一种抑制植物病虫害的微生物菌剂及其制备方法和应用

一种抑制植物病虫害的微生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域的生物菌剂，具体的说是一种抑制植物 病虫害的微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

在现代化设施农业发展过程中，由于土地复种指数不断提高，农药和 化肥大量使用而使病虫害频发，植物病虫害所造成农作物减产给农业生产 造成巨大的经济损失，其中以植物土传真菌病害和寄生线虫病害的发生最 为严重。土传真菌病害是影响蔬菜产量的重要病害，仅在蔬菜上发生的真 菌类病害就有1000种左右，常见病害200种左右。霜霉病、枯萎病、白粉 病、黄萎病、锈病等都是由真菌引起的常见病害，对作物危害非常严重。 根结线虫是一种植物寄生线虫，对作物造成严重危害，在世界范围内普遍 发生，可使世界农业平均每年减产25%。为害的作物有蔬菜、烟草、花卉、 棉花、大豆、花生、小麦、水稻、中药材等。近年来，我国有些蔬菜大棚 由于连做等原因真菌病害和根结线虫病害同时发生，损失相当严重，有些 大棚甚至已经无法继续进行蔬菜生产。

植物根结线虫和真菌病害防治传统上是以施用化学农药为主，物理方 法为辅。大量化学农药反复施用不仅导致根结线虫和病害真菌抗药性不断 增强、药效不断减弱，病虫害日趋严重，而且残留农药在土壤和农产品中 富集，导致土壤生物学质量严重退化，严重污染和破坏生态环境，造成食 品安全隐患从而直接危害人类健康。研究高效、低毒、低残留生物农药， 有效防治植物根结线虫和真菌病害并减少化学农药施用量已成为现代农业 可持续发展中的重要课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制植物病虫害的微生物菌剂及其制备方 法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种抑制植物病虫害的微生物菌剂，菌剂由载体、菌体、保护剂以及 增效剂构成，按重量百分比计，微生物菌剂成分为：1～3%芽孢杆菌、2～ 4%链霉菌、30～50%草碳土、25～40%硅藻土、1～5%海藻酸钠、1～5%几丁 质、5～10%糊精、2～6%磷酸二氢钾、0.8～1.5%硫酸镁和2～6%氯化钠;

所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KJB04-11，已于2010年9 月28日保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010254；

所述灰链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02，已于CCTCC M 2010254保藏在中国培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010253。

将芽孢杆菌（CCTCC M2010254）及链霉菌（CCTCC M2010253）分别 液体发酵扩大培养，离心分离分别得到芽孢杆菌及链霉菌菌体，待用。

抑制植物病虫害的微生物菌剂的制备方法：按上述比例，将载体草碳 土、硅藻土与芽孢杆菌及链霉菌菌体按比例混合均匀，而后再加入海藻酸 钠、几丁质、糊精、磷酸二氢钾、硫酸镁及氯化钠，充分混合均匀，即制 成微生物菌剂。

所述芽孢杆菌及链霉菌为芽孢杆菌（CCTCC M2010254）及链霉菌（CCTCC M2010253）分别经液体发酵扩大培养，离心分离后得到的芽孢杆菌及链霉 菌菌体

抑制植物病虫害的微生物菌剂的应用：所述菌剂可作用于植物土传真 菌或植物寄生线虫中，用于防治线虫及其抗真菌。所述真菌为镰刀菌 （Fusarium sp.），植物寄生线虫为根结线虫（Meloidogyne sp.）。

本发明菌剂具有以下优点：

1.利用本发明的微生物菌剂同时防治根结线虫和真菌病害。菌剂具有 无毒无害、环境友好、使用安全等特点，适用于绿农业生产。

2.本发明所使用的菌种是从自然环境中分离筛选所得的土著菌，将土 著菌通过人工培养后应用于自然，不会破坏原有的生态环境；并且菌剂施 用后，菌种可在作物根围迅速定植，具有很好的环境适应能力。

3.本发明在菌剂中添加海藻糖、几丁质及糊精，可增加菌剂保存时间， 提高菌剂防病效果。所添加的糊精、磷酸二氢钾、硫酸镁及氯化钠等养分， 可增加菌剂在土壤中的存活能力及繁殖速度。

4.本发明所得菌剂制备工艺简单，易于大规模生产。

具体实施方式

下列制备实例、试验结果可用来进一步说明本发明，但不意味着限制 本发明，本发明中除另有注明外，所用原料均有市售。

实施例1

1）菌种分离

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KJB04-11，已于2010年9月28 日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学， 保藏号为：CCTCC M2010254；

