一种源于禽流感病毒自然弱毒株的血凝素和免疫抗原

一种源于禽流感病毒自然弱毒株的血凝素和免疫抗原

技术领域

本发明涉及动物疫病预防控制，尤其涉及一种用禽流感病毒自然弱毒株制备的血凝素 和免疫抗原。

背景技术

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的禽类（包括家禽和野禽） 的感染和/或感染综合征。鸡、火鸡、鸭、鹅和鹌鹑等家禽、野鸟、水禽和海鸟等均可感 染。其疾病形式多样，可表现为无致病性感染，低致病性感染和高致病性禽流感（Highly  pathogenic avian influenza，HPAI）。爆发HPAI不仅使当地的养禽业遭受毁灭性打 击，而且显著地影响禽类产品的国际贸易，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告 疫病，我国将其列为一类动物疫病。

AI的病原为禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV），AIV的亚型众多，其中按 血凝素（Haemagglutinin，HA）划分为16种（H1～H16）亚型，历史上所有的高致病性禽 流感均是由H5和H7亚型AIV引起的。H5和H7亚型AIV除了对养禽业有重要意义之外， 它们还有重要的公共卫生意义，H5和H7亚型AIV均有感染并致死人类的报道。

到目前为止，我国已分离鉴定的高致病性禽流感病毒均为H5亚型病毒，所以此前的 研究集中于H5亚型禽流感病毒及其免疫抗原，用于制造H5亚型禽流感疫苗或诊断试剂。 发明人在国内首次分离到H7亚型禽流感病毒（CN1株），并进行了一系列研究。发明人在 研究中发现，该病毒具有致病力很低的特征，后来又经过多次传代培养，使该病毒更加适 应鸡胚培养条件，获得病毒的滴度很高，而病毒致病力仍然很低。将此培养物经过一定工 艺灭活，仍能保留血凝素活性；研制成免疫抗原，接种鸡可以产生很好的抗体滴度，抗体 能维持6个月以上。因此，这种用H7亚型禽流感病毒自然弱毒株来制造的血凝素和免疫 抗原，对于防控H7亚型禽流感具有重要意义，并且这项技术在国内未见报道。

国内现有H7亚型禽流感病毒血凝素及免疫抗原，是用1979年获得的国际标准毒株 A/Afri.Star/Eng‑Q/983/79/(H7N1)研制的，存在以下技术缺陷：1、禽流感众所周知的特 性是病毒变异性高，即使同一种亚型的不同来源毒株，其抗原性也存在一定差异。用1979 年的标准毒株制备的血凝素，用来作血凝抑制实验、检测临床血清时，会出现滴度偏低、 敏感度下降的问题；2、用标准毒株制成免疫抗原或疫苗来免疫动物，由于标准毒株抗原 性与国内流行株抗原性存在差异，会导致保护效果下降。

发明内容

本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用国内分离的禽流感病毒 自然弱毒株（A/CK/CN/1/2002（H7N2），简称CN1株）制备的血凝素和免疫抗原。CN1株 保藏信息如下：

分类命名：禽流感病毒

拉丁文学名：Avian influenza virus，AIV

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2012年9月19日

保藏编号：CGMCC No.6602。

本发明是通过以下技术途径实现的：

本发明人从我国鸡中分离到的H7N2亚型禽流感病毒株（保藏编号：CGMCC No. 6602），在鸡胚中连续传代培养，再通过有限稀释法纯化病毒，然后测定病毒血凝素效 价；进行本动物接种试验，评价病毒的致病性；用病毒培养物制成灭活的血凝素；用病毒 培养物制成矿物油佐剂免疫抗原，接种鸡以后定期测定抗体水平。通过测定CN1株HA、NA 和M基因，确定这种血凝素与免疫抗原的分子识别标志。

具体方法为：1、病毒分离培养：将鸡禽流感监测过程中采集的样品，过滤除菌 后，接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，在37℃继续孵育。72小时左右鸡胚死亡，收集尿囊 液，用同样方法作传代培养。按GB/T18936‑2003规定方法，用1%鸡红细胞测定分离物的 血球凝集活性。2、病毒鉴定：对于具有血球凝集活性的培养物，按照《禽流感》（第一 版，北京农业大学出版社，1995）介绍的方法，鉴定病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶 （NA）亚型；3、病毒纯化：将收获的病毒液进行10倍比的系列稀释，接种10日龄鸡胚 培养，72小时左右，选择最高稀释度的死亡鸡胚，测定血凝活性，再次进行10倍比的系 列稀释后按同样方法传代培养，共传5代，获得纯化的病毒；4、致病性试验：按照《禽 流感》（第一版）介绍的方法，将纯化的病毒接种SPF鸡，测定“静脉接种致病指数 （IVPI）”；5、制备血凝素：将纯化的CN1株加入终浓度1：5000的β‑丙内酯，4℃灭 活10小时，测定血凝素效价，按常规方法冻结或冻干保存，用作血凝素；6、将纯化的 CN1株按前述方法用β‑丙内酯灭活，测定血凝素效价，加矿物油佐剂按常规方法乳化， 制成免疫抗原；7、将制成的免疫抗原接种6周龄SPF鸡，定期采集血清，用血凝抑制实 验测定抗体水平，实验中采用的是上述CN1株血凝素。8、测定病毒的基因序列：参照国 内外已发表的禽流感病毒HA、NA和M基因节段的序列，设计针对HA、NA和M基因节段的 扩增引物和反转录引物，按常规方法进行克隆测序，得到CN1病毒株HA、NA和M基因片 段的核苷酸序列。

