一种废水处理微生物菌剂及其制备方法

一种废水处理微生物菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体地说涉及一种废水处理微生物菌剂及其制备方法，该菌剂可以完成氨氮、总氮和CODcr的脱除，实现用于废水处理微生物菌剂的产业化、商品化。 

背景技术

生物脱氮是解决氮素污染较为经济有效的方法之一。不管是传统的微生物附着型污水处理构筑物还是新开发的一些高效生物膜处理系统，负责脱氮的微生物主要是自养硝化菌。自养细菌自身的增殖速度慢、在混合培养的活性污泥系统中无法与异养细菌竞争、难以获得较高的生物量、硝化效率低，导致自养微生物脱氮系统抗冲击能力弱、硝化作用不完全、总氮去除率低。所以一些新型的、效果更好的脱氮微生物，如异养硝化细菌、好氧反硝化细菌、厌氧氨氧化细菌等相继被发现并进行了相关研究。 

厌氧氨氧化细菌属于专性厌氧菌，应用于短程硝化和厌氧氨氧化组合工艺中虽然具有低能耗、低污泥产量、低投资成本和运行费用等特点，但是采用两级工艺易出现短程硝化阶段积累的亚硝酸盐浓度过高，进而对微生物产生抑制的问题，同时由于短程硝化和厌氧氨氧化分别在不同的反应器中进行，使得整个工艺的基建费用投资和占地面积增加。如果采用一级工艺则由于使用专性厌氧的厌氧氨氧化细菌长期处于一定浓度的有氧环境中，从而在一定程度上降低了厌氧氨氧化细菌的活性。所以到目前为止，短程硝化-厌氧氨氧化工艺在国际上的工程应用较少，只有荷兰鹿特丹Dokhaven市政污水处理厂的污泥消化液处理工程、荷兰Lichtenvoorde制革废水处理项目、日本三重县半导体加工废水处理项目和荷兰Olburgen土豆加工废水处理项目，还没有大规模推广应用。 

异养硝化细菌生长速度快、细胞产率高、要求溶解氧浓度低、对环境的适应能力也强，与自养型硝化菌相比，虽然单位生物量的异养菌氧化铵盐的速率比自养菌慢，但其总体的氧化铵盐的速率并不比自养菌慢。有些异养微生物可在缺少有机碳源的条件下，进行氨的氧化获得生长所需的能量，也可以在有机物存在的条件下进行氨氧化，不获得能量，是一种次代谢过程，氨的氧化不受有机物的限制。因此异养硝化细菌作为一种新型的脱氮微生物备受关注。国内外研究者在异养硝化微生物筛选、功能代谢途径、酶和基因等方面进行了广泛的研究，但是目前仍仅停留在实验室研究阶段，真正将异养硝化菌应用于实际工程中处理污水的实例并不多见。好氧反硝化细菌特别是亚硝酸型好氧反硝化细菌的研究弥补了短程硝化-厌氧氨氧化工艺的不足，可以直接应用异养硝化与好氧反硝化菌组合实现一级工艺的短程硝化反硝化脱氮。因此将生长条件相近的优势菌株进行组合制备成菌剂，投加到常规废水处理系统中或者用于特定污染水体的生物修复都可以提高脱氮效率、改善水质，推动脱氮微生物菌剂的产品化、商业化的进程，也将有利于短程硝化反硝化、同步硝化反硝化等新型脱氮工艺的进一步工业应用。 

CN101302485A公开了一种异养硝化微生物菌剂、其培养方法和用途，该菌剂含有嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophiliastrain DN 1.1）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida strain DN 1.2），该菌剂能够有效脱除水体中的氨氮和总氮，还可以同时去除有机废水中的COD，适用于高浓度养殖废水处理。该菌剂在处理氨氮浓度为455~600mg/L的猪场废水时，实验运行至94~95h，对废水中氨氮的去除率达87%~88%，处理出水氨氮含量为59~72mg/L；处理95h后能够将进水790mg/L的总氮处理至164mg/L，总氮去除率为79.2%。CN200910021020.7公开了一种降氨氮和亚硝酸氮的水质改良微生态制剂的制备方法，该菌剂中涉及一株节杆菌CGMCC No.1282，但该发明的微生态制剂属于水产养殖技术及生态环境保护技术领域。 

现有短程硝化反硝化工艺中存在下列两个问题：(1)采用两级工艺在短程硝化阶段积累的亚硝酸盐浓度过高而对微生物产生抑制作用；(2)采用一级工艺由于长期的有氧环境在一定程度上会降低厌氧氨氧化细菌活性。 

