拟香味类香味菌及其制备方法和应用

本发明涉及生物菌种技术领域，尤其是一种拟香味类香味菌，及其制备 方法和应用。

链格孢菌(Alternaria alternate(Fries)Keissler)是一类重要的植物病原 菌，寄主范围广，危害重，其引起的烟草赤星病是烟叶成熟后期重要的叶部 病害，在我国各烟区均有发生，直接影响了烟叶的产量和质量。关于烟草赤 星病的防治，目前国内主要以化学防治为主，但使用化学农药防治赤星病既 导致农药残留、环境污染，又可引起病菌产生抗药性以及严重的烟株药害。 生物防治由于其对环境友好而被认为是替代化学杀菌剂防治植物病害的良好 途径，因此生防资源的筛选、利用和创新对于植物病害的生物防治具有重要 意义。

微生物代谢产生的挥发性产物常具有抑菌、防病或兼具促生及诱导抗性 等作用，是一类重要的生防资源。McCain于1966年最早报道了灰链霉菌 (Streptomyces griseus)对Gleospriumaridum孢子形成具有抑制作用； Chen等研究发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生的挥发物能强烈抑制 灰霉病菌(Botrytis cinerea)孢子萌发和萌发管伸长；Koitabashi分离到的 Irpexlacteus产生的挥发物对Oiduim sp.引起的温室欧芹白粉病防治效果良 好；Zhang等发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GB03的挥发物能通过 增强拟南芥(Arabidopsis)的光合作用对其产生促生作用。与非挥发性抗菌 物质相比，挥发性抗菌物质具有渗透力强、分布均匀等优点，防治作物病害 效果更为突出、应用领域更为广阔；已有研究表明，包括真菌、细菌在内的 很多微生物都能产生挥发性抗菌物质。

生物防治由于其对环境友好，且具有良好的防治效果，近年来成为防治 植物病害的研究热点。拮抗微生物是一类重要的生防资源，其产生的拮抗物 质主要包括非挥发性代谢产物和挥发性代谢产物两种。目前，对于烟草赤星 病菌的生物防治大多集中在产非挥发性抗菌物质微生物的筛选和利用，而对 于产挥发性抗烟草赤星病菌代谢产物微生物的研究则较少。

本发明针对现有技术的不足，提出一种拟香味类香味菌，对烟草赤星病 有较好的抑制和效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种拟香味类香味 菌(Myroidesodoratimimus)的T45菌株，2014年4月30日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏号为CGMCC9116。

一种如上所述拟香味类香味菌T45菌株的制备方法，包括以下步骤：

(1)取烟草根际土壤，加入蒸馏水，摇动片刻，吸取上层液加入到无菌水 中，制成悬液；

(2)取步骤(1)土壤悬浊液滴加到含2～5％利福平的LB固体培养基平板上， 用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于28℃恒温培养箱培养1～2天。

优选的，所述LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、 氯化钠10g/L和琼脂粉15g/L。

优选的，(3)步骤(2)培养液涂布于LB固体培养基上28℃培养24h活化， 划线于LB肉汤培养液中28℃，150rpm震荡培养24h。

一种如上所述拟香味类香味菌T45菌株在对烟草赤星病菌的抑制方面的 应用。

优选的，包括以下步骤：

①.T45菌株的培养：取烟草根际土壤，加入蒸馏水，摇动片刻，吸取上 层液加入到无菌水中，制成悬液；取土壤悬浊液滴加到含2～5％利福平的LB 固体培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于28℃恒温培养箱 培养1～2天；分离到67株细菌，编号T1-T67，涂布于LB培养基上28℃ 培养24h活化，划线获得单菌落，挑取单菌落于LB肉汤培养液中28℃， 150rpm震荡培养24h；

②.病原菌培养：烟草赤星病菌边缘的菌丝块置于新鲜PDA培养基上25℃ 培养7d进行活化；

③.接种：在步骤②长满烟草赤星病菌的培养基上获得菌丝块，将其接种 到PDA培养基平板上25℃培养12h；吸取步骤①细菌培养液均匀涂布于LB 固体培养基平板上；将PDA培养基平板对扣置于LB固体培养基平板上方， 并用封口膜密封两块平板边缘，于25℃下培养5-7天。

