一种产碱菌科好氧新菌T-4及其应用

本发明属于微生物及其生物降解应用领域，涉及一种产碱菌科好氧新菌T-4及其应用，具体涉及一株产碱菌科好氧新菌T-4的分离鉴定，及其在环境修复中降解对苯二甲酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、原儿茶酸、苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸、双酚A、4,4-二氨基二苯甲烷中的一种或多种的应用。

对苯二甲酸(TPA)作为石化工业的重要原料，主要用于生物可降解聚酯的制造，如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚己二酸丁酯-对苯二甲酸丁酯(PBAT)，还广泛用于增塑剂、涤纶纤维、染料、香料、农药等化合物的生产。众所周知，TPA被归类为毒害性污染物和内分泌干扰物，TPA可以引起动物膀胱结石和膀胱癌以及导致睾丸功能受损，对水中微生物的再生有抑制作用，影响萝卜幼龄种子的发芽率，TPA废水在土壤中流动对地下水也是一种威胁。由于TPA的毒害性，越来越多的公共健康问题将会出现，但是由于芳香基团的存在，对苯二甲酸的生物可降解性较低。

中国是世界上主要的TPA生产国之一。研究表明，每生产一吨TPA会产生约3～10m3高强度有机废水，废水温度45-90℃，化学需氧量(COD)约5-20kg·m-3，未经处理的TPA废水会造成严重的环境污染问题。生物降解法被认为是一种环境友好且经济有效的处理方法。目前，考虑到过程的稳定性和低能耗需求，许多污水处理厂都是在中温条件运行，而且大多是厌氧生物反应器，如UASB、ABR、FBR，然而厌氧工艺存在着生物质低、COD去除率低、运行控制系统复杂等缺点。近年来，好氧活性污泥工艺由于对有机负荷冲击的耐受性好、没有重大污泥膨胀问题、载体介质堵塞风险低等优点受到广泛关注，因此需要好氧降解菌种。目前，文献中已报道一些好氧微生物可以降解对苯二甲酸，大部分菌株最适生长温度在25-30℃，而TPA废水的排放温度为45-90℃，使用常温菌处理需先将废水冷却，而如果选用嗜热菌来处理则可以降低冷却废水的成本，同时嗜热菌反应速度快、产气量大、减少病原体、效率高。因此，筛选新的嗜热好氧对苯二甲酸降解菌种，用于开发一种高效、节能、降低运行成本的高强度TPA废水处理技术，对环境领域具有重要意义。

生物可降解塑料的使用被认为是减少塑料污染的全球策略，其中PET和PBAT是生产生物可降解塑料产品的重要聚酯。普遍认为，在堆肥条件下生物可降解塑料被微生物转化为二氧化碳、微生物生物量和水，但依据生物可降解塑料的堆肥降解标准如ASTMD6400，认为堆肥180天内塑料总有机碳>90％被转化成CO2即可，如果剩余有机成分的浓度低于1％则无须考虑，另外，文献中报道的聚酯可被环境中的微生物降解，也主要是通过降解细菌产生脂肪酶水解聚合物的酯键使其降解为小分子寡聚体或者单体，但这些细菌能否继续降解或代谢生成的小分子降解产物报道较少。据研究，PBAT的降解产物对苯二甲酸和己二酸，可以改变环境的pH值和环境微生物的落结构，并对微生物和植物产生生理毒性。因此，有必要寻有效降解TPA的微生物，应用于生物可降解塑料在土壤环境或堆肥过程中原位完全降解，这样投资较少且不会造成二次污染，为生物可降解塑料的安全使用和可持续性提供菌种基础和应用前景。

本发明从堆肥样品中筛选得到一种降解对苯二甲酸的细菌，代表产碱菌科的新属新种Composticoccus terephthalicicum gen.nov.sp.nov T-4T，并研究了它的降解特性，发现该菌株还可以降解邻苯二甲酸、间苯二甲酸、原儿茶酸、苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸、双酚A、4,4-二氨基二苯甲烷。

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种产碱菌科好氧新菌株T-4。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

菌株T-4，其分类命名是Composticoccus terephthalicicum gen.nov.sp.nov，属于产碱菌科；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年9月11日，保藏号为CGMCC No.18488。

