一种混合培养制备微藻油脂的方法

一种混合培养制备微藻油脂的方法

技术领域

本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种混合培养制备微藻油脂的方法。

背景技术

生物质能作为地球上最重要的可再生能源，它包括林业生物质、农作物、水生植物、农业废弃物等。在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。

随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO2的急剧增加引起的温室效应越来越严重。微藻的生长周期短、光合效率高，CO2固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10倍以上，不仅可以减少CO2排放，同时也降低了培养成本；除CO2外，废气中的一些SOx、NOx等成分也随着微藻的代谢被净化处理，可以有效减少有害气体排放。

目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株栅藻藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、素、淀粉、多糖、核酸的生产。CN20111019480.X公开了一株微藻藻株（Mychonases sp.）及其用于生产生物柴油的应用，利用该藻株可生产高附加值的多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸 C18:3和神经酸C24:1，其在获得生物柴油的同时，获得高附加值的副产品。CN102703326A公开了一种高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法，但该专利所提供的藻株并未涉及该藻株的油脂含量。CN102229889A公开了一株小球藻藻株Chlorella sp. MRA-1，MRA-1的生长可适应多种培养基、温度、氮源浓度、CO2浓度条件，在低氮条件下的油脂含量和产率高，其应用领域包括CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产。

但是在实际应用中，当环境中CO2体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，固碳效率低。同时，一般微藻在中性条件下适宜生长，在偏酸性或者偏碱性的条件下不利于微藻的生长，而微藻利用CO2一般是以溶解在水中的HCO3-离子形式存在的，二氧化碳在中性环境下溶解度低，不利于藻类吸收利用。而且，如果通入的化石燃料废气中含有高浓度的NOx等气体也会抑制微藻生长和降低固碳效率。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种混合培养制备微藻油脂的方法。本发明方法提高了微藻培养体系对高浓度CO2的耐受性和溶解性，提高了固碳效率，微藻油脂的收获量明显提高，有利于进行生物柴油的生产。

本发明混合培养制备微藻油脂的方法，包括如下内容：在光生物反应器中加入微藻培养基和混合微藻种子液，维持培养体系pH为8～12，优选为9～11，并通入体积含量为5v%～45v%的CO2，优选为10v%～30v%；其中混合微藻包括小球藻（Chlorella sp.）SF-B1，同时包括凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FSH-Y3或/和斜生栅藻（Scenedesmus obliqnus）FSH-Y2。其中小球藻（Chlorella sp.）SF-B1已经于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 11005，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明中，小球藻SF-B1在显微镜下藻细胞为绿，单细胞藻，单生，细胞形状为球形和椭圆形，内有素体，直径为5-6μm。小球藻SF-B1能够耐受的CO2浓度可达40v%，能够耐受的NOx的浓度可达700×10-6（v/v），可以利用含CO2和NOx的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，固碳效率高，耐受能力强。

本发明中，所述的斜生栅藻（Scenedesmus obliqnus）FSH-Y2已经于2012年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.6551，在CN104611227A中已公开，并提交了保藏及存活证明。

本发明中，所述的凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FSH-Y3已经于2014年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9238，在CN106467896A中已公开，并提交了保藏及存活证明。

本发明中，微藻培养基采用本领域技术人员熟知的BG11、SE、BBM等培养微藻的液体培养基。

本发明中，小球藻SF-B1种子液的制备方法如下：将培养基pH调节为7～9，在温度10～30℃，光照周期24h，光暗时间比14:10，光照强度2000～20000Lux，振荡培养至对数生长期。反应器中加入的小球藻SF-B1种子液与微藻培养基的体积比为1:20～1:5。

本发明中，凯氏拟小球藻FSH-Y3、斜生栅藻FSH-Y2的种子液的制备方法如下：将培养基的pH调节为10～12，在温度为20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux，振荡培养至对数生长期。光生物反应器中加入的凯氏拟小球藻FSH-Y3或/和斜生栅藻FSH-Y2种子液与微藻培养基的体积比1:20～1:5。当同时含两种微藻时，凯氏拟小球藻FSH-Y3和斜生栅藻FSH-Y2种子液的体积比为5:1-1:5。

本发明中，混合培养的温度为10～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～20000Lux。通入气体优选使用含CO2的废气或烟气，其中CO2含量为5v%～45v%，NOx含量不高于800×10-6（v/v）。混合培养至生长稳定期结束，通过离心、沉降等方式收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量，细胞干重可达到12g/L以上，油脂含量可达到细胞干重的45%以上。

