棉花体细胞染体Oligo?FISH方法

本发明属于生物信息学及分子细胞遗传学领域，尤其涉及一种棉花体细胞染体 Oligo-FISH方法。

染体涂染技术是细胞遗传学研究领域的关键技术之一，是准确识别和区分染 体及其区段的重要手段。探针的选择是染体涂染技术应用的关键环节。典型的涂染探针 多来自于克隆的基因组片段或流式分拣的染体，经过缺刻平移或者PCR扩增直接或间接 荧光标记。标记后的探针长度多在150～250bp，这样在杂交过程中易于渗透到固定的细胞。 由于许多基因组克隆和流式分拣的染体富含基因组重复序列，杂交过程通常需要使用未 标记的基因组重复序列(Cot1DNA)进行封阻。染体上顺序排列的克隆混合成的探针也可 以用来涂染较大的染体区域，但这种方法通常都具有挑战性，因为杂交之前每个克隆需 要分别进行DNA提取与标记，这些探针的效率由于随机标记和片段化的原因稳定性难以保 障，在复杂植物基因组中的应用更表现了很大局限性，因此多在基因组相对较小、复杂度低 的植物物种中应用。

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种棉花体细胞染体Oligo- FISH方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明设计oligos的基因组是二倍体D基因组野生种雷蒙德氏棉G.raimondii (D5)基因组(Paterson et al.2012)；原位杂交所用棉花材料为二倍体D基因组雷蒙德氏棉 G.raimondii(D5)，种植于海南三亚中国农业科学院棉花研究所海南野生棉花种植园，并且 在河南安阳中国农业科学院棉花研究所温室有备份；具体方法包括雷蒙德氏棉第1号染 体的寡核苷酸混合池设计和寡核酸探针的标记；

所述雷蒙德氏棉第1号染体的寡核苷酸混合池设计包括以下步骤：

(1)用RepeatMasker系统去除雷蒙德氏棉基因组第1号染体序列中所有重复序 列；

(2)去重复的染体序列分成含有48个碱基的寡核苷酸片段(每个片段间步移5个 碱基)；

(3)获得的寡核苷酸片段通过BLAT系统与D5参考基因组进行匹配；

(4)利用Primer3(Untergasser et al.2012)来计算Tm值和发卡Tm值，留下dTm (dTm＝Tm–发卡Tm)值大于10℃的寡核苷酸序列；

(5)利用Python和R系统识别并排除非单一序列，获得染体特异、基因组中唯一 的序列组成该染体寡核苷酸混合池；

所述寡核酸探针的标记包括以下步骤：

1)乳化PCR，以合成的寡核苷酸序列为模板进行乳化PCR扩增，扩增程序：98℃ 2min；接着30个循环的98℃15s，56℃30s，72℃30s；最后延伸72℃5s；

2)体外转录，扩增产物作为模版进行体外(T7)转录；

3)反转录，体外转录获得的RNA用新的5’端带有生物素或标记的R引物进行 反转录；

4)酶解去除RNA；获得带标记的单链ssDNA分子，即标记好的寡核苷酸探针； 1.2.3Oligo-FISH

5)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的沙土中，然后在光 照培养箱里28～30℃培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用25ppm25℃下处理2h， 然后用蒸馏水冲洗，用卡诺固定液固定24h以上，备用；

6)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗数次，混合酶液(2％纤维素酶+1％果胶 酶)处理，37℃，45min；

7)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃冷冻4h以上；-80℃取出， 迅速揭掉盖片，80℃烤干，4℃保存备用；

8)荧光原位杂交流程，参照王春英等(2001)介绍的方法；标记的探针在荧 光显微镜下观察显示红；生物素标记在荧光显微镜下观察显示为绿；染体用DAPI衬 染在荧光显微镜下观察显示蓝；

9)荧光显微镜观察：用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软 件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。

具体的，所述步骤1)中每个寡核苷酸合成的oligo含有48个基因组序列碱基，5’F 引物，包括T7RNA多聚酶启动子序列和3’R引物；通过乳化PCR的方法进行扩增。

本发明的有益效果在于：

本发明是一种棉花体细胞染体Oligo-FISH方法，与现有技术相比，本发明根据 公布的棉花基因组序列信息，设计单染体的寡核苷酸混合池，寡核苷酸混合池经过乳化 PCR扩增、体外转录、反转录，获得荧光标记的ssDNA混合池，即目标染体的寡核苷酸混合 探针。以此探针对棉花体细胞中期染体进行荧光原位杂交(FISH)，建立棉花寡核苷酸 FISH方法(Oligo-FISH)，为棉花染体DNA重排、染体配对、亲缘关系分析、异源染质鉴 定等提供技术支持。

