一株无杆菌及其不对称催化还原碳碳双键的方法

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一株无杆菌并应用该菌转化(Z)‑3‑芳基‑3‑氰基‑丙烯酸，环状酰亚胺和不饱和硝基化合物制备光学纯缺电子烷烃化合物的方法，是无杆菌属首次应用于不对称催化还原碳碳双键。 

光学纯缺电子烷烃化合物是有机合成中的重要合成块，可以用来制备光学纯手物。碳碳双键还原酶(enoate reductase)不对称催化还原带有强吸电子基团的碳碳双键，可同时得到具有一个或两个手性中心的光学纯缺电子烷烃化合物，是广泛用来制备手性缺电子烷烃类的方法之一(Stuermer et al.2007 Asymmetric bioreduction of activated C＝C bonds using enoate reductases from the old yellow enzyme family.[Review].Curr Opin Chem Biol 11：203‑213)。近几十年来，随着不对称催化还原带有强吸电子基团的碳碳双键的快速发展，越来越多合成家开始关注碳碳双键还原酶的新酶源的开发及底物谱的扩增。经过数十年的探索，已经从许多不同的生物来源中得到了碳碳双键还原酶，如高等植物(地钱，长春花，烟草，番茄等)，细菌和真菌(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases.Chemcatchem 2：892‑914)。由于微生物具有培养简单，周期短等特点，所以在全细胞催化的生物转化中，绝大数为微生物。相比之下，植物细胞培养比较复杂，不仅需要光照，而且周期较长，因此很少用于生物转化中。 

碳碳双键还原酶不对称催化还原的底物类型主要有：烯醛、烯酮、炔酮、不饱和硝基、不饱和硝基酯、不饱和腈、不饱和羧酸及其衍生物(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases.Chemcatchem 2：892‑914)。与生物催化羰基还原相比，生物催化碳碳双键还原的研究较少，商品化的碳碳双键还原酶更少(Chaparro‑Riggers et al.2007Comparison of three enoate reductases and their potential use for biotransformations.Adv Synth Catal 349：1521‑1531)。其主要原因是酶的活力低、稳定性差，不适合应用。因此，新型酶源的发掘对于发展碳碳双键还原酶具有重要意义。 

本发明的目的是公开一株无杆菌，该菌于2011年10月31日在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC M 2011369，分类命名：Achromobacter sp.JA81， 并利用该菌具有生产高活力、高对映选择性的碳碳双键还原酶的特性，还原底物(Z)‑3‑芳基‑3‑氰基‑丙烯酸制备光学纯(R)‑3‑芳基‑3‑氰基丙酸，该(R)型产物是合成光学纯γ‑氨基丁酸的关键手性中间体。同时，该菌还可以催化环状酰亚胺和不饱和硝基化合物制备光学纯缺电子烷烃类化合物。为无杆菌首次用于不对称催化还原碳碳双键。 

本发明无杆菌(Achromobacter sp.JA81)的筛选方法： 

以柠檬醛和(Z)‑2‑苯基丁‑2‑烯腈为唯一碳源对来自成都龙泉果园和四川师范大学果园的土壤样品进行富集，得到纯培养菌株46株，以此46株菌株对模式底物马来酰亚胺进行生物转化，得到活力菌株16株，将此16株菌株对目标底物(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸进行生物转化，对目标底物有活性的菌株进行进一步的鉴定。经筛选得到本发明涉及的无杆菌JA81。具体方案见实施例。 

以无杆菌JA81作为生物催化剂，转化目标底物(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸生成相应的(R)‑3‑苯基‑3‑氰基丙酸。具体方法如下： 

