具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用

本发明涉及一种单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。特别涉及一种具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。本发明属于生物技术领域。

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是养猪业中引发仔猪腹泻、消瘦、脱水的重要病原体之一，给养猪业带来重大经济损失。研究表明，PEDV有两个基因亚型，即G1和G2亚型。2010年之前，PEDV流行毒株以G1亚型为主，2010年之后，PEDV流行毒株以G2亚型为主。基因序列分析表明，PEDV G1和G2亚型的主要差异在S基因上。G1亚型毒株S基因由4152nt构成，编码1383个氨基酸，而G2的S基因为4161nt构成，编码1386个氨基酸，在基因长度上增加了9个碱基。基因内部也存在较大差异。PEDV基因组中最大的变异位于S基因，而S基因中的突变主要集中在N末端。NPL-PEDV/2013/P10与NPL-PEDV/2013相比，ORF1a/b蛋白、核蛋白、NS3B、膜蛋白以及囊膜蛋白在氨基酸水平上完全一致。而在纤突蛋白(S)中含有六个核苷酸多态性，导致氨基酸位点变化：F375L、T486P、D856E、A1081V、A1099S以及Y1253D。在S1区域有2个氨基酸变异，在S2区域有4个氨基酸变异(Lawrence et al.,2014)。冠状病毒S蛋白能够诱导中和性抗体的产生，S基因变异必然会导致S蛋白诱导产生的中和性抗体在中和病毒方面上存在差异。

因此，获得一株具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，对于猪流行性腹泻病毒的防治具有重要意义。

本发明的目的在提供一种具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明以纯化的猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株LNCT2的病毒粒子为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得1株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5F7。经鉴定，该杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体效价分别为1：1000和1:100000。5F7单抗亚类为IgG2a，轻链为κ型。IFA(间接免疫荧光检测)检测发现，5F7单抗与病毒发生反应；Westernblot结果显示，5F7单抗与PEDV粒子、S蛋白均发生反应；上述两种结果表明该单抗的抗原表位为线性表位，抗原表位位于S蛋白的1261aa～1386aa之间。PEDV S蛋白根据结构和功能可分为S1和S2两个区域，其中S1区域含有病毒入侵细胞的受体结合区域，该区域也是诱导机体产生中和性抗体的关键区域；S2区域的主要功能为介导病毒与细胞发生膜融合。经抗原表位鉴定发现，5F7抗体的抗原表位位于S2区域。该抗体是首个针对PEDV S2区域的中和性抗体，具有广谱性。病毒中和实验也表明，该单抗能够有效中和PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms等G2基因亚型毒株，使其失去感染细胞的能力，也能够中和CV777毒株(G1基因亚型)。鉴于该单抗的生物学特性，该单抗具有广谱性中和PEDV毒株的能力，该抗体可用于建立一系列阻断ELISA、捕获ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条等诊断方法，具备广阔的应用价值和研究价值。

本发明的一株稳定分泌抗猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic DiarrheaVirus,PEDV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5F7，分类命名为小鼠抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体细胞株，所述的杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.13840，保藏时间是2017年4月24日。

进一步的，本发明还提出了一株具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，其是由本发明以上所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

更进一步的，本发明还提出了所述的单克隆抗体在制备检测猪流行性腹泻病毒试剂中的应用。

其中，优选的，所述的猪流行性腹泻病毒包括G1和G2亚型的猪流行性腹泻病毒。

其中，优选的，所述的试剂包括用于阻断ELISA、捕获ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条检测猪流行性腹泻病毒的试剂。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明首次提出了一种针对PEDV S2区域的中和性单克隆抗体，该单克隆抗体具有广谱性，能够有效中和PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms等G2基因亚型毒株，使其失去感染细胞的能力，也能够中和CV777毒株(G1基因亚型)。鉴于该单克隆抗体的生物学特性以及所具有的广谱性中和PEDV毒株的能力，该单克隆抗体可用于建立一系列包括阻断ELISA、捕获ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条等方法在内的PEDV诊断方法，具备广阔的应用价值和研究价值。

图1为5F7抗体抗原表位鉴定示意图；

图2为电镜观察PEDV病毒粒子；

图3为IFA检测5F7单抗与PEDV反应；

其中，LNCT2为5F7单抗与接种LNCT2毒株的细胞发生反应；CV777为5F7单抗与接种CV777毒株的细胞发生反应；E6为5F7单抗与健康细胞反应结果，图中的标尺为400nm；