图1乳化PCR产物和标记探针的电泳检测。a-1，对照1(空白)；a-2，对照2(非乳化 PCR产物)；a-3，乳化PCR产物；b-1，标记的探针。

图2雷蒙德氏棉有丝分裂中期染体Oligo-FISH。a，DAPI衬染；b，生物素标记的 45S rDNA信号；c，标记的oligos探针信号；d，整合图片；a和d中白箭头指示的为 D501染体。Bar＝5μm。

下面结合附图对本发明作进一步说明：

如图1所示：本发明设计oligos的基因组是二倍体D基因组野生种雷蒙德氏棉 G.raimondii(D5)基因组(Paterson et al.2012)；原位杂交所用棉花材料为二倍体D基因 组雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)，种植于海南三亚中国农业科学院棉花研究所海南野生棉 花种植园，并且在河南安阳中国农业科学院棉花研究所温室有备份；具体方法包括雷蒙德 氏棉第1号染体的寡核苷酸混合池设计和寡核酸探针的标记；

所述雷蒙德氏棉第1号染体的寡核苷酸混合池设计包括以下步骤：

(1)用RepeatMasker系统去除雷蒙德氏棉基因组第1号染体序列中所有重复序 列；

(2)去重复的染体序列分成含有48个碱基的寡核苷酸片段(每个片段间步移5个 碱基)；

(3)获得的寡核苷酸片段通过BLAT系统与D5参考基因组进行匹配；

(4)利用Primer3(Untergasser et al.2012)来计算Tm值和发卡Tm值，留下dTm (dTm＝Tm–发卡Tm)值大于10℃的寡核苷酸序列；

(5)利用Python和R系统识别并排除非单一序列，获得染体特异、基因组中唯一 的序列组成该染体寡核苷酸混合池；

所述寡核酸探针的标记包括以下步骤：

1)乳化PCR，以合成的寡核苷酸序列为模板进行乳化PCR扩增，扩增程序：98℃ 2min；接着30个循环的98℃15s，56℃30s，72℃30s；最后延伸72℃5s；

2)体外转录，扩增产物作为模版进行体外(T7)转录；

3)反转录，体外转录获得的RNA用新的5’端带有生物素或标记的R引物进行 反转录；

4)酶解去除RNA；获得带标记的单链ssDNA分子，即标记好的寡核苷酸探针； 1.2.3Oligo-FISH

5)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的沙土中，然后在光 照培养箱里28～30℃培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用25ppm25℃下处理2h， 然后用蒸馏水冲洗，用卡诺固定液固定24h以上，备用；

6)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗数次，混合酶液(2％纤维素酶+1％果胶 酶)处理，37℃，45min；

7)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃冷冻4h以上；-80℃取出， 迅速揭掉盖片，80℃烤干，4℃保存备用；

8)荧光原位杂交流程，参照王春英等(2001)介绍的方法；标记的探针在荧 光显微镜下观察显示红；生物素标记在荧光显微镜下观察显示为绿；染体用DAPI衬 染在荧光显微镜下观察显示蓝；

9)荧光显微镜观察：用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软 件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。

具体的，所述步骤1)中每个寡核苷酸合成的oligo含有48个基因组序列碱基，5’F 引物，包括T7RNA多聚酶启动子序列和3’R引物；通过乳化PCR的方法进行扩增。

实验结果

通过RepeatMaster软件先去除该染体上的重复序列，然后根据oligo的长度、序 列相似性、Tm值等的选择，去除不符合要求的序列，保留染体特异、序列唯一的该染体 oligos。我们得到的D501染体oligos有19,786个，根据基因组数据，该染体长度62, 769,430bp，因此可以计算在染体的密度是每kb有0.315个oligos。

通过乳化PCR方法扩增所设计的oligos，使之大量扩增(图1a-3)，对照1(空白)没 有扩增出条带(图1a-1)，对照2(非乳化PCR)扩增出非乳化PCR产物(图1a-2)。反转录引物带 有生物素或标记，所以去除RNA后的单链DNA可以作为探针，片段大小在68bp左右(图 1b-1)，直接作为探针进行FISH研究。

以雷蒙德氏棉体细胞有丝分裂中期染体为靶DNA，生物素标记的45S rDNA和地 高辛标记的雷蒙德氏棉D501染体oligos为探针，进行了双荧光原位杂交。所设计和标 记的探针在雷蒙德氏棉有丝分裂中期染体上产生1对特异的弥散信号，实现D501染体 的准确识别(图2)。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。