1.菌株培养： 

斜面保存培养基组分为：胰蛋白胨1g/100mL；酵母提取物0.5g/100mL；NaCl 1g/100mL；琼脂粉2g/100mL； 

液体发酵培养基组成为：胰蛋白胨1g/100mL；酵母提取物0.5g/100mL；NaCl 1g/100mL； 

溶于去离子水，用NaOH调pH值为7.0，105kPa，121℃，灭菌20分钟。 

斜面培养：将筛选得到的纯培养菌株接种于斜面保存培养基上，30℃培养24‑48h； 

种子培养：将单菌落无菌条件下用灭菌头接种于约10ml液体发酵培养基中，30℃，230rpm，培养24h，制得种子液； 

摇瓶培养：以1％的接种量将种子液接入新鲜的液体发酵培养基中，30℃，230rpm，培养36h。 

2.收集菌体：取步骤(1)中的摇瓶培养的菌液在4℃、7000转/分钟条件下离心8分钟，收集菌体，并用浓度为0.79g/100mL的生理盐水充分洗涤2次，得到湿菌体作为生物催化剂。 

3.生物转化：将步骤(2)中得到的湿菌体以pH7.0、0.1M磷酸钾缓冲液配成细胞浓度为100‑300g/L的菌悬液，加入底物(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸(底物溶于二甲亚砜，用量为100g/L)，终浓度为1‑10g/L，按每100mL加入1g的葡萄糖和5mL的异丙醇作为辅酶再生底物。生物转化条件为：30℃，230rpm，转化时间为48h。 

4.分离样品：调反应液pH为6.0‑6.5左右，分别用一倍体积的乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得产品经Steglich酯化(Neises and Steglich 1978 Simple Method for the Esterification of Carboxylic Acids.Angew Chem Int Ed 17： 522‑524)，得到甲酯化产物，分离纯化，所得物充分溶于1mL异丙醇(HPLC级)溶剂为备用检测样品。 

5.HPLC检测：取步骤(4)中1μL样品进样，利用手性谱柱测定(R)‑3‑苯基‑3‑氰基丙酸甲酯的含量，最后计算ee值。 

检测ee值时手性谱柱为Daicel Chiralcel OD‑H(250×4.6mm)，流动相：正己烷∶异丙醇＝90∶10，流速0.8ml/min，(R)‑3‑苯基‑3‑氰基丙酸甲酯和(S)‑3‑苯基‑3‑氰基丙酸甲酯的保留时间分别为11.480min和14.809min。其反应式如下： 

生物催化的底物包括(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸或(Z)‑3‑(4‑氯芳基)‑3‑氰基‑丙烯酸或2‑甲基‑N‑苯基‑马来酰亚胺或(E)‑2‑苯基‑1‑硝基‑1‑丙烯或(E)‑1‑苯基‑2‑硝基‑1‑丙烯或(E)‑2‑氰基‑3‑苯基‑丙烯酸 

本发明的催化剂无杆菌菌体易于制备，反应条件温和，是绿制造手性缺电子烷烃化合物的有效方法之一。 

图1是3‑苯基‑3‑氰基丙酸甲酯标样手性HPLC图谱。保留时间为11.480min的峰为(R)‑3‑苯基‑3‑氰基丙酸甲酯，保留时间为14.809min的峰为(S)‑3‑苯基‑3‑氰基丙酸。 

图2是利用无杆菌JA81转化底物(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸生成(R)‑3‑苯基‑3‑氰基丙酸经衍生化后成(R)‑3‑苯基‑3‑氰基丙酸甲酯的HPLC图谱。 

实施例1菌种筛选 

取1克土壤样品加入到装有50ml无机盐培养液(成分如下：KH2PO4 0.1g/100mL，Na2HPO4 0.2g/100mL，MgCl2 0.04g/100mL，NH4Cl 0.04g/100mL)的三角瓶中，再加入100μL的柠檬醛；另取1克土壤样品加入到装有50ml无机盐培养液(成分如下：KH2PO4 0.1g/100mL，Na2HPO4 0.2g/100mL，MgCl2 0.04g/100mL，NH4Cl 0.04g/100mL)的三角瓶中，再加入100μL的(Z)‑2‑苯基丁‑2‑烯腈；分别富集培养(30℃，230rpm)，7天后各取出1mL在同样的条件下进行二次富集培养8天。之后加入双蒸水9mL稀释后涂布平板，(平板培养基的组分为：胰蛋白胨1g/100mL；酵母提取物0.5g/100mL；NaCl 1g/100mL；琼脂粉2g/100mL，并且每个平板表面涂布各100μL的柠檬醛或(Z)‑2‑苯基丁‑2‑烯腈)，30℃恒温培养箱培养24‑48h，经进一步纯化，最终共得到46株纯培养菌株。 

