一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗

一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗

技术领域 本发明涉及一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗。该疫苗为牛、羊和猪对布鲁氏菌病的 预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特 征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性 能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫 生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。 目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中 国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。

根据布鲁氏菌表型的差异，可将布鲁氏菌分为光滑型(S)和粗糙型(R)两类，目前在 我国使用的布病活疫苗均为光滑型菌株，其免疫带来的主要问题是使用后无法区分疫苗免疫 与自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防 治和清除带来了一定的难度。

虽然布鲁氏菌存在两种不同的表型，在凝集类抗体水平上无交叉反应，但却具有良好的 交叉保护性，并且不同种来源的布鲁氏菌相互之间同样存在交叉保护能力。如果用粗糙型布 鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以 此可以区分疫苗生产用菌株和野毒株。基于上述原因，人们对粗糙型布鲁氏菌疫苗株的研发 从未间断过。到目前为止，成功开发出具有良好免疫原性的粗糙型布鲁氏菌疫苗株却鲜有报 道。

最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会 出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家 通过利福平诱变获得了粗糙型布鲁氏菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在美国和拉 美的多个国家广泛使用。但其安全性仍有争议。

已有的研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的 表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光 滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。但到目 前为止，国内外尚无转基因获得的重组布鲁氏菌弱毒株及其疫苗被批准和应用。

发明内容

2007—2012年间，本实验室陆续从我国不同省份和地区牛、羊、犬和鹿等动物体内分离 到牛种布鲁氏菌41株，羊种布鲁氏菌74株，犬种布鲁氏菌9株。研究过程中，我们初步发 现了一株牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)分离株，其毒力介于强毒和疫苗毒之间，专利申 请人已对其进行了全面的生化检定，并分别用小鼠和豚鼠测定了其毒力。结果发现其毒力介 于强毒和弱毒之间，测定为中等毒力布鲁氏菌，命名为Abortus343。本发明本发明采用低 浓度氯霉素(1μg/ml)与光滑型牛种布鲁氏菌抗血清(A因子血清)相结合的诱导方法，筛选 获得了一株遗传稳定的粗糙型布鲁氏菌命名为RA343。RA343株安全性高，免疫效果好，用该 菌制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分。

本发明的技术方案

1.一株牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)弱毒菌株RA343，其特征在于采用氯霉素与A 因子血清相结合的筛选方法，筛选获得了一株不干扰布病临床诊断的粗糙型牛种布鲁氏菌， 用该菌制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，牛种布鲁氏 菌(Brucella abortus)RA343菌株已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为： CGMCC No.8886。

2.一种布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC No. 8886株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的按1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.8886 株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂， 充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为粗糙型RA343株牛种布鲁氏菌病疫苗。

本发明是通过以下步骤实现的：

1.筛选中等毒力布鲁氏菌分离株从41株牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)田间分离株 中，通过有限稀释法和菌落结晶紫染获得10株形态稳定的候选株。再参照《兽用生物制品 规程》(中华人民共和国农业部编.中华人民共和国兽用生物制品规程.2000年版，化学工业 出版社，2001)中布鲁氏菌病活疫苗种毒毒力测定方法，采用豚鼠脾脏含菌量测定10株候选 菌株的毒力，筛选毒力适中的布鲁氏菌(A343株)作为诱导的候选株。

2.对候选分离株进行诱导和驯化首先将A343在含低浓度氯霉素(1μg/ml)的TSA培养 基上传代，共传了35代，其结果是菌落结晶紫染的阳性率由A343(F0)低于1％到A343 (F40)6％左右。然后用光滑型牛种布鲁氏菌抗血清(A因子血清)进一步驯化，将不与A因子 血清发生凝集的细菌反复传代，待该细菌的粗糙型菌落比例达90％左右时，改用双倍效价的A 因子血清(牛种布鲁氏菌特异性血清，本实验室制备和保存)继续诱导。最终将获得的遗传 稳定的粗糙型布鲁氏菌，命名为RA343株。