主要生物学特性如下：

1、菌体形态学特征：在改良MMTA液体培养基中，50℃、180rpm培养18h后，细胞为球形或者微椭球形，直径为1.08～1.4μm，有鞭毛，鞭毛多生且着生位置不固定。

2、菌落形态学特征：在LBTA固体培养基中，50℃培养3天后，菌落形态为米白、圆形、表面凸起且光滑、边缘整齐。

3、生理与生化特性：

在LBTA培养基中生长良好，但在LB培养基中不生长；生长温度范围30-55℃，最适生长温度为50℃；生长pH范围6.5-9.0，最适生长pH为7.5-8.0；生长盐度范围是0-3％(w/V)NaCl，最适盐度为0.5-1％(w/V)NaCl；革兰氏阳性菌，具有氧化酶、接触酶活性，好氧菌，可以滑动，脲酶阴性，硝酸盐还原阴性，吲哚试验阴性，O-F试验阴性；可以利用对苯二甲酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、原儿茶酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸、双酚A、4,4-二氨基二苯甲烷、L-乳酸、丙酮酸钠、3-钠作为碳源生长，不能利用D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-麦芽糖、D-纤维二糖、D-山梨醇、L-丝氨酸、L-谷氨酸、甘油、明胶、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、吐温20、吐温80、柠檬酸、己二酸、甲酸、丙酸、苯酚、对甲基苯甲酸、对甲基苯磺酸、1,4-萘二甲酸作为碳源；对头孢西丁、阿莫西林、头孢他啶、大观霉素、卡那霉素、四环素、呋喃妥因、多西环素、氯霉素、青霉素、头孢噻肟、氨苄西林等抗生素敏感，对万古霉素、利福平、罗红霉素、苯唑西林、克林霉素有抗性。

作为优选，菌株T-4以对苯二甲酸为唯一碳源及能源进行自身的生长繁殖。

本发明的另一个目的是提供产碱菌科好氧菌T-4在环境修复中降解对苯二甲酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、原儿茶酸、苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸、双酚A、4,4-二氨基二苯甲烷中的一种或多种的应用。

作为优选，菌株T-4在对苯二甲酸生产废水处理上的应用。

作为优选，菌株T-4在含对苯二甲酸基团的生物可降解塑料降解上的应用。

本发明的又一个目的是降解对苯二甲酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、原儿茶酸、苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸、双酚A、4,4-二氨基二苯甲烷中一种或多种的生物菌制剂或生物强化制剂，包括有效成分产碱菌科好氧新菌株T-4。

本发明的有益效果是：本发明采用单一菌株Composticoccus terephthalicicumgen.nov.sp.nov T-4T，在50℃好氧培养可以有效降解对苯二甲酸，初始浓度不超过50mM时降解率都达100％。本发明的菌株可用于对苯二甲酸废水的处理，也可用于堆肥或者土壤环境中包含对苯二甲酸基团的生物可降解塑料的完全降解，还可以用于其他重要苯基化合物，如邻苯二甲酸、间苯二甲酸、原儿茶酸、苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸、双酚A、4,4-二氨基二苯甲烷的降解，不会造成二次污染，在环境修复方面具有广泛的应用前景。

菌株T-4，其分类命名是Composticoccus terephthalicicum gen.nov.sp.nov，属于产碱菌科；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年9月11日，保藏号为CGMCC No.18488。

图1是菌株T-4在LBTA固体培养基中的菌落形态照片。

图2是菌株T-4在改良MMTA液体培养基中，50℃、180rpm培养18h后的透射电镜图，其中A-F表示不同的细胞，A、B、C-E、F放大倍数分别为1.5k、2.0k、3.0k、4.0k。

图3是采用Neighbor-joining法构建的菌株T-4的系统发育树。

图4是菌株T-4在改良MMTA液体培养基中，250mL摇瓶装液量100mL、接种量1％、50℃、180rpm振荡培养，菌体生长、对苯二甲酸降解及培养基pH变化曲线图。

图5是菌株T-4在对苯二甲酸不同初始浓度的MMTA培养基，250mL摇瓶装液量100mL、接种量1％、50℃、180rpm振荡培养，对苯二甲酸的降解曲线图。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，帮助更好地理解本发明，但并不局限于此。