将这些纯培养菌株以模式底物马来酰亚胺(取新鲜培养的湿菌体1g，悬浮于10ml磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，加入500μL异丙醇和500mg葡萄糖和10mg底物马来酰亚胺(底物溶于二甲亚砜，用量为100g/L)。于摇床(30℃，230rpm)震荡反应48h，反应完成后，反应液乙酸乙酯萃取(2×1ml)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，经GC检测，共得到16株具有碳碳双键还原活性的菌株，能将底物马来酰亚胺转化为相应的丁二酰亚胺，其反应式如下。 

马来酰亚胺丁二酰亚胺 

将此16株菌株对目标底物(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸进行生物转化，并对目标底物有活性的7株菌株进行进一步的鉴定，最终筛选到Achromobacter sp.JA81。 

GC检测用非手性柱SGE 30QC2/AC‑5(5％phenyldimethyl polysiloxane，30m，0.22mm，0.25μm)测定底物马来酰亚胺及产物丁二酰亚胺含量。检测条件(FID检测器：200℃；进样口：180℃；柱温箱：120℃)。底物马来酰亚胺保留时间为2.7min，产物丁二酰亚胺的保留时间为5.7min。 

目标底物(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸进行生物转化时，产物通过HPLC检测，具体参数见本说明书发明内容部分。 

实施例2无杆菌JA81筛选时转化底物(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸 

经JA81催化得到的手性3‑芳基‑3‑氰基丙酸是合成γ‑氨基丁酸的中间体。γ‑氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统最重要的抑制性氨基酸递质(Fryszkowska et al.2010A short，chemoenzymatic route to chiral beta‑aryl‑gamma‑amino acids using reductases from anaerobic bacteria.Org Biomol Chem 8：533‑535)。种子的培养方法及培养基组分见本说明书发明内容部分。取新鲜培养的湿菌体1g，悬浮于10mL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，加入500μL异丙醇和500mg葡萄糖和10mg(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸(底物溶于二甲亚砜，用量为100g/L)。于摇床(30℃，230rpm)震荡反应48h，反应完成后，加入0.1M的稀盐酸调pH为6.0‑6.5，反应液乙酸乙酯萃取(2×20ml)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂得到粗产物。初产物经Steglich酯化反应(Neises and Steglich 1978 Simple Method for the Esterification of Carboxylic Acids.Angew Chem Int Ed 17：522‑524)，得到甲酯化产物，经硅胶柱层析分离，得到(R)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙酸甲酯。该转化过程可将(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸转化生成(R)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙酸甲酯，转化率为70％，ee值为90％。 

实施例3筛选菌株的鉴定 

为确定该菌株分类地位，对该菌株进行了16S rRNA初步鉴定。 

16S rRNA鉴定：基因组DNA为模板，以细菌通用引物NS1和NS8扩增16S rRNA序列。其序列如下(1524bp)： 

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGGATGCCTTACACATGCAAGTCGAA 

CGGCAGCACGGACTTCGGTCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATCGGAA 

CGTGCCTAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTAGCTAATACCGCATACGCCCTAC 

GGGGGAAAGCAGGGGATCGCAAGACCTTGCACTATTAGAGCGGCCGATATCGGATTAGC 

TAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGA 

CCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAA 

TTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCG 

GGTTGTAAAGCACTTTTGGCAGGAAAGAAACGTCATGGGTTAATACCCCGTGAAACTGA 

CGGTACCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG 

GTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAA 

AGATGTGAAATCCCAGAGCTTAACTTTGGAACTGCATTTTTAACTACCGGGCTAGAGTGT 

GTCAGAGGGAGGTGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAAC 

ACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGG 

GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTT 

GGGGCCTTCGGGCCTTGGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTAC 

GGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATG 

TGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATGCCGA 

AGAGATTTGGCAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCA 

GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTT 

GCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATG 

ACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGAC 

AGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCCCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGAT 

CGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGT 

CGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACTCCATGGGAGTGGGTT 

TTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGGGGGCGATTACCACGGTAGGATTCATGAC 

TGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGTTCACCTCCTTA 

根据16S rRNA鉴定结果，经NCBI比对，该菌和已报道的无菌(Achromobacter sp.)的同源性为99％。因此，本实验室将该菌命名为Achromobacter sp.JA81。 

实施例4筛选辅酶循环底物和优化pH值 

为了进一步筛选较优的辅酶再生底物，分别对葡萄糖浓度和异丙醇浓度进行优化，葡萄糖浓度优化条件分别为：0，1％，3％，5％，10％葡萄糖，反应18h，其余条件同实施例3。实验结果表明，反应体系中添加1％的葡萄糖作为辅酶再生底物转化率最高为54％，ee值98％。因此，以下实施例中辅酶再生底物均为1％葡萄糖。反应体系中葡萄糖浓度为1％时，添加的异丙醇浓度分别为0，1％，3％，5％，10％，反应18h，其余实验条件同实施例3。实验结果表明，反应体系中添加1％的葡萄糖和5％的异丙醇作为辅酶再生底物转化率最高为80％，ee值98％。因此，以下实施例中辅酶再生底物均为1％葡萄糖和5％的异丙醇。(1％葡萄糖是指葡萄糖浓度为1g/100mL；5％的异丙醇是指异丙醇的浓度为5mL/100mL)。 

对反应缓冲液的pH进行优化，反应体系中的pH分别为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0。实验结果表明，7.0为最佳缓冲液pH。以下实施例中的pH为7.0。 

实施例5菌株JA81转化底物(Z)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙烯酸 

以优化后的反应条件(0.1M，pH 7.0磷酸钾缓冲液，1％葡萄糖和5％的异丙醇作为共底物)对底物(Z)‑3‑芳基‑3‑氰基‑丙烯酸进行生物催化，操作如实施例2，反应48h，转化率为80％，得到相应的饱和产物(R)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙酸。经Steglich酯化反应，得到甲酯化产物，过柱纯化，得到(R)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙酸甲酯。 

(R)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙酸数据如下： 

黄油状物 

1H NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 2.93(dd，1H，CH2，J＝6.5，17.1Hz)，3.10(dd，1H，CH2，J＝8.2，17.1Hz)，4.28(dd，1H，CH，J＝6.6，8.2Hz)，7.36‑7.48(m，5H，Ar‑H) 

(R)‑3‑苯基‑3‑氰基‑丙酸甲酯数据如下： 

浅黄油状物，[α]D25＝+16.3(c＝0.4，MeOH)，ee：98％ 

1H NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 2.86(dd，1H，CH2，J＝6.6，16.6Hz)，3.03(dd，1H，CH2，J＝8.3，16.6Hz)，3.72(s，3H，CH3)，4.30(t，1H，CH，J＝7.4Hz)，7.34‑7.40(m，5H，Ar‑H) 

实施例6菌株JA81转化底物(Z)‑3‑(4‑氯芳基)‑3‑氰基‑丙烯酸 

操作如实施例5，反应48h，转化率为80％，得到相应的饱和产物(R)‑3‑(4‑氯芳基)‑3‑氰 基‑丙酸，经Steglich甲酯化后，得到相应的产物(R)‑3‑(4‑氯芳基)‑3‑氰基‑丙酸甲酯。其中，(R)‑3‑(4‑氯芳基)‑3‑氰基丙酸经过简单的化学反应可转化成相应的(R)‑巴氯芬(Fryszkowska et al.2010A short，chemoenzymatic route to chiral beta‑aryl‑gamma‑amino acids using reductases from anaerobic bacteria.Org Biomol Chem 8：533‑535)。巴氯芬，商品名力奥来素(lioresal)，是γ‑氨基丁酸β‑位取代衍生物。巴氯芬是一种手物，存在一对对映异构体。研究表明仅R构型的对映体具有药物活性，然而目前临床上使用的仍然是其外消旋体(Thakur et al.2003Enantioselective  synthesis of(R)‑(‑)‑baclofen via Ru(II)‑BINAP catalyzed asymmetric hydrogenation.Tetrahedron：Asymmetry 14：581‑586)。 