优选的，所述LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、 氯化钠10g/L和琼脂粉15g/L。

优选的，所述PDA培养基组成为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂 15克和水1000毫升。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：拟香味类香味菌T45菌株产生 的挥发性代谢物能强烈抑制烟草赤星病菌的生长，主要通过抑制分生孢子形 成、孢子萌发、菌丝生长以及破坏菌丝形态的方式。

图1为烟草根际细菌对烟草赤星病菌生长不同抑制率的数量统计；

图2为细菌T45基于16S rDNA基因序列的分子系统发育树；

图3为T45对烟草赤星病菌的抑制作用图；

图片依从上至下从左至右排列顺序编号为A：正常生长的烟草赤星病菌， B：挥发物作用下赤星病菌生长缓慢，C：正常的孢子和菌丝，D：挥发物处理后， 未见分生孢子，E：扫描电镜下正常的菌丝和孢子，F：挥发物处理后未见分生 孢子，菌丝断裂、表面皱缩，G：对照分生孢子正常萌发长成菌落，H：分生孢 子萌发受挥发物抑制，未见菌落形成。

图4为T45产生的3种挥发物对烟草赤星病菌的抑制作用图

其中，图片依从左至右排列顺序为水、异戊醇、异丁酸、异戊酸对病原 菌的作用效果图。

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性 和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

实施例1

培养基：PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 琼脂15g，水1000mL。

供试病原菌：烟草赤星病菌(Alternaria alternate)由中国农业科学院烟 草研究所植保科室提供。试验前，挑取冰箱中保存的病原菌边缘的菌丝块置 于新鲜PDA培养基上25℃培养7d进行活化。

供试细菌菌株：采用土壤稀释法，从湖南省采集到的烟草根际土壤中分 离到67株细菌，编号T1-T67，-20℃甘油保存。使用前，吸取刚解冻的细 菌培养液涂布于LB培养基上28℃培养24h活化，划线获得单菌落。对扣试 验前，挑取单菌落于LB肉汤培养液中28℃，150rpm震荡培养24h。

实施例2拮抗细菌初筛

用平板对扣法测试67株细菌对烟草赤星病菌的抑制作用。用直径5mm 打孔器在长满烟草赤星病菌的培养基上打孔获得菌丝块，将其接种到新的 PDA平板上25℃培养12h，使其固着在培养基上。吸取震荡培养24h的细 菌培养液100μL均匀涂布于LB平板上，将含有赤星病菌的PDA平板对扣 置于LB平板上方，并用Parafilm封口膜密封。以未涂布菌液的LB平板作 为对照。将不同处理的对扣平板用保鲜袋密封，于25℃下培养5-7天，至对 照组赤星病菌菌丝长满2/3平板时，用十字交叉法测量赤星病菌菌落直径， 计算细菌挥发物质对其抑制率。每个处理5个平板，实验重复两次。选取抑 制率最高的菌株进行下一步研究。

生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径 ×100％

从烟草根际土壤中分离获得67株细菌，平板对扣试验发现，分离细菌 所产挥发物对烟草赤星病菌产生不同程度的抑制作用(图1)。42株细菌对 赤星病菌的抑制率达30％以上，19株细菌的抑制率达到50％以上，4株细 菌抑制率达70％以上，分别为T46(71.19％)、T57(72.83％)、T64(76.56％)、 T45(78.89％)，选取抑制率最高的菌株T45做进一步研究。

实施例3细菌的16S rDNA鉴定

采用16S rDNA序列测定以及构建进化树的方法对筛得的高抑制率细菌 进行分子鉴定。利用细菌基因组提取试剂盒(上海生工)提取细菌基因组DNA， 以此为模板，用引物27F：(5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGCT-3’)和 1492R：(5’-TACGGCTACCT TGTTACGACTTCACCCC-3’)对菌株16S rDNA进行扩增。获得的PCR产物经纯化后送往生工生物工程上海有限公司 进行序列测定，见下方序列表。测序结果于NCBI数据库中进行BLAST同 源性比对分析，用Clustal1.83进行多重序列对比，用Mega4.0中 Neighbor-Joining法构建系统发育树。

GCCAACCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAGGGGTAGAAAGAGC TTGCTTTTTTGAGACCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTATGCAACCT ACCTTATACAGGGGAATAGCCCGAAGAAATTCGGATTAATGCTCCAT GGTTTATCGATATGGCATCGTATTGATAATAAAGATTTATCGGTATAA GATGGGCATGCGTATCATTAGCTAGTTGGTGTGGTAACGGCATACCA AGGCAACGATGATTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGG TACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAAT ATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAGCCATGCCGCGTGCAGGA TGACGGTCCTATGGATTGTAAACTGCTTTTGTACAGGAAGAAACCTCC CTACGAGTAGGGACTTGACGGTACTGTAAGAATAAGGATCGGCTAAC TCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCG GAATTATTGGGTTTAAAGGGTTCGTAGGCGGCTTTGTAAGTCAGTGG TGAAATTTCCTAGCTTAACTAGGACACTGCCATTGATACTGCAGAGCT TGAATAATATGGAAGTAACTAGAATATGTAGTGTAGCGGTGAAATGCT TAGATATTACATGGAATACCAATTGCGAAGGCAGGTTACTACGTATTT ATTGACGCTGATGAACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTTCGGTTTT CGGACTGAGTGGCTAAGCGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAG TACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTAC CAGGGCTTAAATGTAGATTGACAGATTTGGAAACAGATTTTTCTTCGG ACAATTTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGG TGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTACCA GCGCGTAGTGGCGGGGACTCTAGCAAGACTGCCGGTGCAAACCGTG AGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGG GCTACACACGTGCTACAATGGCAAGTACAGAAAGCAGCTACCTGGCA ACAGGATGCGAATCTCCAAAGCTTGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTG CAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGGATATCAGCC ATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAA GCCATGGAAGCTGGGGGTACCTGAAGTCGGTGACCGCAAGGAGCTG CCTAGGGTAAAGCTTG

提取细菌基因组DNA，扩增后送测序获得其16S rDNA序列，提交NCBI 数据库进行比对，其序列与拟香味类香味菌(Myroidesodoratimimus)相似 性达99％，构建系统进化树，如图2所示，确定其分类地位为拟香味类香味 菌，获得Genbank登录号KF758445。

实施例4筛得细菌对烟草赤星病菌的抑制作用

对菌丝生长的影响：将获得的高抑制率细菌按1.3中方法与烟草赤星病 菌对扣培养至对照组病菌菌丝长至2/3平板。从培养平板边缘切取病原菌菌 落，3％戊二醛固定4h，0.1M磷酸缓冲液漂洗。1％锇酸固定90min，0.1M 磷酸缓冲液漂洗，酒精梯度脱水，在30％、50％、70％、80％、100％依次 脱水，其中100％酒精2次，每次10min。乙酸异戊脂置换，50％一次，100％ 两次。Eiko公司XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司IB-3型离子 镀金仪喷金镀膜。JEOL公司JSM-840扫描电镜观察。同时，用无菌接种针 挑取边缘菌丝均匀涂布于无菌载玻片中央的无菌水中，光学显微镜下观察菌 丝形态变化，每个处理至少观察5个视野。

对分生孢子的影响：接种烟草赤星病菌在PDA培养基上26℃培养5～7d， 用无菌水洗下，3000r/min离心3min去除菌丝，取上清液即为孢子悬液，稀 释至浓度为102个/mL。吸取100μL孢子悬液均匀涂布于PDA培养基上， 将筛得细菌的培养液涂布于LB平板上，两平板按按1.3中方法进行对扣培 养，以不接种细菌的LB平板作为对照。