下面实施例采用的培养基配方组成如下：(1)无机盐培养基MM：KH2PO4 1g，K2HPO4·3H2O 7.5g，NaNO3 1g，(NH4)SO4 1g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O0.02g，FeSO4·7H2O 0.01g，1mL微量元素和混合维生素储备液，H2O 1000mL，pH 7.5。(2)富集培养基MMTA:无机盐培养基MM中加入TPA 3g/L。(3)改良MMTA培养基：无机盐培养基MM中加入TPA 2g/L。(4)LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，H2O 1000mL，pH7.5；(5)LBTA培养基：LB培养基中加入TPA 2g/L。固体培养基则添加琼脂18g/L。

实施例1：堆肥样品的富集和对苯二甲酸降解菌T-4的分离、纯化和保藏

取堆肥样品2g加入100mL富集培养基MMTA中，50℃180rpm振荡培养一周，检测菌液培养前后的TPA浓度，如果TPA发生了降解，则将培养液进行梯度稀释，涂布于LBTA培养基固体平板上，在50℃培养。挑取单菌落，在新的LBTA培养基上划线，进一步分离和纯化获得单一菌株。获得的单一菌株用富集培养基复筛，确定具有降解对苯二甲酸的菌株用甘油管保存，所用甘油的终浓度是20％，保藏于-80℃冰箱。

实施例2：菌株T-4的菌种鉴定

(1)菌落的形态特征

菌株T-4在LBTA固体培养基中，50℃下培养3天后，菌落形态为米白、圆形、表面凸起且光滑、边缘整齐，见图1。

(2)菌体的形态特征

菌株T-4在改良MMTA液体培养基中，50℃、180rpm培养18h后的透射电镜图，细胞为球形或者微椭球形，直径为1.08～1.4μm，有鞭毛，鞭毛多生且着生位置不固定，见图2，其中A-F表示不同的细胞，A、B、C-E、F放大倍数分别为1.5k、2.0k、3.0k、4.0k。

(3)菌株T-4的分类地位

利用细菌基因组DNA抽提试剂盒(Axgen)提取菌株T-4的总DNA作为模板，以通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)，PCR条件：94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸90s、35次循环，72℃末端延伸10min，得到细菌的16SrRNA基因扩增产物，回收纯化后进行测序，所得序列(1419bp)通过https://www.ezbiocloud/网站进行序列相似性比对。将菌株T-4及其相近菌株的16SrRNA序列通过Mega(Version7.0)软件进行多序列比对，并采用Neighbor-joining方法构建系统进化树，进化树用1000次重复取样的bootstrap方法验证。

如图3，系统发育树结果显示，与菌株T-4的16S rRNA序列相似性最高的是未培养菌clone SMG41(GenBank登录号是AM930293)，相似度为98.20％，其次是Bordetella sp.(95.18-95.68％)、Verticiella sediminum(95.03％)、Orrella dioscoreae(94.96％)、Pigmentiphaga humi(94.89％)等，这些最相近的菌株都属于β-变形菌纲、Burkholderiales的Alcaligenaceae科。进化分析表明，菌株T-4与uncultured cloneSMG41(AM930293)在Alcaligenaceae科中形成一个单独的分支，建议建立一个新属包含菌株T-4，命名为Composticoccus terephthalicicum gen.nov.sp.nov.。

(4)菌株T-4的生理生化分析

为了进一步了解菌株T-4，根据标准程序测试该菌株相关生理生化特征。菌株T-4在LBTA培养基中生长良好，但是在LB培养基中不生长。菌株T-4能够在30-55℃的温度条件下生长，最适生长温度为50℃；能在pH 6.5-9.0条件下生长，最适生长pH为7.5-8.0；盐度生长范围是0-3％(w/V)NaCl，最适盐度范围是0.5-1％(w/V)NaCl。一系列的生理鉴定表明，菌株T-4是革兰氏阳性菌，具有氧化酶、接触酶活性，好氧菌，可以滑动，脲酶阴性，硝酸盐还原阴性，吲哚试验阴性，O-F试验阴性；可以利用对苯二甲酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、原儿茶酸、苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸、4,4-二氨基二苯甲烷、L-乳酸、丙酮酸钠、3-钠作为碳源生长，不能利用D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-麦芽糖、D-纤维二糖、D-山梨醇、L-丝氨酸、L-谷氨酸、甘油、明胶、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、吐温20、吐温80、柠檬酸、己二酸、甲酸、丙酸作为碳源。菌株T-4对头孢西丁、阿莫西林、头孢他啶、大观霉素、卡那霉素、四环素、呋喃妥因、多西环素、氯霉素、青霉素、头孢噻肟、氨苄西林等抗生素敏感，对万古霉素、利福平、罗红霉素、苯唑西林、克林霉素有抗性。