与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：

（1）本发明将小球藻SF-B1与凯氏拟小球藻FSH-Y3或/和斜生栅藻FSH-Y2混合培养，提高了微藻培养体系对高浓度CO2的耐受性和固碳效率，微藻油脂的收获量明显提高。

（2）本发明在高pH环境下进行微藻的培养，能够增加培养体系中CO2的溶解度，有助于微藻对CO2的吸收利用，提高了固碳效率。

（3）本发明在高pH、低温环境下培养微藻，可以有效抑制微藻生长过程中杂菌的生长，有助于提高微藻油脂收率。

（4）本发明的混合培养体系能够耐受高浓度的CO2和NOx，可以利用废气中的CO2进行自养生长，固定CO2，净化烟气，缓解了目前工业社会带来的温室效应和废气污染问题。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。本发明中，wt%为质量分数，v%为体积分数，v/v为体积比。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。

本发明微藻种子液的制备过程如下：微藻培养采用BG11培养基，培养基配方如表1和表2所示。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

首先按照表1和表2制备BG11液体培养基，将培养凯氏拟小球藻FSH-Y3、斜生栅藻FSH-Y2的培养基的pH调节为10，将培养小球藻SF-B1的培养基的pH调节为8.0，然后将凯氏拟小球藻FSH-Y3、斜生栅藻FSH-Y2、小球藻SF-B1分别接种于上述培养基中。在恒温光照摇床中培养，培养温度为25℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为5000Lux，120rpm振荡培养至对数生长期，获得凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液、斜生栅藻FSH-Y2种子液、小球藻SF-B1种子液，将上述种子液在15℃弱光下保存备用。

实施例1

将上述制备好的的微藻种子液分别接种在BG11培养基进行微藻油脂的生产。在20L气升式光生物反应器中，凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液、小球藻SF-B1种子液按照体积比1:1的比例接种，按照20%的总接种量接种到BG11培养基中，pH值控制在8～11之间，通入氮气和二氧化碳的混合气体，其中二氧化碳含量为5v%～45v%，光照强度为5000Lux，培养温度为20℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养7天后处于稳定期，结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量，结果如表3所示。

表3混合藻与单一藻的培养效果比较

由表3可见，相对于单一藻种，混合藻种在高pH和高CO2浓度下，获得了更高的生物量和油脂含量。

实施例2

将上述制备好的的微藻种子液分别接种在BG11培养基进行微藻油脂的生产。在20L气升式光生物反应器中，斜生栅藻FSH-Y2种子液、小球藻SF-B1种子液按照体积比1:1的比例接种，按照20%的总接种量接种到BG11培养基中，pH值控制在8～11之间，通入氮气和二氧化碳的混合气体，其中二氧化碳含量为5v%～45v%，光照强度为5000Lux，培养温度为20℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养7天后处于稳定期，结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量，结果如表4所示。

表4 混合藻与单一藻的培养效果比较

由表4可见，相对于单一藻种，混合藻种在高pH和高CO2浓度下，获得了更高的生物量和油脂含量。

实施例3

将上述制备好的的微藻种子液分别接种在BG11培养基进行微藻油脂的生产。在培养体系中同时加入凯氏小球藻FSH-Y3种子液、斜生栅藻FSH-Y2种子液和小球藻SF-B1种子液，接种量分别为5%、5%、10%。其它过程和条件同实施例2，效果如表5所示。

表5混合藻的培养效果

由表5可见，在混合体系中同时加入三种微藻，培养效果有进一步提高。

实施例4

制备条件与实施例1、2、3相同，不同之处在于通入含NO、NO2和CO2的烟气，烟气中CO2的含量为10v%～45v%，NO和NO2含量为100×10-6～800×10-6（v/v），维持反应体系的pH为10。10天后结束培养，离心收集藻细胞，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量，结果如表6所示。

表6混合藻与单一藻的培养效果比较

由表6可见，相对于单一藻种，混合藻种不仅可以耐受高浓度的CO2，而且可以耐受并去除一定的NOx，同时获得了更高的生物量和油脂含量。由此可见，本发明方法可以利用混合藻及烟气制备微藻油脂，即实现了油脂的生产，同时可以净化废气。