3.对粗糙型布鲁氏菌RA343进行详细的菌种检定包括形态和生化特性，血清学和PCR反 应特异性，以及对豚鼠的毒力。

4.制备疫苗按布病疫苗的经典方法制备粗糙型布鲁氏菌病活疫苗，用于预防动物布鲁氏 菌病。

发明的详细描述

1.中等毒力布鲁氏菌分离株的筛选

(1)根据形态和稳定性初步筛选将本实验室自2007年-2012年从田间分离的牛种布 鲁氏菌41株，通过有限稀释法培养单个菌落，挑选菌落大小均匀，结晶紫染菌落阳性率低 于1％的候选布鲁氏菌10株，用于豚鼠测毒。

(2)通过对测定豚鼠毒力再次筛选参照《兽医生物制品规程》中布鲁氏菌疫苗种毒毒 力测定方法，采用豚鼠脾脏含菌量测定10株候选菌株的毒力，将10株布鲁氏菌分别在TSA 平板上增殖培养后，收集菌体，用无菌生理盐水将各细菌浓度调节到1×10⁹CFU/ml。取350～ 400g雌性豚鼠50只，分为10组，5只/组，对应10株候选菌。将候选菌株分别以1ml/只腹 股沟皮下注射各试验组豚鼠，14日后观察脏器病变情况，同时取脾脏，混合称重，制成乳剂， 接种TSA平板，根据细菌生长数量计算每1克脾脏含菌量。结果只有1株(A343)分离株毒 力最低，为1.2×10⁶CFU/g，其余9株均在6×10⁶CFU/g以上。本发明中选取A343作为本发 明中诱导的原始菌种，标注为A343(F0)。

2.A343株的诱导和驯化

(1)氯霉素的诱导 将筛选出的A343株在含氯霉素(1μg/ml)的TSA培养基上传代， 在往下一代传代时，采用有限稀释法进行，并同时对平板上的菌落进行结晶紫染。选取结 晶紫染着程度最明显的菌落继续传代，如果未出现结晶紫染阳性的菌落，则随机挑取。 以此方法共传了35代，其结果是菌落结晶紫染的阳性率由A343(F0)低于1％到A343(F40) 6％左右。

(2)光滑型牛种布鲁氏菌抗血清(A因子血清)的驯化 挑取单个A343(F40)菌落接种 到TSB液体培养基中培养48h，用无菌生理盐水调节菌液浓度约20～30亿CFU/ml(此时 OD600＝0.1)。取0.5ml菌液加入0.5ml A因子血清(无菌过滤，含2个凝集单位/ml)，充分混 匀后，37℃静置孵育2h，再转移到4℃冰箱静置12h。轻吸上层未凝集的菌液20μl，转移接 种到新鲜TSB培养基中，继续培养，如此反复诱导筛选30代。每5代通过有限稀释法获得 单个菌落，并进行菌落结晶紫染，挑取结晶紫着的单菌落继续传代。到第30代，即A343 (F35+30)，A343结晶紫染能着的菌落比例约90％。将A因子血清效价调整为4个凝集 单位/ml，按上述方法继续诱导。对第6代(总传代为第71代)菌落进行结晶紫染，此时 所有菌落全能着。在此基础上仍用4个凝集单位/ml的A因子血清继续诱导6代(总传代 为第77代)，将获得的遗传稳定的粗糙型布鲁氏菌命名为牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus) RA343株。

3.粗糙型布鲁氏菌RA343株菌种检定

(1)形态和生化特性RA343株菌菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察 微带蓝乳光。染形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。菌体大小在0.3～0.6μm 之间。革兰氏染为阴性。该菌的生长不依赖于CO₂，能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生 长，H₂S试验强阳性。

(2)特异性

1)血清学特异性以RA343株菌的培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清(中监 所，201101批)应不出现凝集，与粗糙型血清(本实验室制备)应出现凝集。

2)PCR特异性合成如下4条引物(序列1、序列2、序列3和序列4)，将其配成引物混 合储存液，各引物浓度均为25μM。

Feri：5’-GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3’

Reri:5’-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3’

F_abortus:5’-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3’

R_IS711:5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’

模板：以RA343株菌的培养菌落或试剂盒提取RA343株菌的基因组DNA。

PCR反应体系：50μL的反应体系中，含5μL10×Buffer，8μL2.5mMdNTPs，混合引物 储存液2μL，Taq酶2U，模板DNA1μL(或挑取菌落少许)。