枯草芽孢杆菌KJB04-11单细胞呈杆状，长2.5-3.0μm，宽0.8～1.0 μm，其芽孢长1.0-1.5μm，宽0.7～0。8μm。菌落圆形，淡黄，表面粗 糙，边缘不整齐。革兰氏染阳性；接触酶、V-P测定、硝酸盐还原反应呈 阳性；可水解淀粉、酪素；可液化明胶；能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、 D-木糖、D-甘露醇产酸。

灰链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02，已于2010年9月28 日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学， 保藏号为：CCTCC M2010253。

灰链霉菌（Streptomyces griseus）KJA04-02菌株基丝无隔，不断 裂，孢子丝呈链状直丝。菌落圆形，表面有皱状隆起，边缘整齐向四周呈 放射状扩散，粉状；气生菌丝单叉分支，孢子丝波曲形。可液化明胶，水 解淀粉，可产生硫化氢，产生黑素，在纤维素上不能生长，对木糖、山 梨醇、甘露醇半乳糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖都有不同程度的利用能力。

2）将芽孢杆菌和链霉菌分别扩大培养

芽孢杆菌：

①斜面培养：培养基配方为：牛肉膏0.3克、蛋白胨1.0克、氯化钠0.5 克、琼脂2克，pH7.2，水100mL。将芽孢杆菌接种到上述培养基的斜面上， 37℃培养24小时，然后做成菌悬液，调节菌悬液菌数为10⁸个/mL。

②扩大培养：按1%体积的接种量将芽孢杆菌接种到去掉琼脂的斜面培 养基中，200转/分钟，37℃振荡培养24小时，制得一级种子。再将一级种 子液按1%体积的接种量接种至装有60L培养基的100L发酵罐中，在罐温 37℃、罐压0.05MPa、通气量为48L/分钟、搅拌速度为180转/分钟的条 件下培养24小时结束发酵。得到芽孢杆菌发酵液。

其中接种一级种子液的培养基配方为：蔗糖20g，蛋白胨5g，硝酸钠 2g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.2，硫酸亚铁0.005g，pH7.2， 水1000mL。

链霉菌：

①斜面培养：培养基配方为：淀粉20g，硫酸镁0.5g，硝酸钾1g， 氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，水1000mL，pH7.4。将 链霉菌接种到上述培养基的斜面上，30℃培养120小时，用无菌水将孢子洗 下，制成孢子悬液，调节孢子悬液孢子数为10⁸个/mL。

②扩大培养：按1%体积的接种量将芽孢杆菌接种到去掉琼脂的斜面培 养基中，200转/分钟，37℃振荡培养24小时，制得一级种子。再将一级种 子液按1%体积的接种量接种至装有60L牛肉膏蛋白胨培养基的100L发酵 罐中，在罐温28℃、罐压0.05MPa、通气量为60L/分钟、搅拌速度为180 转/分钟的条件下培养120小时结束发酵。得到链霉菌发酵液。

3）收集菌体

将上述芽孢杆菌发酵液及链霉菌发酵液分别用管式离心机收集菌体， 均以16300转/分钟的转速分离，离心后分别得到芽孢杆菌菌体及链霉菌菌 体。

4）将菌种与载体及辅料混合

按组分重量百分比将载体草碳土440克、硅藻土300克和芽孢杆菌菌 体15克、链霉菌菌体35克混合均匀，再与海藻酸钠30克、几丁质30克、 糊精70克、磷酸二氢钾30克、硫酸镁10克、氯化钠40克充分混合均匀， 制得微生物菌剂。其中，菌剂有效活菌数≥3亿个/克。

应用方式：

在黄瓜定植时，整好地后开定植穴，穴深15厘米，将生防菌剂按用量 1公斤/亩放入穴中，挑选整齐一致的壮苗放入穴中，浇定植水。，防治黄瓜 根结线虫病害及土传真菌病害，防治效果达65%以上。

实施例2

与实施例1不同之处在于：

4）将菌种与载体及辅料混合

按组分重量百分比将载体草碳土480克、硅藻土250克和芽孢杆菌菌 体20克、链霉菌菌体40克混合均匀，再与海藻酸钠20克、几丁质20克、 糊精80克、磷酸二氢钾40克、硫酸镁15克、氯化钠35克充分混合均匀， 制成多功能生防菌剂。在番茄定植时，整好地后开定植穴，穴深15厘米， 将生防菌剂按用量1公斤/亩放入穴中，挑选整齐一致的壮苗放入穴中，浇 定植水。将生防菌剂以1公斤/亩穴施，防治蔬菜根结线虫病害及土传真菌 病害，防治效果达70%以上。