(5)菌株T-4的细胞化学分析

通过基因组测序，得到菌株T-4的G+C含量为63.15％。采用反向高压液相谱分析法检测菌株T-4的细胞醌，主要成分为CoQ-8(68.8％)和CoQ-7(31.2％)。采用薄板双相层析法检测菌株T-4的极性脂组分，包括：二磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和一个未知的磷脂(PL)。使用美国MIDI公司Sherolock全自动细菌鉴定系统对菌株T-4在50℃培养的平板菌体细胞脂肪酸成分分析，包括：C17:0cyclo(34.69％)、C18:0(22.74％)、C16:0(17.65％)、C16:1w7c/16:1w6c(10.14％)、C14:03OH/C16:1isoⅠ(4.77％)、C12:03OH(2.96％)、C16:03OH(2.90％)。

实施例3：菌株T-4对TPA的降解

(1)菌株T-4降解TPA的生长曲线

菌株T-4在改良MMTA液体培养基中，250mL摇瓶装液量为100mL、1％接种量、50℃180rpm振荡培养，在培养不同时间点取样检测菌浓度(OD600)、TPA浓度及pH。采用紫外可见分光光度法测定各组对苯二甲酸的浓度：样品于10000rcf离心2min后，检测菌液上清的光密度OD240，需以不同对苯二甲酸浓度的MMTA溶液制作标准曲线。

菌株T-4降解TPA的生长曲线如图4所示，菌株T-4随着对苯二甲酸的降解逐步生长，降解过程中pH会随之升高。

(2)菌株T-4对不同浓度对苯二甲酸的降解

分别配制对苯二甲酸初始浓度为10、20、25、30、35、50mM的MMTA液体培养基，250mL摇瓶装液量为100mL，1％接种，50℃180rpm振荡培养，在培养不同时间点取样检测菌浓度、TPA浓度和培养结束后测定菌液的pH。

菌株T-4对不同初始浓度的对苯二甲酸的降解效果如图5，初始浓度不超过50mM时降解率都能达到100％，经测定初始对苯二甲酸浓度为10、20、25、30、35、50mM的培养基培养结束后的菌液pH分别是9.15、9.17、9.76、9.69、9.7、10.18，可能是由于培养基pH的升高限制了菌株的活性，所以限制了菌株的降解能力。

实施例4：菌株T-4的底物特异性

配制MM液体培养基，分别加入终浓度为100mg/L的底物，底物为对苯二甲酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、原儿茶酸、苯甲酸、苯酚、对甲基苯甲酸、对甲基苯磺酸、对羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、4-甲酰苯甲酸、1,4-萘二甲酸、双酚A、4,4-二氨基二苯甲烷，其中，双酚A和4,4-二氨基二苯甲烷是用乙醇溶解制成母液，其他均用NaOH调pH至7.5可溶解。将菌株T-4在改良MMTA培养基中、50℃180rpm振荡培养至对数生长期，7000rcf5min离心收集菌体，用无菌水洗涤3次后重悬，接种至各培养基中，此时菌液OD600＝0.1，然后50℃180rpm振荡培养，以菌体生长OD600表示菌株T-4对不同底物的利用，结果如表1所示。

表1菌株T-4的底物特异性

注：+表示OD600>0.5，-表示OD600无明显变化。

由表1可以看出，菌株T-4除了降解对苯二甲酸之外，还可以降解邻苯二甲酸、间苯二甲酸、原儿茶酸、苯甲酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、4-甲酰基苯甲酸、双酚A、4,4-二氨基二苯甲烷。

对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思和实质的前提下，还可以对本发明中部分方法、参数所作做出若干推演或调整，都应当视为属于本发明的保护范围。