一种防治细辛叶枯病的拮抗真菌菌株及其应用

本发明涉及微生物学工程与技术领域，尤其涉及一种防治细辛叶枯病的拮抗真菌菌株及其应用。

细辛又名细参、烟袋锅花，为马兜铃科辛属多年生草本科植物，是一种重要的药用植物，细辛性温、味辛，有温经散寒、祛风止痛、通窍、止咳平喘、通利血脉的功效，用于风寒头痛、痰饮咳喘、关节疼痛、齿痛、鼻渊等症。细辛叶枯病是典型的多循环病害，病原菌为槭菌刺孢(Mycocentrospora acerina(Hartig)Deihton)，其分生孢子是主要侵染源，可通过雨水飞溅和气流传播，主要危害叶片，病斑近圆形，棕褐周围伴有轮纹，发生严重病斑腐烂，穿孔，整个叶片枯萎，严重影响细辛的产量和品质。

传统化学防治方法具有见效快，杀菌谱广等特点，但化学农药不合理使用引起的药物残留、食品安全和环境污染等问题日益显现，甚至导致害虫再猖獗以及病害抗药性递增等现象，而生物防治能在不污染环境的条件下防治植物病虫害，具有安全、无残留，特异性强等优点，利用生防菌株防治细辛病害有助于药材的品质、提高药材的产量，具有生态和经济的双重效益，目前国内外对细辛叶枯病生物防治的研究较少，化学农药对细辛叶枯病的防治会造成药物残留从而影响药材的品质和质量，因此，本发明提出一种防治细辛叶枯病的拮抗真菌菌株及其应用，以解决现有技术中的不足之处。

针对上述问题，本发明提出一种防治细辛叶枯病的拮抗真菌菌株及其应用，通过从细辛健康植株根际土壤中分离出对细辛叶枯病具有生防效果的拮抗真菌菌株-微紫青霉菌，然后对筛选出的拮抗真菌菌株进行平板内抑菌试验和活体防治效果试验，得出了拮抗真菌菌株的预防防效为70.78％，防效为61.03％，拮抗真菌菌株在预防细辛叶枯病发生和发生后控制病情扩展方面都有较好的作用，并且可以诱导细辛植株体内抗病性相关酶活性的升高，能有效促进细辛叶枯病生物防治的发展。

本发明提出一种防治细辛叶枯病的拮抗真菌菌株，所述拮抗真菌菌株从健康细辛植株根际土壤中分离得到，用于拮抗细辛叶枯病病原菌；分类命名为：微紫青霉(Penicillium janthinellum)；保藏编号：CGMCC No.18101；保藏时间：2019年6月21日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

进一步改进在于：所述拮抗真菌菌株的菌株培养物、发酵液或发酵培养液的过滤液。

进一步改进在于：所述拮抗真菌菌株为活性成分的生物菌剂在细辛叶枯病防治上的应用。

进一步改进在于：所述拮抗真菌菌株控制细辛叶枯病的发生和发展，具有预防和效果。

一种防治细辛叶枯病的拮抗真菌菌株在防治病原菌-槭菌刺孢的应用。

本发明的有益效果为：本发明方法通过从细辛健康植株根际土壤中分离出对细辛叶枯病具有生防效果的拮抗真菌菌株-微紫青霉菌，以细辛叶枯病菌为靶标菌，通过平板对峙法对拮抗真菌菌株进行筛选，然后对筛选出的拮抗真菌菌株进行活体防治效果试验，得出了拮抗真菌菌株的预防防效为70.78％，防效为61.03％，拮抗真菌菌株在预防细辛叶枯病发生和发生后控制病情扩展方面都有较好的作用，并且可以诱导细辛植株体内抗病性相关酶活性的升高，从而抵御了病害的侵染，为细辛叶枯病的生物防治防治提供了科学数据支持，能有效促进细辛叶枯病生物防治的发展。

图1为本发明恒温对峙培养抑制细辛叶枯病病原菌效果示意图。

图2为本发明拮抗真菌菌株处理后细辛叶枯病病原菌的菌丝形态示意图。

图3为本发明拮抗真菌菌株预防接种效果示意图。

图4为本发明拮抗真菌菌株接种效果示意图。

图5为本发明拮抗真菌菌株诱导细辛植株体内多酚氧化酶(PPO)活性示意图。

图6为本发明拮抗真菌菌株诱导细辛植株体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性示意图。

图7为本发明拮抗真菌菌株诱导细辛植株体内过氧化物酶(POD)活性示意图。

图8为本发明拮抗真菌菌株诱导细辛植株体内超氧化物歧化酶(SOD)活性示意图。

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例一

本实施例提出拮抗真菌菌株-微紫青霉菌的分离筛选及鉴定：从细辛健康植株根际土壤中通过梯度稀释法分离出多种菌株，以细辛叶枯病菌为靶标菌，采用平板对峙的方法筛选出一株编号为F1-6的拮抗真菌菌株，经形态学及分子生物学鉴定，其分类命名为微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)；

拮抗真菌菌株的分离筛选具体过程包括以下步骤：

步骤一：采用土壤稀释分离法分离拮抗真菌菌株，取10g细辛健康植株根际土壤加入到90mL无菌水的三角瓶中，然后将三角瓶进行震荡处理20min，震荡处理的速度为160r/min，混匀后制成土壤悬液，再将土壤悬液稀释至10-4、10-5、10-6三个梯度；

步骤二：分别从10-4、10-5、10-6三个梯度的稀释土壤悬液中吸取100uL均匀涂布到PDA平板中；每个梯度涂布3个平板作为重复，得到9个均匀涂布着稀释土壤悬液的PDA平板；