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种可以采用一级工艺进行脱氮的微生物菌剂及其制备方法。该微生物菌剂除了解决现有短程硝化反硝化存在的问题外，可以投加到各类生化反应构筑物中改善微生物组成、提高脱氮效率，同时能够有效控制硝化反应进程，还可以有效去除废水中的有机污染物。 

本发明微生物菌剂含有沼泽考克氏菌（Kocuria palustris）FSDN-A、Arthrobacter creatinolyticus FDN-1和Flavobacterium mizutaii FDN-2中的一种或两种，同时含有脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans) DN-3和Methylobacterium phyllosphaerae  SDN-3中的一种或两种，五种菌株分别于2011年7月14日和2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号（邮编100101）。沼泽考克氏菌（Kocuria palustris）FSDN-A保藏编号为CGMCC NO.5061，保藏时间为2011年7月14日；Arthrobacter creatinolyticus FDN-1 保藏编号为CGMCC NO.3657，保藏时间为2010年3月11日；Flavobacterium mizutaii  FDN-2保藏编号为CGMCC No.3659，保藏时间为2010年3月11日；脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans) DN-3保藏编号为CGMCC No.3658，保藏时间为2010年3月11日；Methylobacterium phyllosphaerae   SDN-3保藏编号为CGMCC No.3660，保藏时间为2010年3月11日。 

其中：节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2可以是其中的一种，也可以是两种任意比例的混合菌体；脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3可以是其中的一种，也可以是两种任意比例的混合菌体。“沼泽考克氏菌FSDN-A”、“节杆菌FDN-1和/或水氏黄杆菌FDN-2”与“脱氮副球菌DN-3和/或甲基杆菌SDN-3”三类菌体的比例为1：（0.1~10）：（0.1～10），优选为1：（0.2~5）：（0.2～5）。按菌体体积计，菌体体积为培养后在每分钟1万转条件下离心分离5分钟后的菌体体积。 

本发明微生物菌剂中，沼泽考克氏菌FSDN-A菌落颜为黄，菌株个体呈球状，无芽孢，能运动；革兰氏染为阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性。节杆菌FDN-1菌落颜为黄、菌株个体呈棒状，无芽孢，能运动；革兰氏染为阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，能利用多种碳源。水氏黄杆菌FDN-2菌落颜为白、菌株个体呈杆状，无芽孢；革兰氏染为阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用多种碳源。脱氮副球菌DN-3菌落呈乳黄；菌株个体呈椭圆形；革兰氏染为阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性；能利用廉价的碳源。甲基杆菌SDN-3菌落呈橘红，为革兰氏阴性菌，菌体为杆状，能运动；圆形细小，边缘整齐光滑；接触酶阳性，氧化酶阳性，可利用多种碳源。 

本发明菌剂中的沼泽考克氏菌FSDN-A、节杆菌FDN-1、水氏黄杆菌FDN-2、脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3在有氧和缺氧环境下均能完成脱氮过程。其中沼泽考克氏菌FSDN-A优先利用亚硝氮还可以利用硝氮为氮源进行反硝化脱氮，在脱氮同时能去除大量COD；节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2能以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，在脱氮的同时能去除COD；脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3均能以氨氮作为氮源进行异养硝化-好氧反硝化同步脱氮，在脱氮的同时能去除COD。 

本发明微生物菌剂中，节杆菌FDN-1、水氏黄杆菌FDN-2可以按任意比例混合但必须包含其中一种，脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3也可以按照任意比例进行混合但必须包含其中一种。本发明微生物菌剂中，可以含有适宜的添加剂，如营养物质、保藏助剂等，具体的添加剂种类及用量是本领域技术人员熟知的。 

本发明废水处理微生物菌剂的一种具体制备方法包括以下内容： 

1、将本发明沼泽考克氏菌FSDN-A、节杆菌FDN-1、水氏黄杆菌FDN-2、氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3分别接种于固体培养基上进行活化；

2、用接菌环取平板上的菌落分别接种于相应的液体培养液中，在温度25~35℃、150~240rpm好氧条件下震荡培养1~3天至对数生长期，获得液体菌剂种子液；

3、将上述种子液放大培养后收集菌体，过滤浓缩后按所需的比例混合，选择性加入营养液等所需的添加剂，即为本发明亚硝酸型脱氮微生物菌剂。每种菌的种子液可以单独放大培养，也可以FDN-1种子液和FDN-2种子液按比例混合共同放大培养，DN-3种子液和SDN-3种子液按比例混合共同放大培养，也可以是四种菌的种子液混合进行放大培养。

