一种利用单针藻生产微藻油脂的方法

一种利用单针藻生产微藻油脂的方法

技术领域

本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种利用单针藻生产微藻油脂的方法。

背景技术

由于世界石油资源的枯竭和价格逐渐走高、环保问题日益严峻，以及全球气候变化引发一系列的影响，20世纪70年代以来，许多国家日益重视生物能源和生物基化学品的发展。在众多的生物质能和生物质化学品中，微藻凭借其“不与人争粮，不与粮争地”的优势得到了越来越多的关注。

藻类是最原始的生物之一，分布很广，大多数藻类生活在水中，其结构简单，具有光合效率高、生长周期短和速度快的特点。藻类包括微藻（单细胞真核生物）、大型藻（海藻）和蓝细菌（蓝绿藻）。不同藻类可通过光合作用将CO₂和水转化为O₂和大分子有机物，如碳水化合物和油脂。微藻的培养不与农作物争地争水，可以利用废水中N、P等营养，从而降低水体的富营养化，节约水资源和营养盐成本。因此，利用非粮且可再生的微藻为原料生产能源和化学品，与其它生物质相比，一定程度上能够降低成本，同时也为微藻下游产品的开发提供了一个新的途径。

单针藻是绿藻的一种，为不规则的纺锤形，目前发现的单针藻仅用于积累油脂。CN103540533A公开了一种产油单针藻LB59的获得及应用，自野外环境分离获得，能够耐受高浓度碳酸氢钠，易于进行开放式培养，富含油脂，油脂含量可达到细胞干重的30.2%。CN103555584A公开了一种产油单针藻LB50的获得及应用，能够耐受高浓度碳酸氢钠，油脂含量可达到细胞干重的30.4%。CN104073437A公开了一种单针藻C29，其生长速度快，油脂产率高，是生产生物柴油的优良菌株；该发明还提供了一种单针藻的开放式养方法，此方法采用特定培养基培养，更利于单针藻C29的生长及油脂的积累。CN104611228A公开了一种富含油脂的单针藻（Monoraphidium sp）SS-B1及其培养应用，保藏编号为CGMCCNo.7479，该藻株能够耐受高浓度的CO₂和SO₂，可以利用含CO₂和SO₂的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，固碳效率高，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。

但是，上述单针藻仅用于生产油脂，产品单一，应用范围窄。目前还没有发现既可以产淀粉又可以产油脂的单针藻。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种利用单针藻生产微藻油脂的方法。本发明方法有助于藻细胞的增殖和油脂积累，可获得高油脂含量的藻细胞，具有工艺简单、成本低、产出高等特点。

本发明利用单针藻生产微藻油脂的方法，包括如下内容：

（1）制备微藻种子液，所述的微藻为单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06，已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10765；

（2）将单针藻种子液接入富含N元素的微藻培养基中，培养到对数生长期停止，静置沉降后排出上清液，获得藻细胞；

（3）将步骤（2）得到的藻细胞接入低含N元素的微藻培养基中，并在培养基中添加ADP葡萄糖焦磷酸酶抑制剂，连续光照培养至稳定期，获得富含油脂的藻细胞。

本发明步骤（1）采用CN201510503226.8所述的的单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 10765；保藏日期：2015年4月24日。

本发明步骤（1）制备微藻种子液采用的微藻培养基为常规培养微藻的培养基，如可以是BG11、SE、TAP或D1等淡水微藻培养基。微藻种子液是指将微藻接入培养基后培养至对数生长期获得的藻液，具体培养条件如下：温度25-30℃，通气量0.1-1.0vvm，CO₂含量为1v%-3v%，搅拌转速50-200rpm，pH 6.0-9.0，光照强度为1000-10000lux，光暗比10:14 -14:10。

本发明步骤（2）中微藻种子液的接种量为培养基体积的2%-10%。具体培养条件同微藻种子液的培养条件。

本发明步骤（2）所述的富含N元素的微藻培养基是指在常规微藻培养基中加入过量无机氮，如可以是NaNO₃、NH₄NO₃、NH₄Cl等中的一种或几种，加入量为2.0-5.0g/L。

本发明步骤（3）所述的低含N元素的微藻培养基是指在常规微藻培养基加入上述微量无机氮，如可以是NaNO₃、NH₄NO₃、NH₄Cl等中的一种或几种，加入量为0-0.5g/L。优选与步骤（2）加入相同的无机氮。

