一株热反硝化地芽孢杆菌CF-1及其用途

本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株热 反硝化地芽孢杆菌Geobacillusthermodenitrificans.CF-1菌株及其在微生物采油中 的应用。

当前，微生物采油技术在全球范围蓬勃发展，不断取得重大突破，成为石油 开发领域的研究热点。其中，高效的微生物采油菌种是各项微生物技术的基础和 关键，菌种性能的好坏直接影响到各项技术的应用效果。因此，获取高性能的采 油菌种是微生物采油的重要研究内容之一。微生物采油技术要求所用菌种最好能 够在油藏条件下利用原油为碳源生存，并产生对驱油有利的代谢产物，例如生物 表面活性剂、生物乳化剂、有机酸、醇以及溶剂和气体。

油藏是个高温、高压的极端环境，对采油菌种的要求很高。目前筛选得到的 采油菌种性能各异，很难同时具有优良的驱油性能和很好的油藏环境适应性，矿 场应用范围因此受到很大限制。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种热反硝化地芽孢杆菌 (Geobacillusthermodenitrificans)CF-1菌株和该菌在微生物采油中的应用。

本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CF-1菌 株，以下简称CF-1，于2015年4月8日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心”(北京市朝阳区北辰西路1号中国科学院微生物研究所)，其 保藏编号为“CGMCCNo.10697”，分类命名中文名称为“热反硝化地芽孢杆菌”， 拉丁文名称为“Geobacillusthermodenitrificans”。

本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697菌株，是从胜利 油田油水井样品中通过65℃、10MPa条件下以原油为碳源的富集培养和原油平板 产扩油圈法筛选得到，并通过耐温耐盐性能考察反复筛选传代获得。

热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的形态学特性：在好氧固体培 养基下培养3～5d出现大小一般为0.5～1.0mm纯白菌落，细胞形态为长杆状， 大小5-10μm×0.2-0.5μm。

热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的生理生化特性：好氧，生长 温度50～80℃，生长pH值范围4～9，最佳生长pH范围7～7.5，NaCl的耐受性 0～5％。

热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的营养培养基：蔗糖0.3％，蛋 白胨0.3％，K2HPO40.2％，pH值为7.0～7.5。

热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵条件：接种量1％，接种龄 12h，初始pH7.5，温度65℃，搅拌速度150rpm，pH＝7，通气量：1L/min。

热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的性能评价参数：以原油为唯 一碳源的生长能力、发酵液乳化能力、改变岩石润湿性能力、物理模拟实验提高 采收率值。

热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的性能评价方法：

(1)以原油为唯一碳源的生长能力评价

将热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697接种于以原油为唯一碳源的 烃类培养基中，65℃、160rpm下振荡培养3d，进行细菌密度测试。

(2)发酵液乳化能力测试

取一试管，加等体积的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液和 柴油后利用微型旋涡混合仪高速涡旋震荡2min后混匀，65℃下静置24h，分别测 定乳化层和总烷烃层的体积，相比即为乳化系数，用乳化系数表示其乳化能力的 大小。

(3)改变岩石润湿性能力评价

取亲油石英矿片分别放入热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵 液中，置摇床65℃培养7天，取出试片，采用SY/T5153-2007“油藏岩石润湿性 测定方法”中方法测试接触角θc。

(4)物理模拟实验提高采收率值评价

①岩心准备：包括岩心的洗刷和灭菌，测定空气渗透率；

②抽真空、饱和地层水，测定岩心孔隙度；

③饱和原油，岩心老化7天，计算束缚水饱和度；

④一次水驱，水驱至采出水含水98％以上，计算一次水驱采收率；

⑤注入热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液0.2PV～ 0.3PV；

⑥二次水驱，水驱至含水100％以上，产出液破乳后，计算热反硝化地芽 孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液提高采收率值。

热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的性能：以原油为唯一碳源生 长，细菌浓度可达3×108个/mL；发酵液乳化系数大于95％；发酵液可将石英矿 片接触角θc由90～150°降低至25～50°，由亲油转变为亲水；物理模拟实验提 高采收率值大于15％。

热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的现场应用工艺：一种是微生 物驱油，即直接利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油；一种是微生 物单井吞吐，即通过油井向地层注入发酵液，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1 CGMCCNo.10697繁殖代谢提高单井产能；另外一种是微生物防蜡，将发酵液注 入油井井筒，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697在井筒中与原油 及井筒表面作用，减缓井筒结蜡。

所述的利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油，是将发酵液与注 入水按照体积比为1∶500～1000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为油藏孔 隙体积的20％～30％，注入速度为500～1000m3/d。

所述的通过油井向地层注入发酵液，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCC No.10697繁殖代谢提高单井产能，是根据油井的油层有效厚度、孔隙度和处理半 径，计算得出发酵液注入量；用泵车将配制好的发酵液经油井油套环空注入地层； 油井关井培养10～20d后开井生产。

所述的将发酵液注入油井井筒，利用热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo. 10697在井筒中与原油及井筒表面作用，减缓井筒结蜡，是用加药泵将200～400Kg 热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液由油井的套管加入油套环 空，加入速度为300～600L/min，每20～30d投加一次发酵液。