(R)‑3‑(4‑氯芳基)‑3‑氰基‑丙酸数据如下： 

黄固体 

1H NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 2.88(dd，1H，CH2，J＝6.8，17.2Hz)，3.04(dd，1H，CH2，J＝8.0，17.2Hz)，4.25(t，1H，CH，J＝7.3Hz)，7.32(d，2H，Ar‑H，J＝8.4Hz)，7.38(d，2H，Ar‑H，J＝8.4Hz) 

(R)‑3‑(4‑氯苯基)‑3‑氰基‑丙酸甲酯数据如下： 

白固体，[α]D25＝+8.2(c 0.6，MeOH)，94％ee 

1H NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 2.85(dd，1H，CH2，J＝7.0，16.7Hz)，3.03(dd，1H，CH2，J＝7.8，16.7Hz)，3.73(s，3H，CH3)，4.30(t，1H，CH，J＝7.4Hz)，7.32(d，2H，Ar‑H，J＝8.4Hz)，7.38(d，2H，Ar‑H，J＝8.4Hz) 

实施例7菌株JA81转化底物2‑甲基‑N‑苯基‑马来酰亚胺 

操作如实施例5，反应48h，转化率为100％，得到(R)‑3‑甲基‑1‑苯基吡咯‑2，5‑二酮。 

(R)‑3‑甲基‑1‑苯基吡咯‑2，5‑二酮数据如下： 

白固体，[α]D25＝+7.4(c 2.0，CHCl3)，＞99％ee 

1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ1.45(d，3H，CH3，J＝7.2Hz)，2.50(dd，1H，CH，J＝4.5，17.8Hz)，3.00‑3.09(m，1H，CH2)，3.10(dd，1H，CH2，J＝9.2，17.8Hz)，7.25‑7.50(m，5H，Ar‑H) 

实施例8 

底物同实施例7，细胞湿重300g/l，底物浓度为10g/l，转化48h，转化率为96％，得到(R)‑3‑甲基‑1‑苯基吡咯‑2，5‑二酮，97％ee。 

实施例9菌株JA81转化底物(E)‑2‑苯基‑1‑硝基‑1‑丙烯 

操作如实施例5，反应48h，转化率为87％，得到(S)‑2‑苯基‑硝基丙烷。 

(S)‑2‑苯基‑硝基丙烷数据如下： 

浅黄油状物，[α]D25＝‑40.0(c 1.0，CHCl3)，97％ee 

1H NMR(600MHz，CDCl3)δppm 1.39(d，3H，CH3，J＝6.9Hz)，3.58‑3.68(m，1H，CH)，4.45‑4.56(m，2H，CH2NO2)，7.20‑7.36(m，5H，Ar‑H) 

实施例10菌株JA81转化底物(E)‑1‑苯基‑2‑硝基‑1‑丙烯 

操作如实施例5，反应48h，转化率为60％，由于底物中Ca‑H的酸性，得到相应的消旋产物1‑苯基‑2‑硝基‑1‑丙烷。 

1‑苯基‑2‑硝基‑1‑丙烷数据如下： 

浅黄油状物 

1H NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 1.55(d，3H，CH3，J＝6.6Hz)，3.02(dd，1H，CH，J＝6.8，14.0Hz)，3.34(dd，1H，CH2，J＝7.4，14.0Hz)，4.78(m，1H，CHNO2)，7.16‑7.33(m，5H，Ar‑H) 

实施例11菌株JA81转化底物(E)‑2‑氰基‑3‑苯基‑丙烯酸 

操作如实施例5，反应48h，转化率为83％，由于底物中Ca‑H的酸性，得到相应的消旋产物2‑氰基‑3‑苯基‑丙酸。 

2‑氰基‑3‑苯基‑丙酸数据如下： 

浅黄油状物 

1H NMR(600MHz，CDCl3)：δppm 3.20(dd，1H，CH2，J＝8.6，13.9Hz)，3.28(dd，1H，CH2，J＝5.4，13.9Hz)，3.78(dd，1H，CH，J＝5.4，8.6Hz)，7.24‑7.35(m，5H，Ar‑H)