本发明步骤（3）所述的ADP葡萄糖焦磷酸酶（AGPase）抑制剂可以采用无机磷酸盐，优选使用焦磷酸钠、焦磷酸钾或酸式焦磷酸钠等中的一种或几种，加入量为1-10mmol/L，优选为2-5mmol/L。更优选在培养基中同时加入乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）激活剂，如可以是柠檬酸或金属离子激活剂，如Mn²⁺，可以是新添加柠檬酸、Mn²⁺，加入量为1-200mmol/L，优选为30-50mmol/L；或者提高低氮微藻培养基中柠檬酸、柠檬酸铁铵或MnCl₂的含量，提高1%-10%。本发明在微藻培养基中加入AGPase抑制剂和ACCase激活剂，能够有效抑制淀粉合成，有助于促进油脂合成，从而提高微藻油脂产量。

本发明步骤（3）所述的微藻培养可以采用常规的培养方式，如可以采用微藻种子液的培养条件。优选采用以下方式培养：温度25-30℃，通气量0.1-1.0vvm，CO₂含量为3v%-5v%，搅拌转速50-200rpm，pH 7.0-8.0，光照强度为1000-10000lux。通过上述培养，有助于加速微藻对环境的适应性和快速增殖，从而有助于提高藻细胞中油脂含量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、利用新选育的单针藻SS-06在特定条件下生产微藻油脂，具有油脂含量高、工艺简单等特点。

2、通过对单针藻SS-06在培养过程中氮含量、碳含量、光照和pH的分段控制，有助于单针藻SS-06细胞的增殖和油脂积累，可获得高油脂含量的藻细胞。

3、在单针藻SS-06分段培养的第二阶段单独添加AGPase抑制剂，对单针藻SS-06油脂含量有一定改善，同时添加AGPase抑制剂和ACCase激活剂，可极大提高单针藻SS-06油脂含量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，但不因此限制本发明。本发明中，v%为体积分数。

本发明使用CN201510503226.8所述的单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06，已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10765。该藻株是2011年10月从黑龙江杜博尔特蒙古族自治县寿山休闲度假村龙虎湖的采集水样，筛选驯化得到。

本发明实施例使用过的微藻培养基为BG11培养基，具体配方见表1、表2。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

实施例1

（1）挑取平板上的单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06接入BG11培养基中，在温度30℃，通气量0.25vvm，CO₂含量为2v%，搅拌转速100rpm，pH为7.0，光照强度7000lux，光暗比14:10的条件下进行培养，培养至对数生长期获得微藻种子液。

（2）将微藻种子液按照接种量5v%接入富含N元素的BG11培养基中，富含N元素是指在BG11培养基中按照3.0g/L加入NaNO₃，培养到对数生长期停止，静置沉降后排出上清液，获得藻细胞。培养条件同步骤（1）。

（3）将步骤（2）得到的藻细胞接入低含N元素的微藻培养基中，低含N元素的微藻培养基是指在BG11培养基加入0.05 g/L的NaNO₃，并在培养基中添加3mmol/L的酸式焦磷酸钠，在温度30℃，通气量0.25vvm，CO₂含量为2v%，搅拌转速100rpm，pH为7.0，光照强度为7000lux条件下，连续光照培养至稳定期，收获藻液。

将上述藻液冷冻干燥后测得微藻生物量为2.3 g/L，油脂含量35.1%，淀粉含量19.5%。其中蛋白质检测方法为Bradford法测定。油脂检测方法为称量干燥的藻粉，重量计为m，放入瓷研钵中，加入适量石英砂和液氮，待液氮挥发后，研磨破壁；加入10mL乙酸乙酯:正己烷=1:1的混合有机溶剂，超声清洗仪处理20min，50-60℃恒温水浴中提取45分钟；离心15分钟，收集上清液至离心管中，重复提取两次，合并提取液；向提取液中加入等体积的蒸馏水，震荡混匀后离心4分钟，收集上层有机相至已烘干并准确称量净重（计为W1）的试管中；70-80℃水浴蒸发试管中的溶剂1.5h（至看不到液体状溶剂），70-80℃烘箱烘干至恒重，计为W2。计算藻细胞的总脂含量C（%）：C=100×（W2-W1）/m。淀粉检测方法为酶水解法，取藻粉（W）经600 W超声破碎，超声时间1s，间歇时间2s，超声60次，得到完全破碎的藻液；调节pH到6.5，分别加入0.20 μl Liquozyme Supra 85-95℃保温液化1 h；调节pH到4.5，分别加入0.4 μl Dextrozyme DX 60℃保温液化10h，水解完全后离心弃沉淀，上清液定容100mL，检测水解液中葡萄糖含量C；以去离子水加等量酶水解为对照；淀粉含量(g/g)=C(g/L)×V(L)×0.9/W(g)。

