一株好氧反硝化脱氮副球菌及其应用

本发明涉及环境微生物领域。具体涉及一株用于生物脱氮的脱氮副球菌 (Paracoccus denitrificans)及其应用。本发明的脱氮副球菌在好氧条件下具有较强 的反硝化性能，特别适用于含氨废水同步硝化反硝化过程脱氮。

随着水体中氮素污染日益严重，脱氮成为目前水处理研究中的重点和热点。 目前普遍认为，生物脱氮是从废水中去除氮素污染的较为经济有效的方法之一。 传统生物脱氮包括好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，其中硝化是指自养硝化菌 在好氧条件下将氨氮氧化成亚硝酸盐氮或硝酸盐氮；而反硝化则是一个严格的 厌氧过程，是硝酸盐氮或亚硝酸盐氮被还原成气态氮的过程。这就需要将硝化 和反硝化分离开，存在工艺冗长，污水处理构筑物占地面积大，投资和运行费 用高等弊端。针对上述问题，有些研究者试图将硝化菌和反硝化菌投加到同一 反应器中进行脱氮，虽然部分解决了传统工艺存在的问题，但是由于两种菌体 的差异，总氮去除效果往往不理想。

由于传统脱氮工艺存在诸多不能克服的缺点，所以人们不断寻求新型、高 效的脱氮微生物，好氧反硝化菌等一些新型脱氮细菌相继被发现。近年来，好 氧反硝化菌作为一种新型的脱氮细菌倍受关注，目前已发现的好氧反硝化菌有 泛养硫球菌(Thiosphaera pantotropha)，现更名为脱氮副球菌(Paracoccus  denitrificans)，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，海洋假单胞菌(Pseudomonas  nautical)和细小好氧反硝化菌(Microvirgula aerodenitrificans)等。此类菌株的发现 突破了传统技术限制，大大简化了脱氮工艺环节，可实现同时硝化反硝化脱氮。

CN200610140871.9公开了一株具有好氧反硝化性能的恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)。该菌在处理含硝酸盐氮模拟废水时可将硝酸盐氮在好氧 条件下还原为气体产物。但上述菌体只能处理以琥珀酸钠为碳源，硝酸钾为氮 源的模拟废水，培养4d，硝酸盐氮还原率为74.1％，总氮去除率66.5％。 CN200610081490.8公开了一株脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)W12 CGMCC No.1673，该菌株对有机污染物具有很高的降解能力，但是主要用于含 吡啶、苯、二甲苯、喹啉、等有机污染物的废水的生物治理与被污染的 土壤修复，只有在无氧条件下才能有效代谢氨氮化合物。孔庆鑫(一种新的好 氧反硝化菌筛选方法的建立及新菌株的发现，应用与环境生物学报，2005，04)利用 间歇曝气富集，(KCN)选择培养基筛选好氧反硝化细菌，筛选到一株以柠 檬酸钠为碳源，硝酸钾为氮源进行好氧反硝化的假单胞菌Pseudomonas  sp.Y2‑1‑1。该菌5d内可将硝酸盐氮由282.0mg/L降解至149.2mg/L，总氮去除 率不足50％。朱月琪(一株好氧反硝化菌的分类及其特性研究，微生物学通 报，2009，04)分离得到一株好氧反硝化细菌CY1，初步鉴定为泛养副球菌 (Paracoccus pantotrophus)，该菌在厌氧和好氧条件下均具有反硝化能力，硝酸 盐氮初始浓度为137.25mg/L，30h内硝酸盐氮去除率分别为99.98％(厌氧)和 60.16％(好氧)，但该菌异养硝化转化氨氮的性能未见报道，在处理含氨氮污水时 受到限制，另外好氧时的反硝化效果也需进一步提高。

针对现有技术的不足，本发明提供一株好氧反硝化脱氮副球菌，该菌株具 有较高的好氧反硝化效率，还具有异养硝化脱氨氮和好氧反硝化同时进行的效 果，将硝化和反硝化结合在一个过程中。

本发明提供一株好氧反硝化脱氮副球菌，脱氮副球菌(Paracoccus  denitrificans)DN‑3，2010年03月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3658。

本发明脱氮副球菌DN‑3菌体细小，呈椭圆形；菌落呈乳黄，圆形凸起， 边缘整齐光滑。经生理生化鉴定为革兰氏阴性菌，接触酶阳性，氧化酶阳性。 平板培养基菌落形态见附图1，显微镜放大1000倍的菌体形态见附图2，生理 生化特性如表1所示。