图4为Western-blot验证5F7单抗与PEDV蛋白组分的反应情况；

其中，1：PEDV-LNCT2 S蛋白；2：PEDV-LNCT2；3：PEDV-CV777；4：Vero-E6细胞；

图5为5F7单抗与病毒中和实验测定；

图6为单抗的抗原表位鉴定；

其中，1图为转染表达S蛋白中第1261aa至1386aa的真核表达质粒转染的细胞与5F7单抗的反应结果；2图为健康Vero E6细胞与5F7单抗的反应结果，图中的标尺为200nm。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体的筛选及鉴定

1材料与方法

1.1细胞、试验动物、抗体和试剂

SP2/0和Vero-E6细胞系由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪消化道传染病创新团队保存；RPMI1640培养液(Gibco)；HAT和HT培养基、PEG(MW4000)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；Balb/c小鼠由本所实验动物中心代为购买。

1.2PEDV的培养和纯化

1.2.1PEDV-LNCT2毒株的培养

Vero-E6细胞长满形成单层后，弃去营养液，用PBS(磷酸盐缓冲溶液，pH7.2)洗涤三遍，接种PEDV-LNCT2毒株。病毒接种剂量按照5％浓度接种，接种病毒同时添加胰酶，胰酶的终浓度为10μg/ml。观察细胞病变，待80％～90％细胞出现病变时，将病毒冻存至-20冰箱，收毒，备用。

1.2.2PEDV的纯化

PEDV-LNCT2病毒液经5000g离心5min去除细胞碎片后，用超速离心机100000g离心2h，弃去上清液，收集沉淀。沉淀用蔗糖梯度密度离心纯化，共设置5个蔗糖浓度，20％、30％、40％、50％和60％。超速离心机SW32转子100000g离心2h后，收集50％～60％蔗糖层之间的样品，样品经SW32转子100000g离心2h进行脱糖处理，弃去上清液收集沉淀。沉淀即为纯化的病毒粒子。

1.3抗PEDV单克隆抗体的制备

1.3.1BALB/c小鼠的免疫

将纯化的PEDV-LNCT2病毒粒子与等量弗氏佐剂混合后腹腔接种6周龄BALB/c小鼠5只，每只接种抗原剂量为100μg。2周后注射同一剂量弗氏不完全佐剂处理的抗原。细胞融合前3d，用等量不加佐剂的抗原(每只200μg)腹腔注射加强免疫1次，即可进行细胞融合。

1.3.2单克隆抗体筛选方法的建立

按常规方法建立间接IFA法。Vero-E6细胞形成单层后，接种PEDV-LNCT2，24h后观察细胞病变，待50％细胞出现病变时用4％的多聚甲醛固定细胞，4℃获-20℃保存备用。小鼠阴性血清、阳性血清或以后待检的杂交瘤细胞作为检样，以Alexa Flur 488标记的山羊抗小鼠IgG(重链+轻链)作为二抗，反应45min后在倒置荧光显微镜下观察，记录有阳性细胞的细胞孔。

1.3.3细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的建立

免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5：1比例混合后加PEG融合，于96孔培养板中37℃、CO2培养箱中培养。当杂交瘤细胞的培养液开始变黄，或杂交瘤细胞长满至孔底面积的1/10时，吸取上清液，经IFA法筛选阳性杂交瘤细胞。用有限稀释法对阳性孔连续3次亚克隆，至所有单克隆孔均为阳性为止。将最终获得的单克隆扩大培养后建株，冻存。

1.3.4单抗腹水的制备及效价的测定

取8周龄BALB/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(每只0.5ml)，7d后将生长状态良好的杂交瘤细胞，以每只约5×105个腹腔注射BALB/c小鼠。7d左右小鼠腹部开始明显膨大，反复抽取腹水，以2000r/min离心10min除去细胞成分和其他沉淀，收集上清液。纯化后加入0.02％叠氮钠，分装，-70℃保存。将腹水用PBS递增稀释，以IFA测定单抗的效价。

1.3.5单抗的Western-blot分析

在非还原型SDS-PAGE方法下将接种PEDV-LNCT2毒株、CV777毒株的细胞培养物以及LNCT2 S蛋白用半干法转印至NC膜，NC膜经2％的脱脂乳封闭后，与1:10000单抗腹水作用2h，洗涤3次，加入1∶10000稀释的IRDye800标记的羊抗鼠IgG(ROCKLAND Co.)作用1h，洗涤3次，扫描成像。