本发明微生物菌剂所涉及的沼泽考克氏菌FSDN-A的菌体活化和种子液培养所用的培养基配方为：牛肉膏：5~10g/L，蛋白胨：8~15g/L，NaNO₂：0.4~1.0g/L，KNO₃:0.4~0.8g/L。本发明微生物菌剂所涉及的节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2的菌体活化和种子液培养所用的培养基配方为：牛肉膏：3~7g/L，蛋白胨：7~13g/L，NaNO₂：0.8~1.5g/L，固体培养基加入1.5~2.5%的琼脂。本发明微生物菌剂所涉及的脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3的菌体活化和种子液培养所用的培养基配方为：硫酸铵：0.1~0.5g/L，KNO₃:0.5~1.0g/L，丁二酸钠2~8g/L，甲醇：0.25~1.0mL/L，固体培养基加入2%的琼脂；此外培养液中还含有少量的铁离子和镁离子等。培养条件均为：温度为20~35℃、150~240rpm震荡培养至对数期即可收获菌体用于制备微生物菌剂。 

本发明微生物菌剂放大培养所用的培养液可以是自配或者实际废水，培养液中的总氮和氨氮浓度为100mg/L~1000mg/L，碳氮质量比5：1~15:1；培养条件为温度15℃～35℃；pH6.5～10.0；溶解氧低于3.0mg/L。本发明所用的放大培养反应器可以是各种适宜结构，具有良好的曝气和搅拌系统。培养过程中pH值不需要调节。 

上述放大培养的菌体浓缩后得到浓度较高的菌悬液，将这些菌悬液加入营养液或者营养液和保护剂的混合液后可以制备成液态菌剂，也可以利用本领域现有的方法制备成干粉状的菌剂。可以采用塑料袋、塑料瓶或者塑料桶等耐储存、防冻、便于运输等材质的容器或者设备进行包装。包装方法采用本领域现有常规技术，包装量为50~5000g/包（袋或者瓶）包装后的菌剂可以根据具体情况在室温或者低温条件下保存。室温保存保质期为1~6个月，低温保存保质期为1~5年，保存后活性降低率小于10%。 

本发明所用的浓缩方法可以通过离心或者过滤等不影响菌体活性的方法。 

本发明菌剂制备过程首先进行菌体活化；然后进行种子液培养，最后将种子液放大培养后收集菌体、浓缩、包装并保存备用。所获得的微生物菌剂耐受性和适应性强，抗冲击性好，总氮的去除负荷高、处理效果好；可以直接投加到污水处理系统中或者与活性污泥混合或者在各种填料上挂膜后处理废水，使用性能好；经过一定时间保藏的微生物菌剂恢复速度快，生物活性高，可实现脱氮微生物的产业化、商品化。 

本发明微生物菌剂由沼泽考克氏菌FSDN-A、节杆菌（Arthrobacter creatinolyticus）FDN-1、水氏黄杆菌（Flavobacterium mizutaii）FDN-2、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans) DN-3和甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae) SDN-3菌株组成。在含氮废水处理过程中，特别是采用一级工艺进行生物脱氮处理过程中，这五种微生物互相配合、互相竞争底物，氨氮和总氮去除速率高于任何一种微生物单独使用时的效果，由于体效应所以对废水的耐受冲击能力比纯化的菌体强、对废水水质的适用范围宽，能处理含有较高氨氮和COD废水，真正实现短程硝化反硝化脱氮，明显提高废水处理效果。 

本发明的废水处理微生物菌剂主要由生长条件相近的微生物制备而成，其中沼泽考克氏菌FSDN-A、节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2的培养条件和生长速率相近，脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3的培养条件和生长速率相近，所以混合液中各个菌株的比例不受放大倍数的影响，有利于快速培养。该菌剂一方面可以投加到传统的污水构筑物中改善原有微生物的组成、强化生化处理效果，另一方面在新建污水处理构筑物时可以把脱氮构筑物系列省去，使脱氮反应直接发生在一级生物池中，减少了基建投资，降低了运行费用。新加入的“沼泽考克氏菌FSDN-A”，能以亚硝氮和硝氮两种硝化产物为氮源，可以使废水处理系统脱氮更彻底，在竞争底物过程中增值速度慢，有利于污泥减量，这进一步拓宽了微生物菌剂的应用范围。 