本发明的优点和有益效果在于：

本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697生长温度50～ 80℃，生长pH值范围4～9，耐盐0～5％，能够以原油为唯一碳源生长，发酵液 乳化系数大于95％；发酵液可将石英矿片接触角θc由90～150°降低至25～ 50°，物理模拟实验提高采收率大于15％，该菌株发酵液应用于现场微生物驱油， 提高采收率大于5.0％，应用于现场微生物单井吞吐，平均单井增油量大于200吨， 应用于现场微生物防蜡，平均延长油井免热洗周期60天以上。

附图1为CF-1菌株的形态图；

附图2为CF-1在不同温度下培养的生长曲线；

附图3为CF-1在不同pH培养的细菌浓度；

附图4为CF-1在不同盐度条件下培养的细菌浓度；

附图5为CF-1以原油为碳源的生长曲线；

附图6为CF-1发酵液对柴油的乳化性能测试结果；

附图7为CF-1改变岩石润湿性的测试结果。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1：

本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697的形态特征和生 理生化特征。

参照《Bergey’sMannualofSystematicBacteriology》的实验方法进行，检测其 革兰氏染，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，以及触酶、淀粉水 解、明胶液化、半乳糖、木糖、乳糖等生化特征。

研究结果表明，如图1所示，该菌株为革兰氏染阳性、菌体呈长杆状、周 生鞭毛、能运动、好氧、有芽孢生成，细胞大小5-10μm×0.5μm。生长温度50～ 80℃，最适生长温度65℃，生长pH范围4～9，NaCl耐受性0～5％(图2～图4)。 接触酶、淀粉水解酶、明胶液化、麦芽糖、D-半乳糖、α-D-葡萄糖、柠檬酸、 D-松三糖、蔗糖、D-海藻糖均表现为阳性，D-阿拉伯醇、山梨醇、琥珀酸、L-亮 氨酸、龙胆二糖等均表现为阴性。

实施例2：

本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CGMCCNo.10697培养发酵及发酵液性 能评价

发酵培养基：蔗糖0.3％，蛋白胨0.3％，K2HPO40.2％，pH值为7.5。

发酵条件：接种量1％，接种龄12h，初始pH7.5，温度65℃，搅拌速度150 rpm，pH＝7，通气量：1L/min，培养48小时后评价。

发酵液的性能参数评价方法：

(1)以原油为唯一碳源的生长能力评价

将热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697接种于以原油为唯一碳源的 烃类培养基中，65℃、160rpm下振荡培养，不同时间取样进行细菌密度测试。

(2)发酵液乳化能力测试

取一试管，加等体积的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液 和柴油后利用微型旋涡混合仪高速涡旋震荡2min后混匀，65℃下静置24h，分别 测定乳化层和总烷烃层的体积，相比即为乳化系数，用乳化系数表示其乳化能力 的大小。

(3)改变岩石润湿性能力评价

取亲油石英矿片分别放入热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵 液和蒸馏水中，置摇床65℃培养7天，取出试片，采用SY/T5153-2007“油藏岩 石润湿性测定方法”中方法测试接触角θc。

(4)物理模拟实验提高采收率值评价

①岩心准备：包括岩心的洗刷和灭菌，测定空气渗透率；

②抽真空、饱和地层水，测定岩心孔隙度；

③饱和原油，岩心老化7天，计算束缚水饱和度；

④一次水驱，水驱至采出水含水98％以上，计算一次水驱采收率；

⑤注入热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液0.2PV～ 0.3PV；

⑥二次水驱，水驱至含水100％以上，产出液破乳后，计算热反硝化地芽 孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液提高采收率值。

实验结果表明(见附图5～图7)，该菌种以原油为唯一碳源生长，细菌浓度 可达3×108个/mL，发酵液乳化系数大于95％，发酵液可将石英矿片接触角θc 由90～150°降低至25～50°，物理模拟实验提高采收率值见表1。

表1CF-1菌株发酵液物理模拟提高原油采收率性能评价结果

从表1可以看出CF-1发酵液可以在水驱基础上提高采收率15.8％。

实施例3：

本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液在胜利油 田区块A中的应用

区块概况：地层温度60℃，地层水矿化度2×104mg/L，地质储量28×104t， 孔隙体积25×104m3。

实施步骤：将发酵液与注入水按照1∶1000比例混合后注入油藏，混合液注入 总量为5×104m3，注入速度为1000m3/d。

试验结果：试验完成后，该区块累计增油1.74×104t，提高采收率6.2％。

实施例4：

本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液在胜利油 田油井B的应用。

油井概况：地层温度75℃，地层水矿化度1.5×104mg/L，油层有效厚度7.0m， 孔隙度0.30，渗透率1375×10-3μm2。

实施步骤：油层有效厚度H＝7.0m，孔隙度φ＝0.30代入计算式V＝3.14R2Hφβ， 并取处理半径R＝4m，用量系数β＝1.3，得CF-1发酵液用量V＝137m3。

将热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液用泵车经油井B油套 环空以12m3/h的注入速度注入地层，关井15天后恢复生产。该井恢复生产后产 液和产油上升，6个月累计增油300t。

试验结果：试验完成后，该井产液和产油上升，6个月累计增油300t。

实施例5：

本发明提供的热反硝化地芽孢杆菌CF-1CGMCCNo.10697发酵液在胜利油 田油井C的应用。