表1脱氮副球菌DN‑3的生理生化特性

注：“+”表示阳性反应或能利用；“‑”表示阴性反应或不能利用。

本发明脱氮副球菌DN‑3的16SrRNA基因测序分析结果见序列表。

本发明脱氮副球菌DN‑3的硝酸盐还原酶活性高，在好氧与限氧条件下均能 表达，具有好氧反硝化与限氧反硝化功能，还具有同时完成硝化作用和反硝化 作用的功能，总氮去除率均大于90％。具体性能包括：(1)利用硝酸盐氮作为 唯一氮源，进行好氧反硝化脱氮；(2)利用廉价碳源(如甲醇或含COD废水等)， 硝酸盐氮作为唯一氮源，进行好氧反硝化脱氮；(3)利用廉价碳源(如甲醇或 含COD废水等)，氨氮作为唯一氮源，进行异养硝化‑好氧反硝化同步脱氮。

本发明脱氮副球菌DN‑3在温度20℃～38℃，pH6.0～9.5的条件下生物活 性稳定，脱氮效果好。

本发明脱氮副球菌DN‑3应用在生物脱氮领域，处理含硝酸盐氮或氨氮的废 水，总氮去除率可达90％。

本发明脱氮副球菌DN‑3应用于污水处理的好氧反硝化过程，其操作条件 为：溶解氧(DO)为0.2mg/L～2.5mg/L，碳氮质量比为2.0～6.0，温度20℃～ 38℃，pH6.0～9.5。

本发明脱氮副球菌DN‑3应用于污水处理的同时硝化反硝化过程，如可以用 于含氨氮污水的同时硝化反硝化处理过程，其操作条件为：溶解氧(DO)为0.5 mg/L～5.0mg/L，碳氮质量比2.0～6.0，温度20℃～38℃，pH6.0～9.5。

本发明脱氮副球菌DN‑3在污水脱氮处理效果不理想的情况下可以作为生物 修复剂进行补加。

本发明脱氮副球菌DN‑3可直接应用于含硝酸盐氮废水的反硝化脱氮，也可 以应用于含氨氮废水的脱氮，是一株具有异养硝化‑好氧反硝化性能的细菌。该 菌投入使用后可以缩短系统的启动时间，在各类废水脱氮处理过程中具有非常 广阔的应用前景，特别适合同步硝化反硝化生物脱氮工艺过程中。

本发明脱氮副球菌DN‑3是具有好氧反硝化特性的异养硝化菌，使硝化与反 硝化在一个单元内同步进行成为可能，同时克服了传统处理工艺在处理效率与 经济适用两方面的矛盾，实现废水高效而经济的脱氮。因此，获得高效的降解 菌株，并使其成为反应体系中的优势种而发挥脱氮作用，将会加快同步硝化 反硝化工艺工业化应用的进程。

生物材料保藏说明

本发明提供的脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)DN‑3菌株，保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区 大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.3658；保藏日期： 2010年03月11日。

图1是本发明的脱氮副球菌DN‑3在平板培养基上的菌落形态照片。

图2是本发明的脱氮副球菌DN‑3在显微镜下放大1000倍的菌体照片。

以下具体说明本发明菌株的分离筛选过程及应用实例。

本发明菌株采用稀释平板分离法从活性污泥菌中分离筛选具有好氧反硝 化性能的菌株，活性污泥来自抚顺石油三厂污水处理厂。

分离筛选方法如下(百分含量为重量百分含量)：

①采用稀释平板分离法：取少许活性污泥，梯度稀释后涂布于初筛固体培 养基平板(丁二酸钠4.3g，KNO3 1.0g，KH2PO4 1.0g，FeCl2·H2O 0.5g，CaCl2·H2O 0.2g，MgSO4 1.0g，BTB 1.0mL，水1.0L，pH7.0～7.5，按2％的比例加入琼脂)， 30℃～35℃培养，选择培养基变蓝的菌株进行纯化。经多次转接，筛选得到5 株好氧反硝化菌，编号为DN‑1～DN‑5。