PCR反应程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环， 最后72℃10min。

结果：扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现2条特异性PCR条带，大小分 别为178bp和494bp(见图1)。

(3)毒力用无菌生理盐水将在固体培养基上培养48-72h的RA343株菌培养物洗下， 稀释成每毫升含活菌10亿CFU的悬液，腹股沟皮下注射体重350～400g的豚鼠(Hartley品 系)5只，1ml/只。经14～15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种TSA平板，根 据其生长的菌落数，计算每克脾脏的含菌量，结果脾脏含菌为8.9×10³CFU，不超过20万CFU (强毒株的判断标)。

(4)粗糙型特性热凝集试验、吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染试验结果符合粗糙型 布鲁氏菌的特点，即热凝集试验阳性，吖啶黄凝集试验阳性，能被结晶紫染。

(5)安全检验将RA343活菌用生理盐水稀释成1ml含活菌10亿CFU，皮下注射体重18～ 20g的小白鼠5只，每只0.1ml，观察6日，均全部健活。

(6)免疫原性用生理盐水将RA343稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重 350～400g的豚鼠10只，每只0.1ml。30日后，用3个最小感染量的强毒牛种布鲁氏菌2308 株菌(即为CVCC788株，由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保藏和供应)约30个CFU接种 攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，80％以上的豚鼠均未分离到细菌。

(7)遗传稳定性RA343在TSA培养基上传30代，每5代对其形态和生化特性、培养 特性、粗糙型特性、毒力、PCR特异性、安全性及免疫原性进行检验，结果均未发生改变(表 1)。

表1布鲁氏菌RA343株遗传稳定性测定结果

测毒代次 形态和生化特性 培养特性 粗糙型特性 PCR特异性 脾脏含菌量 保护率

原代 G-，球杆菌，H ₂S+ TAB生长良好 粗糙型 牛种 8.9×10 ³CFU 80％

5 G-，球杆菌，H ₂S+ TAB生长良好 粗糙型 牛种 7.7×10 ³CFU 80％

10 G-，球杆菌，H ₂S+ TAB生长良好 粗糙型 牛种 7.9×10 ³CFU 80％

15 G-，球杆菌，H ₂S+ TAB生长良好 粗糙型 牛种 6.1×10 ³CFU 80％

20 G-，球杆菌，H ₂S+ TAB生长良好 粗糙型 牛种 8.4×10 ³CFU 90％

25 G-，球杆菌，H ₂S+ TAB生长良好 粗糙型 牛种 7.2×10 ³CFU 80％

30 G-，球杆菌，H ₂S+ TAB生长良好 粗糙型 牛种 6.3×10 ³CFU 90％

4.疫苗制备与质量标准

(1)按布鲁氏菌S2株作为生产菌株生产布鲁氏菌病活疫苗的常规方法，接种于适宜培 养基，收获培养物，加适宜冻干保护剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗(中华人民共和国农业 部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2001，本发明简称 《规程》)。用于预防动物布鲁氏菌病。用胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)或用于布鲁氏菌 S2菌株疫苗生产用培养基(如马丁汤、胰眎肉汤、肝汤等)均可作为本发明的疫苗生产用培 养基。培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入RA343种子菌液，37℃培养48～72h，加入 兽用生物制品常用的蔗糖明胶稳定剂，充分混匀、分装于疫苗瓶中后立即进行冷冻真空干燥， 即成为RA343活疫苗，命名为布鲁氏菌病活疫苗(RA343株)。冷冻真空干燥后的疫苗按质 量标准立即进行成品检验。

(2)质量标准本标准涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委 员会.中华人民共和国兽药典二○一〇年版(三部).中国农业出版社，2011，本发明称《中 国兽药典》)的方法进行。