实施例2

（1）挑取平板上的单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06接入BG11培养基中，在温度25℃，通气量0.25vvm，CO₂含量为1v%，搅拌转速100rpm，pH为6.0，光照强度5000lux，光暗比14:10的条件下进行培养，培养至对数生长期获得微藻种子液。

（2）将微藻种子液按照接种量5v%接入富含N元素的BG11培养基中，富含N元素是指在BG11培养基中按照2.0g/L加入NH₄NO₃，培养到对数生长期停止，静置沉降后排出上清液，获得藻细胞。培养条件同步骤（1）。

（3）将步骤（2）得到的藻细胞接入低含N元素的微藻培养基中，低含N元素的微藻培养基是指在BG11培养基加入0.1g/L加入NH₄NO₃，并在培养基中添加2mmol/L的焦磷酸钾，在温度25℃，通气量0.25vvm，CO₂含量为1v%，搅拌转速100rpm，pH为6.0，光照强度为5000lux条件下，连续光照培养至稳定期，收获藻液。

将上述藻液冷冻干燥后测得微藻生物量为2.3 g/L，油脂含量33.7%，淀粉含量18.5%。

实施例3

（1）挑取平板上的单针藻（Monoraphidium sp.）SS-06接入BG11培养基中，在温度30℃，通气量0.25vvm，CO₂含量为3v%，搅拌转速100rpm，pH为8.0，光照强度8000lux，光暗比14:10的条件下进行培养，培养至对数生长期获得微藻种子液。

（2）将微藻种子液按照接种量5v%接入富含N元素的BG11培养基中，富含N元素是指在BG11培养基中按照2.5g/L加入NH₄Cl，培养到对数生长期停止，静置沉降后排出上清液，获得藻细胞。培养条件同步骤（1）。

（3）将步骤（2）得到的藻细胞接入低含N元素的微藻培养基中，低含N元素的微藻培养基是指在BG11培养基加入0.05g/L加入NH₄Cl，并在培养基中添加5mmol/L的焦磷酸钠，在温度30℃，通气量0.25vvm，CO₂含量为3v%，搅拌转速100rpm，pH为8.0，光照强度为8000lux条件下，连续光照培养至稳定期，收获藻液。

将上述藻液冷冻干燥后测得微藻生物量为2.5 g/L，油脂含量39.1%，淀粉含量15.4%。

实施例4

培养过程及操作条件同实施例1。不同之处在于：步骤（3）在培养基中同时添加50mmol/L 柠檬酸。冷冻干燥后测得微藻生物量为2.3g/L，油脂含量42.1%，淀粉含量10.2%。

实施例5

培养过程及操作条件同实施例2。不同之处在于：步骤（3）在培养基中同时添加Mn²⁺含量为50mmol/L 的MnCl₂。冷冻干燥后测得微藻生物量为2.3g/L，油脂含量40.5 %，淀粉含量11.1%。

实施例6

培养过程及操作条件同实施例3。不同之处在于：步骤（3）在培养基中同时添加含量为50mmol/L 的柠檬酸。冷冻干燥后测得微藻生物量为2.5g/L，油脂含量45.7 %，淀粉含量9.1 %。

实施例7

培养过程及操作条件同实施例1。不同之处在于：步骤（3）将CO₂含量提高至4v%，pH提高至7.5。冷冻干燥后测得微藻生物量为2.5 g/L，油脂含量37.2 %，淀粉含量20.1%。

比较例1

培养过程及操作条件同实施例1。不同之处在于：步骤（1）采用CN104611228A所述的单针藻。冷冻干燥后测得微藻生物量为2.2 g/L，油脂含量40.1 %，淀粉含量9.5%。

比较例2

培养过程及操作条件同实施例1。不同之处在于：步骤（3）培养基中不加入无机磷酸盐。冷冻干燥后测得微藻生物量为2.2 g/L，油脂含量30.3 %，淀粉含量17.8%。

比较例3

培养过程及操作条件同实施例1。不同之处在于：不更换培养基，始终使用BG11培养基。冷冻干燥后测得微藻生物量为2.2 g/L，油脂含量31.4 %，淀粉含量17.5%。