具体实施方式

本发明提出了一种废水处理用微生物菌剂及其制备方法。本发明液态菌剂生长速度快，收集量大，菌剂具有较强的耐受性和适应性，具有较好的抗冲击性；可以直接投加到污水处理厂活性污泥中使用，也可以在适宜的生化反应器内处理含高浓度氨氮和COD的废水。投入使用后能够缩短系统启动时间，拓宽废水水质的适用范围，可以实现废水处理微生物菌剂的产业化、商品化。 

实施例1   微生物菌剂的制备方法

1、菌体活化：沼泽考克氏菌FSDN-A的菌体活化培养基配方为：牛肉膏：8g/L，蛋白胨：12g/L，NaNO₂：0.5g/L，KNO₃:0.5g/L；节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2的活化培养基配方为：牛肉膏:5g/L，蛋白胨:10g/L，NaNO₂:1g/L，加入2.0%的琼脂；脱氮副球菌DN-3 的活化培养基配方为：KNO₃:1g/L，丁二酸钠:8g/L，KH₂PO₄:1g/L，FeCL₂:0.5g/L，加入2.0%的琼脂；甲基杆菌SDN-3的活化培养基配方为：硫酸铵:0.5g/L，甲醇:0.75mL/L，KH₂PO₄:1g/L，FeCL₂:0.5g/L，；加入2%琼脂。在平板上涂布均匀后放置在温度为30℃恒温培养箱中进行活化。

2、用接菌环刮取平板上的菌体分别接种于相应的液体培养液中，在温度25~35℃、150~240rpm好氧条件下震荡培养1~3天至对数生长期，获得液体菌剂种子液；培养基配方同活化培养基配方，不用加琼脂。 

3、将上述沼泽考克氏菌FSDN-A作为Ⅰ号种子液，将上述节杆菌FDN-1和水氏黄杆菌FDN-2混合作为Ⅱ号种子液（菌体按照1:1和0.5:1两种比例组合分别编号Ⅱ-1和Ⅱ-2），将上述脱氮副球菌DN-3和甲基杆菌SDN-3混合作为Ⅲ号种子液（菌体按照1:1和0.5:1两种比例组合分别编号Ⅲ-1和Ⅲ-2），Ⅰ号种子液、Ⅱ号种子液中的任一组或任一种微生物与Ⅲ号种子液中的任一组或任一种微生物再按照1:1:1和1:2:3两种比例混合分别在具有良好搅拌系统的反应器中进行放大培养至对数生长期，培养液中的氨氮浓度为200mg/L~800mg/L，碳氮质量比5：1~10：1；培养条件为温度25℃～35℃；pH6.5～10.0；溶解氧低于3.0mg/L。 

对经过放大培养获得的液态菌悬液A（种子液Ⅰ、种子液Ⅱ-1和种子液Ⅲ-1混合比例1:1:1）、B（种子液Ⅰ、种子液Ⅱ-2和种子液Ⅲ-2混合比例1:2:3）、C（种子液Ⅰ、种子液Ⅱ-1和种子液Ⅲ-2混合比例1:1:1）、D（种子液Ⅰ、节杆菌FDN-1和种子液Ⅲ-2混合比例1:2:3）、E（种子液Ⅰ、种子液Ⅱ-2和脱氮副球菌DN-3混合比例1:1:3）进行收集、浓缩，然后加入菌悬液两倍体积的营养液。每升营养液中NH₄⁺-N 、Fe^2＋、Mg^2＋、K^＋、Ca^2＋这五种阳离子的摩尔配置比例为2000:5:20:20:15，再加入菌悬液体积2.5%的保藏剂后分装到500ml的塑料瓶中，置-70℃条件下保存备用。 

实施例2  在某废水处理系统中的应用

某废水处理系统进水NH₃-N浓度平均为320mg/L、总氮（TN）浓度平均为512mg/L、COD_Cr浓度平均为661mg/L。运行过程中氨氮平均去除率为70%，总氮平均去除率只有48%，COD平均去除率为69%。取一定量的液态菌悬液A按照5%（体积）的投加量一次性投加到曝气池内，运行30天后，氨氮平均去除率为92%，总氮平均去除率为87%，COD平均去除率为94%，污泥浓度比未投加菌剂前降低5%，该菌剂的投加提高了废水中总氮和COD的去除率，同时废水处理系统这的污泥浓度在运行一个月的时间内并没有增加。