1)疫苗应为疏松团快，加入稀释液后能迅速(1min内)溶解；

2)疫苗应纯粹无其他细菌；

3)将疫苗稀释成每1ml含1×10⁹CFU活菌，腹股沟皮下接种18～20g的昆明系小白鼠5 只，各0.25ml/只，观察6日，应全部健活；

4)对疫苗进行活菌计数，应不低于核定的头份数。猪：200亿/头份，羊：200亿/头份， 牛：800亿/头份。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明中涉及的微生物资源为牛种布鲁氏菌RA34株，该株菌是2009年本实验室从山东 某奶牛场流产牛体内分离到一株牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)分离株A343株的诱导和 驯化而获得一株粗糙型弱毒菌株，该株均已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号 为：CGMCC No.8886；牛种布鲁氏菌2308株菌(即为CVCC788株，由中国兽医微生物菌种 保藏管理中心保藏和供应，见中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著. 中国兽医菌种目录第二版，中国农业科技出版社，2002，p24.)

附图说明

图1RA343株PCR种属鉴定结果图中1：Mareker2000；2:大肠杆菌O157对照；3.RA343 菌PCR结果。

本发明的优点

本发明涉及一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗。该布鲁氏菌弱毒株是通过抗菌素和单因子血 清相结合的诱导方法，将由临床分离的一株中等毒力的牛种布鲁氏菌诱导成遗传稳定的粗糙 型布鲁氏菌RA343株。RA343不仅保留了对布鲁氏菌病良好的免疫效果，而且有效提高了其 安全性。以此菌株生产疫苗将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状。

实施例

本实施例为进一步说明本发明的技术方案，不对本发明构成限制。

实施例1

胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)或其它适宜培养基作为粗糙型布鲁氏菌疫苗株(RA343) 的培养基，按培养基量加入适量的常用消泡剂，灭菌后按培养基量的1％～2％接入RA343 种子菌液，在36～37℃逐渐加大通气量，按常规方法发酵培养36h，，培养过程中可根据需要 加入50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的1％～2％。

培养完成，取样用胰大豆琼脂按《中国兽药典》规定的方法作纯粹检验，均为纯粹。同 时取样用TSA培养基进行活菌计数，供浓缩时参考。

将纯粹检验合格的菌液，按总量0.1％～0.2％加入羧甲基纤维素钠，使菌体沉淀，吸去上 清液，置2～8℃暂存，待分装。

取浓缩的菌液按《中国兽药典》规定的方法进行纯粹检验，为纯粹。

取浓缩的菌液按《中国兽药典》规定的方法用TSA进行活菌计数，作为配苗时的参考。

经检验合格的菌液，按其菌数加入兽用生物制品常用的pH7.0蔗糖明胶稳定剂(见《规 程》)，使其最终含量为5％～10％蔗糖和1％～1.5％明胶，加入最终含量为1％～3％的硫脲，也可 使用其它合适的冻干保护剂。充分混匀后按800亿～1000亿/ml的剂量定量分装。分装后疫 苗瓶迅速冷冻真空干燥后即成为粗糙型布鲁氏菌病活疫苗(RA343株)。

实施例2

成品检验，其中的疫苗是按本发明提供的技术方案制备的。

本发明涉及到的相关检验方法按《中国兽药典》的方法进行

(1)物理性状疫苗应为疏松团快，加入稀释液后均于1min内能迅速溶解；

(2)纯粹检验疫苗均纯粹无其他细菌；

(3)安全检验 将疫苗稀释成每1ml含1×10⁹CFU活菌，腹股沟皮下接种18～20g的 昆明系小白鼠5只，各0.25ml/只，观察6日，均全部健活(结果见表2)；

表2布鲁氏菌病活疫苗(RA343株)安全检验结果

-：健康存活，注射部位无异常；+：死亡或发病。

(4)活菌计数用TSA培养基进行活菌计数对疫苗进行活菌计数，每头份活菌数均不低于 核定的头份数。

(5)免疫原性用生理盐水将RA343株活疫苗稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下 注射体重350～400g的豚鼠10只，每只0.1ml。30日后，用3个最小感染量的强毒牛种布鲁 氏菌2308菌株(约30个CFU)接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培 养，80％以上的豚鼠均无强毒出现，结果见表3。

表3布鲁氏菌病活疫苗(RA343株)免疫原性检验结果

注：+：分离到菌，判为不保护；-：未分离到菌，判为保护。*：小鼠编号

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