完后，将残余液体除净并倒扣在干净的吸水纸上使残余液体流干。

(7)向每孔中加入100μL 1×生物素化的抗体，室温轻摇孵育1h。

(8)弃去孔中液体，按步骤3再次洗板。 

(9)向每孔中加入100μL稀释好的HRP偶联抗生蛋白链菌素溶液。室温轻摇孵育45min。

(10)弃去孔中液体，按步骤3再次洗板。 

(11)向每孔中加入100μL TMB一步底物试剂。避光，室温轻摇孵育30min。

(12)向每孔中加入50μL终止液。立即读取450nm的光吸收值。

(13)以标准品的蛋白浓度(pg.mL-1)为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，并依标准曲线计算待测样品中OPG蛋白的浓度。

结果表明，化合物A能够明显促进U-2OS细胞的OPG分泌水平。(见图8)

实施例7化合物A对Saos-2细胞BMP-2蛋白表达水平影响的测定

本实施例依然采用Western-blot方法，除一抗采用小鼠抗β-Actin单克隆抗体(Sigma)外，其余方法步骤与实施例5相同。

结果表明，化合物A能够提高Saos-2细胞中BMP-2的表达水平。(见图9)

实施例8化合物A对MC3T3-E1(Subclone 14)细胞体外成骨分化的影响的测定

MC3T3-E1细胞是从小鼠颅骨组织中分离出的成骨细胞前体细胞，其亚克隆14(Subcoloe 14)可在体外分化为成骨细胞[16]，是一种在体外研究成骨细胞分化常用的模型。为验证化合物是否具有体外促成骨分化的能力，我们利用β-甘油磷酸及L-抗坏血酸诱导MC3T3-E1(Subclone 14)细胞向成骨细胞分化，用化合物A干预诱导过程，21d后进行茜素红染，结果如图10所示，诱导21d后，MC3T3-E1(Subclone 14)细胞形成了钙化结节，经1μM和10μM化合物A干预后，钙化的面积较未干预组明显增大，且10μM干预后效果更为明显。

实施例9经化合物A处理后的MC3T3-E1细胞条件培养基对Raw264.7细胞MMP-9及NFATc1表达水平的影响的测定

为了证明化合物A对成骨样细胞的一系列作用最终能否影响到破骨细胞的分化，我们参考文献[17]的方法，设计了如下实验：首先用成骨细胞分化培养基诱导MC3T3-E1(Subclone 14)细胞向成骨细胞分化，3d后向培养基中加入0nM、15nM、62.5nM、250nM和1000nM的化合物，持续作用细胞6d，收集细胞培养上清，作为条件培养基(Condition Medium,CM)。在另一细胞培养板中培养Raw264.7细胞，用30ng.mL-1的重组小鼠sRANKL诱导3d，上述条件培养基与破骨细胞诱导培养基以1:1比例混合，加入Raw264.7细胞中，3d后收集细胞，用Western-blot检测细胞内破骨细胞分化标志物基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及破骨细胞特异性转录因子——活化T细胞核因子c1(NFATc1)的表达水平Western-blot结果如图11所示，与只用30ng.mL-1RANKL处理组和未加化合物的条件培养基处理组相比，经含250nM和1000nM化合物A的条件培养基处理的细胞中MMP-9和NFATc1的表达水平均明显降低，说明这两个浓度的化合物A在体外能够通过调节成骨细胞OPG的表达降低破骨细胞的分化程度，而此过程有可能是通过下调NFATc1实现的。

实施例10经化合物A处理后的MC3T3-E1细胞条件培养基对Raw264.7细胞体外破骨分化影响的测定

前述实验已经证明，化合物可以上调MC3T3-E1细胞中OPG的表达及分泌水平，且能够上调OPG/RANKL的比值，同时，经化合物处理后的MC3T3-E1细胞条件培养基能够降低Raw264.7细胞破骨分化指标MMP-9和NFATc1的表达水平，为测定该化合物能否真正抑制破骨细胞的分化，我们用0nM、15nM、62.5nM、250nM和1000nM的化合物A刺激已经成骨诱导3d的MC3T3-E1(Subclone 14)细胞，6d后收集条件培养基(CM)，按1：1比例与破骨分化培养基(含100ng/mL RANKL)混合，3d后对细胞进行耐酒石酸酸性磷酸酶染(TRAP，Sigma387A)，结果如图12所示，添加无化合物CM组出现了成熟的多核破骨细胞，添加化合物的CM以剂量依赖减少了成熟破骨细胞的数量，在1000nM CM组，已没有成熟多核破骨细胞出现，该结果进一步说明了该化合物具有体外抑制破骨分化的作用。

实施例11化合物1-7对OPG表达上调剂筛选模型(UOP或U-2OS-UORP)荧光素酶表达活性的影响

依实施例3所述方法，分别用0,1.25,2.5,5,10μg/mL的化合物1-7作用于UOP或U-2OS-UORP模型细胞，计算各化合物在各浓度下的调节率，做出相应的统计图(见图13)。

结果表明，在0-10μg/mL的浓度范围内，化合物1-7均能够明显上调UOP或U-2OS-UORP细胞荧光素酶的表达活性，其中化合物1、2、3、7的最高调节率出现在5-10μg/mL，化合物4、6在2.5-10μg/mL间均保持最高上调率，化合物5的最高上调率出现在1.25-2.5μg/mL。

实施例12化合物4、6、7对OPG/RANKL表达调节筛选模型(U-2OS-UORP)萤火虫和海肾荧光素酶表达活性比值的影响

依实施例4所述方法，分别用0-25μM的化合物4、6、7作用于U-2OS-UORP模型细胞，计算各化合物在各浓度下的调节率，做出相应的统计图(见图14)。

结果表明，在0-25μM的浓度范围内，化合物4、6、7均能明显上调U-2OS-UORP细胞萤火虫/海肾两种荧光素酶表达活性的比值，三个化合物的最高上调率均出现在6.25-12.5μM。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，而不用于对本发明保护范围的限制。