步骤四：将9个均匀涂布着稀释土壤悬液的PDA平板进行恒温培养，恒温培养温度为22℃，恒温培养时间为2天，根据菌落形态进行纯化，将得到的不同种类菌株在4℃无菌环境下进行保存备用；

步骤五：以细辛叶枯病菌为靶标菌，采用平板对峙的方法筛选拮抗菌，得到拮抗真菌菌株，然后再根据形态学和分子生物学的方法进行菌种鉴定，鉴定结果表示，拮抗真菌菌株培养4天即形成较为典型的菌落，菌落中间呈黄，边缘为白，直径20-30mm，边缘规则，菌落表面絮状；

对拮抗真菌菌株进行ITS序列分析，在GenBank数据库中进行核酸序列BLAST分析，结果表明拮抗真菌菌株与Penicillium janthinellum的同源性为99％，确定为微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)。

实施例二

根据图1、2所示，本实施例提出拮抗真菌菌株-微紫青霉菌对细辛叶枯病菌的抑制作用：将拮抗真菌菌株-微紫青霉菌与细辛叶枯病病原菌-槭菌刺孢进行恒温对峙培养，恒温对峙培养温度为25℃，恒温培养时间为7天，并观察对峙培养的病原菌边缘菌丝形态；

经拮抗真菌菌株-微紫青霉菌处理后的细辛叶枯病病原菌-槭菌刺孢(如图1所示)，在显微镜下观察发现，病原菌菌落边缘菌丝大多出现熔断、缢缩、厚垣孢子增多、内容物减少的现象(如图2所示)，表明拮抗真菌菌株-微紫青霉菌对细辛叶枯病病原菌-槭菌刺孢的生长具有明显的抑制作用。

实施例三

根据图3、4所示，本实施例提出拮抗真菌菌株-微紫青霉菌对细辛叶枯病盆栽防治效果测定，包括以下步骤：

步骤一：将防效测定分为3个处理，分别为预防接种拮抗真菌菌株-微紫青霉菌处理组、接种拮抗真菌菌株-微紫青霉菌处理组以及只接种叶枯病病原菌-槭菌刺孢喷洒无菌水作为对照组，然后从健康的盆栽细辛中选取300片长势一致的细辛叶片，每个处理组100片，并在每个叶片上各扎6个圆孔；

步骤二：用无菌水将拮抗真菌菌株-微紫青霉菌孢子冲洗，配制成浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液；

步骤三：预防接种处理组先均匀喷洒孢子悬浮液，3h后接种细辛叶枯病病原菌-槭菌刺孢、接种处理组先接种细辛叶枯病病原菌-槭菌刺孢，48h后于叶片上均匀喷洒孢子悬浮液，以喷洒无菌水为对照组(CK组)，保湿培养3天后开始观测发病情况，进行防治效果统计，发病等级标准如表1所示，病情指数计算公式如公式(1)所示，防效计算公式如公式(2)所示：

表1发病等级标准

等级 标准 0级 无病斑 1级 病斑面积占整个叶面积的5％以下 3级 病斑面积占整个叶面积的6％-10％ 5级 病斑面积占整个叶面积的11％-25％ 7级 病斑面积占整个叶面积的26％-50％ 9级 病斑面积占整个叶面积的50％以上

进行预防效果试验后表明，只接种细辛叶枯病病原菌-槭菌刺孢的处理组叶片病情指数为30.67，拮抗真菌菌株-微紫青霉菌处理的病情指数为8.96，其预防防效为70.78％(如图3所示)；

进行效果试验后表明，只接种细辛叶枯病病原菌-槭菌刺孢的处理组叶片病情指数为78.29，拮抗真菌菌株-微紫青霉菌处理的病情指数为30.51，其防效为61.03％(如图4所示)；

比较拮抗真菌菌株-微紫青霉菌对细辛叶枯病病原菌的预防与效果试验结果表明，拮抗真菌菌株-微紫青霉菌的预防防效为70.78％，防效为61.03％，拮抗真菌菌株-微紫青霉菌在预防细辛叶枯病发生和发生后控制病情扩展方面都有较好的作用。

实施例四

根据图5、6、7、8所示，本实施例提出拮抗真菌菌株-微紫青霉菌对细辛植株体内抗病性相关酶活性的测定：预防接种及接种处理后第0、2、4、6、8天进行植物抗病相关酶活性的测定，包括对多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)及超氧化物歧化酶(SOD)的酶活性测定；

由抗病性相关酶活性的检测表明，接种拮抗真菌菌株-微紫青霉菌后，细辛叶片内PPO、PAL、POD、SOD的活性与未接种拮抗真菌菌株-微紫青霉菌的细辛叶片相比，酶活性均显著上升，表明拮抗真菌菌株-微紫青霉菌可以诱导细辛植株体内抗病性相关酶活性的升高(如图5、6、7、8所示)，从而抵御病害的侵染。

本发明方法通过从细辛健康植株根际土壤中分离出对细辛叶枯病具有生防效果的拮抗真菌菌株-微紫青霉菌，以细辛叶枯病菌为靶标菌，通过平板对峙法对拮抗真菌菌株进行筛选，然后对筛选出的拮抗真菌菌株进行活体防治效果试验，得出了拮抗真菌菌株的预防防效为70.78％，防效为61.03％，拮抗真菌菌株在预防细辛叶枯病发生和发生后控制病情扩展方面都有较好的作用，并且可以诱导细辛体内抗病性相关酶活性的升高，从而抵御了病害的侵染，为细辛叶枯病的生物防治防治提供了科学数据支持，能有效促进细辛叶枯病生物防治的发展。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。