血凝素效价测定表明，CN1株制备的血凝素效价达到1024，具有较高的效价，因此可 以用于制备血凝素试剂和免疫抗原。

致病性试验表明，CN1病毒接种SPF鸡后10天，未观察到明显症状。静脉接种指数 （IVPI）为0，无致病性，说明病毒传5代后毒力没有增强，是难得的H7亚型自然弱毒 株，灭活后用于制造血凝素和免疫抗原是很安全的，具有实际应用价值。

免疫原性试验表明，CN1株制备的免疫抗原接种SPF鸡以后1周（1WPI），即可检出 针对H7亚型AIV的HI抗体，接种后第5‑8周为抗体水平高峰期，其后缓慢下降，直至第 28周仍可检出抗体（HI效价高于16）。

病毒的HA基因序列见SEQ ID NO：1；NA基因序列见SEQ ID NO：2；M基因序列见 SEQ ID NO：3。

具体实施方式

实施实例1

病毒分离鉴定

从鸡场采集样品，经过滤除菌后，接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，在37℃继续孵育。 72小时左右鸡胚死亡，收集尿囊液，用同样方法作传代培养。按《禽流感》（第一版）的 方法，用1%鸡红细胞测定分离物的血球凝集活性。

按《禽流感》（第一版）介绍的方法，用红细胞凝集抑制（HI）试验确定病毒的血凝 素亚型。按《禽流感》（第一版）介绍的神经氨酸酶（NA）活性抑制（NI）实验方法，测 定病毒NA亚型。

结果：鸡胚在接种CN1株后72小时左右死亡，胚体充血。初代尿囊液血凝价为256， 经多次传代后，尿囊液的血凝价为1024。病毒被鉴定为H7N2亚型禽流感病毒。

实施实例2

病毒的致病性测定

按《禽流感》（第一版）介绍的方法进行。将14只SPF鸡随机分二组，在两个负压隔 离器中饲养，各组分别为10只和4只。经检验无菌的CN1株鸡胚尿囊液，对1%鸡红血球 凝集效价为1024，用生理盐水作1：10稀释，接种一组鸡10只，每只鸡经翅静脉注射 0.1ml，另外四只鸡注射生理盐水作为对照。每天观察并记录鸡情况，至接种后10天， 计算静脉接种致病指数（IVPI）。

结果：IVPI值为0。病毒对实验鸡无致病性，是自然弱毒株。可用于研制血凝素和免 疫抗原，生产和使用过程可以保证安全，因此具有实际应用价值。将CN1病毒保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6602。

实施实例3

血凝素制备及效价测定

将纯化的CN1株加入终浓度1：5000的β‑丙内酯，4℃灭活10小时，按GB/T18936‑ 2003规定方法，用1%鸡红细胞测定分离物的血球凝集活性，分装后冻结保存，用作血凝 素。

结果：灭活病毒制备的血凝素效价为1024。

实施实例4

免疫抗原制备及接种动物产生抗体的测定

将CN1株病毒液，加入终浓度为1：5000的β‑丙内酯，4℃灭活10小时，测定血凝 素效价，加矿物油佐剂按常规方法乳化，制成免疫抗原，接种6周龄SPF鸡8只，每周采 集少量血清一次，按GB/T18936‑2003规定方法，用上述CN1株血凝素来做血凝抑制实 验，测定血清抗体水平。

结果：以血清抗体HI效价高于16为检测阳性的判界，CN1株制备的免疫抗原接种SPF 鸡以后1周，即可检出针对H7亚型AIV的血清抗体，接种后第5‑8周为抗体水平高峰 期，其后缓慢下降，直至第28周仍可检出抗体，之后出现了部分鸡的抗体水平低于16的 情况。这说明，用CN1株制备免疫抗原，接种鸡产生的抗体可以维持半年以上，具有较好 的免疫原性。

实施实例5

病毒基因序列测定

参照国内外已发表的禽流感病毒HA、NA、M基因节段的核苷酸序列，设计针对HA、NA、 M基因节段的扩增引物（见表1）和反转录通用引物：5′AGCAAAAGCAGG‑3′（SEQ ID  NO：4）（参考文献：E.Hoffmann,J.Stech,Y.Guan,et al.Universal primer set  for the full‑length amplifiction of all influenza A viruses.Archives of  Virology,2001,146:2275‑2289.）。提取病毒总RNA，反转录(RT)合成CDNA，经PCR扩增 后，凝胶电泳回收各基因节段的PCR产物，分别与pGEM‑T Easy载体连接成pGEM‑TE‑X （“x”代表HA、NA、M基因），构建重组质粒转化感受态细胞，挑选PCR阳性的克隆，测 定核苷酸序列。

表1 针对各基因节段的PCR引物

结果：病毒的HA基因序列见SEQ ID NO：1；NA基因序列见SEQ ID NO：2；M基因序 列见SEQ ID NO：3。