如图3所示的菌株T45对烟草赤星病菌的抑制效果图。培养5d时，对 照组烟草赤星病菌长满2/3皿(图3-A)，而与T45菌株对扣培养的PDA平 板中，赤星病菌生长缓慢，菌落呈黄白，抑制效果明显(图3-B)。挑取两 培养皿中病原菌边缘菌丝于显微镜下镜检观察，发现对照赤星病菌产生大量 分生孢子，菌丝透明均匀细长(图3-C)，而经挥发物处理的赤星病菌在镜检 时未发现有分生孢子，由于放大倍数较低菌丝形态变化不直观(图3-D)。扫 描电镜镜检则可以明显观察到正常生长的赤星病菌孢子呈倒棒锤形，菌丝细 长均匀、表面光滑(图3-E)，挥发物处理后则观察不到任何孢子，菌丝断裂、 表面发生皱缩，菌丝形态遭到破坏(图3-F)。孢子涂布实验显示对照孢子萌 发长成菌落(图3-G)，而经挥发物处理的平板上无菌落形成(图3-F)，说 明挥发物对病菌孢子萌发也具有一定抑制作用。因此，菌株T45产生的挥发 性物质主要通过抑制烟草赤星病菌孢子产生、孢子萌发，菌丝生长以及破坏 菌丝形态的方式对病原菌产生抑制作用。

实施例5挥发性抑菌物质的GC/MS分析

利用顶空固相微萃取-气相谱/质谱联用法测定细菌产生的挥发性化合 物。在15mL顶空样品瓶中加入9ml细菌培养液和0.1g硫酸钠，放入磁力 搅拌子，将小瓶固定在恒温水浴池中，将75μm CAR/PDMS纤维头穿透样品 瓶胶塞，压下活塞使纤维头伸出不锈钢套管暴露于样品上层空气中，于50℃ 中速磁力搅拌平衡1h，以LB培养液的挥发物作为对照。萃取后，迅速将纤 维头缩回并拔出针头，立即插入气相谱的气化室，推出纤维，250℃解吸 2min。GC/MS条件参考文献中做法。采用NIST08谱库进行检索，相似度≥80％ 鉴定为同种化合物。

实施例6化合物单体试验

根据GC/MS分析结果，购买相应化合物的纯品试剂，用分隔平板法测 试其对烟草赤星病菌的抑制效果：在一个两分格的塑料平板中一侧倒入PDA 培养基，接种直径为5mm的赤星病菌菌饼，另一侧加入100μL纯品试剂， 以无菌水作为对照。封口膜密封，置于25℃培养5-7天至对照组菌丝长满 2/3平板，用十字交叉法计算生长抑制率。

用SPME-GC/MS对菌株T45以及LB液体培养基产生的挥发性化合物 进行分析。所得质谱图经NIST08质谱数据库检索并与标准图谱对比，在T45 挥发物中共鉴定出24种化合物，对照中检出19种化合物，分别属于醛类、 酮类、烷烃类、醚类、醇类、酯类、酸类物质，其中十六酸和十八酸在T45 和对照中含量均较高，因此共选定仅在T45中检出的化合物以及十六酸和十 八酸，购买其纯品试剂进行测试。除6种未获得纯品试剂外，共测试了10 种挥发物对烟草赤星病菌的抑菌效果(表1)。由于十五酸、十六酸、十八酸 为固体，故用甲醇溶解后配成10mg/mL的溶剂进行试验。在测试的十种化 合物中异戊醇、异丁酸、异戊酸对病原菌的作用效果十分显著，几乎完全抑 制了病原菌的生长(图4)，苯甲醇对病原菌具有显著抑制作用，而八甲基环 四硅氧烷、2-十三烷酮、δ-十二内酯则无明显抑菌活性。

表1 细菌挥发物纯品的抑菌作用

本试验利用平板对扣法从烟草根际土壤分离获得的细菌中筛选能够产生 抗烟草赤星病菌的挥发性代谢产物的菌株，获得了一株对烟草赤星病菌具有 高抑制率的细菌，经16S rDNA鉴定为拟香味类香味菌。该菌属于黄杆菌纲 (Flavobacteria)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，已有报道表明，拟香味类香 味菌的非挥发性代谢产物对于半夏软腐病菌(Pectobacteriumcarotovorum  subsp.Carotovorum)和四种病原真菌以及烟草黑胫病病原菌烟草疫霉 (Phytophthoranicotianae)均具有拮抗作用，关于其产挥发性抗真菌物质 本文为首次报道，此前已报道产生具有抗真菌活性挥发物的细菌主要有链霉 菌属、假单胞菌、沙雷氏菌属以及芽孢杆菌等。