②好氧反硝化脱氮性能比较：将筛选获得的5株菌接种于复筛液体培养基 (丁二酸钠4.3g，KNO3 1.0g，KH2PO4 1.0g，FeCl2·H2O 0.5g，CaCl2·H2O 0.2g， MgSO4 1.0g，水1.0L，pH7.0～7.5)，30℃～35℃培养。获得硝酸盐氮和总氮去 除率均大于93％的菌株DN‑3，其它菌株总氮去除率为50％～75％。经反复实验 证明，菌株DN‑3的好氧反硝化性能可以稳定遗传。

③碳源利用能力考察：选用较为廉价的甲醇为碳源进行考察。结果表明菌 株DN‑3能够以甲醇作为碳源进行好氧反硝化，总氮去除率大于90％。

④异养硝化能力考察：以氨氮为氮源，甲醇为碳源进行异养硝化‑好氧反硝 化能力考察。结果表明DN‑3具有较强的异养硝化‑好氧反硝化能力，氨氮去除 率大于95％，总氮去除率大于90％，亚硝酸盐氮几乎没有积累。

实施例1

脱氮副球菌DN‑3的好氧反硝化性能的检测。

配制模拟废水I(丁二酸钠4.3g，KNO3 2.0g，KH2PO4 1.0g，FeCl2·H2O 0.5g， CaCl2·H2O 0.2g，MgSO4 1.0g，水1.0L，pH7.0～7.5)，硝酸盐氮初始浓度为 277mg/L，碳氮质量比为2.8。在溶解氧(DO)为0.5mg/L，温度22℃，pH7.0 的条件下处理26h。硝酸盐氮和总氮去除率均大于95％，COD去除率大于90％。

配制模拟废水II(甲醇5.0mL，KNO3 2.0g，KH2PO4 1.0g，FeCl2·H2O 0.5g， CaCl2·H2O 0.2g，MgSO4 1.0g，水1.0L，pH7.0～7.5)，硝酸盐氮初始浓度为 277mg/L，碳氮质量比为5.3。在DO为1.5mg/L，温度30℃，pH8.0的条件下处 理29h。硝酸盐氮去除率和总氮去除率均大于90％，COD去除率大于85％。

实施例2

脱氮副球菌DN‑3的异养硝化‑好氧反硝化性能的检测。

配制模拟废水III(丁二酸钠4.3g，硫酸铵1.25g，KH2PO4 1.0g，FeCl2·H2O 0.5g， CaCl2·H2O 0.2g，MgSO4 1.0g，水1.0L，pH7.0～7.5)，氨氮初始浓度为265mg/L， 碳氮质量比为2.9。在DO为0.5mg/L，温度25℃，pH7.5的条件下处理34h。氨 氮和总氮去除率均大于95％，COD去除率大于90％。

配制模拟废水IV(甲醇5.0mL，硫酸铵1.25g，KH2PO4 1.0g，FeCl2·H2O 0.5g， CaCl2·H2O 0.2g，MgSO4 1.0g，水1.0L，pH7.0～7.5)，氨氮初始浓度为265mg/L， 碳氮质量比为5.6。在DO为2.0mg/L，温度35℃，pH8.5条件下培养36h。氨氮 和总氮去除率大于90％，COD去除率大于85％，亚硝酸盐氮几乎没有积累。

实施例3

脱氮副球菌DN‑3应用于高浓度COD的味精废水。

味精废水水质：氨氮浓度300mg/L～450mg/L，COD为700mg/L～850mg/L。 首先利用本实验室培养的硝化菌将氨氮转化为硝酸盐氮，硝化出水作为反硝化 进水，然后利用DN‑3进行好氧反硝化，碳源不足时补加甲醇，使得碳氮质量比 为3.0。初始硝酸盐氮浓度为280mg/L，COD为720mg/L。在DO为0.5mg/L， 温度30℃，pH7.0～8.5的条件下处理32h后，硝酸盐氮和总氮去除率大于90％， COD去除率大于80％。

实施例4

脱氮副球菌DN‑3应用于尿素含氨废水。

尿素废水水质：氨氮浓度450mg/L，pH9.0～9.8。不经过硝化菌将氨氮转化 为硝酸盐氮。直接利用DN‑3进行异养硝化‑好氧反硝化脱氮。碳源不足补加甲 醇，使得碳氮质量比为4.5。在DO为0.3mg/L～2.5mg/L，温度30℃，pH8.0～ 9.0的条件下处理48h后，氨氮和总氮去除率均大于90％，COD去除率大于80％。