1.3.6亚型鉴定单抗亚型鉴定

按照亚型鉴定试剂盒操作说明书对以上试验中得到的单克隆抗体进行亚型鉴定。

1.3.7阳性杂交瘤细胞株分泌单抗稳定性的测定

将冻存3个月的阳性杂交瘤细胞复苏，24孔细胞板培养，检测上清是否呈阳性来判定复苏的阳性细胞是否有分泌抗体的能力。将经过3次亚克隆的阳性率达100％的杂交瘤细胞进行体外连续传代培养3个月，每隔2周检测1次细胞上清液。

1.3.8单抗中和活性测定

单抗腹水经0.22μm滤膜过滤后用protein G纯化柱纯化。纯化后的抗体稀释至1mg/ml，随后用RPMI1640培养液2倍倍比稀释；PEDV-LNCT2、PEDV-CV777、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms四株病毒稀释至每100μL病毒液含200个TCID50，病毒液与抗体等体积混合，37℃反应1h，添加胰酶，胰酶的终浓度为10μg/ml，接种细胞，置于细胞培养箱5天，观察细胞病变情况。

1.3.9单抗的抗原表位鉴定

为鉴定5F7所识别的抗原表位，将PEDV S蛋白的表达基因按图1所示进行截短，并将截短基因插入pCDNA3.1载体中构建真核表达质粒，将构建成功的质粒转染293T细胞并用IFA进行验证。

2结果

2.1PEDV-LNCT2病毒粒子的纯化

经鉴定蔗糖梯度密度纯化后的病毒粒子主要集中在蔗糖的50％-60％层之间，样品经电镜观察结果见图2，可见完整的PEDV-LNCT2病毒粒子，用吸光光度计法测得其浓度为0.56mg/ml。

2.2抗PEDV单克隆抗体的制备

2.2.1单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以纯化的PEDV-LNCT2病毒粒子为免疫原免疫BALB/c鼠，融合的杂交瘤细胞经IFA筛选阳性克隆后对阳性孔进行3次亚克隆，获得1株稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为5F7，保藏编号为CGMCC No.13840。

2.2.2单抗的IFA分析

IFA检测发现，5F7单抗上清能够与接种PEDV-LNCT2和CV777毒株的细胞发生反应，与健康Vero-E6不反应，结果如图3所示。

2.2.3单抗的Western-blot分析

采用Western-blot试验验证该株单抗与PEDV反应情况，结果如图4所示，表明5F7单抗与PEDV-LNCT2毒株和CV777毒株以及LNCT2 S蛋白有特异性反应条带；与健康Vero-E6细胞不发生反应，表明5F7识别的靶蛋白为S蛋白。

2.2.4单抗腹水制备

采用8周龄BALB/c雌性鼠，先经腹腔注射灭菌石蜡油(0.5mL/只)，7d后腹腔注射杂交瘤细胞1×105个/只，待小鼠腹部膨大后抽取其腹水，3000r/min离心10min取上清。采用ELISA方法检测上清和腹水抗体效价。采用Mouse MonoAb-ID Kit(HRP)鉴定单抗亚类，操作按试剂盒说明书进行。

2.2.5单抗亚型鉴定

将本试验制备的单克隆抗体进行亚型鉴定。结果表明5F7单抗为IgG2a亚型，轻链为κ链。

2.2.6单抗效价测定

IFA检测5F7单抗细胞上清液和腹水的效价。结果表明:5F7单抗细胞上清液抗体效价高于1：1000，腹水抗体效价高于1：100000。

2.2.7融合细胞株分泌单抗的稳定性测定

将冻存细胞株复苏后于24孔培养板中培养，间接ELISA检测细胞上清液，结果OD405值仍很高。将细胞传代3个月，每隔2周检测1次上清液，结果显示OD405值稳定。

2.2.8单抗中和效价测定

如图5所示，PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY、PEDV-Hjms和PEDV-CV777毒株均能够被5F7单抗中和，5F7单抗在1：80倍稀释时能够完全中和PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY、PEDV-Hjms和PEDV-CV777四个毒株。

2.2.9单抗的抗原表位鉴定

经IFA鉴定，5F7单抗识别的表位位于1261aa～1386aa之间。结果如图1和图6所示。