挥发性代谢产物主要通过抑制菌丝生长、孢子萌发和孢子形成以及导致 畸变等方式对病原菌产生抑制作用。研究表明，不同挥发物对不同病原菌的 作用方式不同。周翠等研究一株枯草芽孢杆菌所产挥发物对几种病原菌菌丝 的抑制作用发现苹果轮纹病菌(Botryosphaeriadothidea)和葡萄白腐病菌 (Coniothyriumdiplodiella)表现为菌丝分支增多、扭曲、菌丝顶端和中部细胞 膨大，对杨树腐烂病菌(Valsasordida)及桑紫纹羽病菌 (Helicobasiduimpurpureum)表现为菌丝变粗而对合欢枯萎病菌 (Fusariumoxysporum)则为菌丝变细。Chaurasia等观察枯草芽孢杆菌挥发 物对几种真菌菌丝和孢子形态的影响发现经挥发物处理后A.alternata内纵、 横分隔完全消失，分生孢子细胞壁增厚并呈现球形或其他不规则形状；张成 省等研究枯草芽孢杆菌Tpb55挥发物对赤星病菌抑制作用主要表现在抑制 菌丝生长和分生抱子的产生；本试验中，拟香味类香味菌产生的挥发物能明 显抑制烟草赤星病菌孢子产生、萌发以及菌丝生长，并导致菌丝形态破坏。

利用SPME-GC/MS分析挥发性化合物的成分组成，发现拟香味类香味 菌产生挥发性代谢产物主要由醇类、醛类、酸类、酮、酯、烷烃组成，这与 以往研究细菌挥发物组成成分结果相似。Li等研究Streptomyces  globisporus挥发物对柑橘青霉病菌(Penicilliumitalicum)作用发现二甲基 二硫醚、二甲基三硫醚和苯乙酮可抑制菌丝生长，并且抑制作用随着浓度的 增加而增强，Fernando等则发现苯并噻唑、环己醇、正癸，二甲基三硫醚，乙 基己醇和壬醛能完全抑制Sclerotiniasclerotiorum菌丝生长或菌核形成； Zhang等发现Actinoplanes sp.产生的5-羟基-5-甲基-2-乙烯酸对灰霉病菌， 黄瓜黑星病(Cladosporiumcucumerinum)和黄瓜褐斑病菌 (Corynesporacassiicola)都具有很强的抑制活性。研究表明挥发物的抑菌 活性通常是有机酸＞醛类＞醇类＞醚类＞酮类＞酯类＞内酯。本发明利用分隔平 板法对化学物单体的抑菌能力进行测试，发现苯甲醇对病原菌具有显著抑制 作用，而异戊醇、异丁酸、异戊酸能完全抑制病原菌的生长。Hitoshi等报道 由酵母菌产生的异戊醇能抑制所测真菌的孢子萌发，以往研究表明异丁酸是 内生真菌挥发物中的主要成分，很可能具有抑菌活性。对于异戊酸抑制病原 真菌生长则尚未见报道。对于三种挥发物应用于烟草赤星病菌的生物防治还 有待于进一步的研究。

Ryu等首次报道细菌挥发物二丁醇和乙酰甲基原醇能促进拟南芥的生长， 近来研究发现根际细菌产生的挥发性代谢产物能够促进植物生长的现象在自 然界中普遍存在，Farag等报道称许多支链醇类(主要为异戊醇、2-甲基-1- 丁醇以及它们的轭合物)也很有可能具有促生作用。Hung等研究表明绿 木霉(Trichodermaviride)挥发物对拟南芥具有显著促生作用，其挥发物中 含量最高的成分之一即为异戊醇。本实验中拟香味类香味菌的抑菌活性成分 异戊醇、异丁酸、异戊酸，其对植物的促生现象有待进一步深入研究。

本申请从烟草根际土壤中筛选获得一株拟香味类香味菌，其产生的挥发 性代谢物能强烈抑制烟草赤星病菌的生长，主要通过抑制分生孢子形成、孢 子萌发、菌丝生长以及破坏菌丝形态的方式。对挥发物进行SPME-GC/MS 鉴定表明挥发物含醇类、醛类、酸类、酮类、酯类、烷烃等组分，其中异戊 醇、异丁酸、异戊酸具有强抑菌活性。