一种剑尾鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用

本发明涉及一种细胞系及其构建方法和应用，具体涉及一种剑尾鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用，属于医学生物技术领域。

剑尾鱼(Xiphophorus helleri，swordtail fish)是热带亚热带小型鱼类，分类学地位为硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鳉形目(Cyprinodontiformes)、胎鳉科(Poeciliidae)、剑尾鱼属(Xiphophorus)。剑尾鱼体型小、胎生、繁殖周期短、便于实验室内饲养管理，且具有对多种农药、重金属等毒物较敏感等特征，是水环境监测、毒理性试验及水生动物病毒检测的理想试验水生动物。

鱼类细胞作为其鱼体组织的细胞模型，广泛应用于生物医学研究领域及环境污染物的检测及毒性研究，为研制相关鱼类疫苗以及环境污染物检测研究奠定了基础。鱼类细胞作为科研材料较活鱼样本有着不可忽视的优点(于淼等2003)：(1)实验成本较低，实验鱼的养殖需要添加大体积的养殖设备和增氧设备等，培养鱼类细胞只需为细胞添加必要的培养基及血清，无需投入大量的人力物力，节约了实验成本；(2)可重复性好，采用活鱼进行实验，不同批次的鱼体，以及相同批次的鱼体之间不同的生长状况都可能会造成实验结果的差异，而使用鱼类细胞作为实验材料时，只需精确控制实验条件即可重复实验，使获得的结果前后差异性较小。

鱼类细胞培养在病毒学方面的应用主要包括以下几个方面：(1)病毒的分离和鉴定：对患病的鱼体进行病料采集，将鱼类细胞作为培养材料，接种可疑病毒，进行病毒的分离，而在对可疑病毒进行鉴定时一般运用荧光抗体技术以及中和试验。当病料中不止一种病毒，或者存在相同病毒的不同株，都可以通过细胞的多次传代培养实现病毒的分离，最终得到单株的病毒。(2) 病毒致病机制的研究：在对病毒进行分离鉴定后，可向鱼类细胞接种病毒，通过观察细胞的生长状况，生理变化以及细胞为应对该种病毒的侵染所作出的胞内的一系列生理生化反应，来研究病毒的致病机理。(3)病毒的增殖：利用细胞进行病毒的增殖，其阳性感染率高；通过病毒的增殖，可对病毒进行分子生物学方面的研究与应用，包括对病毒的肽段结构的研究，以后后续制备抗体以及相关的疫苗研制。(4)病毒易感性研究：一些水生病毒可使多种鱼类患病，一些鱼类可同时感染好几种水生病毒。因此，利用鱼类细胞进行病毒易感性的研究，从而筛选并建立敏感细胞株，对抗体制备、疫苗研制以及针对鱼体的临床用药、疫苗投放具有重要意义。(5)流行病学研究：一些水生动物病毒可能具有多种血清型的毒株，甚至是同一血清型的病毒还具有毒性强弱的区别。通过鱼类细胞培养技术，可对具有不同血清型的病毒进行毒株的分型，对病情的诊断以及病源的确认起到了方向性的指导作用。

药品和个人护理用品(Pharmaceuticals and personal care products，简称PPCPs)的环境污染问题，由Daughton(Daughton&Ternes，1999)在《Environmental HealthPerspectives》中首次提出以后，就引起了广泛的关注。PPCPs包括各种药用化合物，例如中药、止痛剂、抗生素、、B2 受体阻滞药、镇定剂等，以及日常护理用品，如个人皮肤护理及化妆用品、芳香剂、防腐剂、洗涤剂、遮光剂、发型定型剂、牙齿护理用品等，涵盖范围极为广泛，且在日常生活中大量使用。医药品经人体或动物摄入后，只有少部分发生代谢，大部分以原形最终通过尿液或粪便进入污水中，PPCPs在生态系统中具有较强的持久性、生物活性、生物累积性和缓慢生物降解性的特点，长期暴露于人体和水生、陆生生物体，会给人类健康和生态环境带来潜在的危险。

细胞素P450酶是机体参与有机污染物代谢的重要酶系，在机体解毒中起重要作用，是污染物早期毒性评价的优良指标。鱼类细胞系经长期的继代培养，细胞功能趋于特化，可能导致某些主要功能的丧失。研究表明，许多鱼类细胞系已不具备表达细胞素P450酶的功能，使其在有机污染物评价应用中大打折扣。

CYP 3A基因属于Ⅰ相代谢酶中的细胞素P450家族，细胞素P450家族对许多内源性和外源性的化学物质尤其是对环境有害化学物质存在氧化代谢作用。CYP 3A是一种重要CYP450酶系，在肝脏及肠道中含量丰富，CYP 3A 在外源物代谢中起着重要作用，临床中约有60％的药物经由CYP 3A代谢。

由于病毒性疾病对淡水鱼养殖造成巨大危害，国内众多研究机构从病原、宿主和环境的各方面对淡水鱼病毒展开积极研究，试图寻求控制该病的有效方法。到目前为止鱼类病毒性疾病还没有特效药物，免疫预防是控制病毒性病害最有效的防治方法。建立病毒的敏感细胞系是研发疫苗的第一步，也是研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要体系。因此，建立敏感细胞系，是进行淡水鱼病毒的分离与鉴定，研究病毒致病机理，疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。同时，伴随鱼类细胞体外培养技术的不断发展进步，人们开始使用体外培养的鱼类细胞系进行环境污染物的检测及毒性研究。生物体在接触污染物时会出现自我解毒、排毒、免疫等“整体效应”，体外培养的鱼类细胞系细胞具有平行性好，无个体差异，均一性好，对污染物的作用直接，有针对性，而且便于观察等特点，可以快速灵敏有效地对环境污染物进行生物检测。

鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感同时又具有响应污染物的基因表达的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以建立一株需要鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。

迄今为止，已有剑尾鱼脑细胞系、剑尾鱼胚胎细胞系等几个细胞系的文献报道，但是仍未见剑尾鱼仔鱼细胞系的报道。

有鉴于此，本发明提供了一种剑尾鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用，具体采用如下技术方案：

剑尾鱼仔鱼细胞系SFF，于2019年8月16日保藏于中国武汉,武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏登记编号为CCTCC NO:C2019161。

本发明的剑尾鱼仔鱼细胞系具有以下生物学特性：

剑尾鱼仔鱼细胞系具有较强的繁殖能力，呈现典型的上皮样细胞形态；细胞已连续传代培养8年，仍然保持上皮细胞形态特点、生长特性；甚至连续培养100代仍保持较强的生长特性和增殖特性。

本发明细胞系特性稳定，目前传至100代，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。本发明细胞系对多种鱼类病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变，可以直接应用于病原研究。同时可应用于检测环境污染物的研究。

上述剑尾鱼仔鱼细胞系的构建方法，步骤如下：

1)取刚出生的剑尾鱼仔鱼于75％乙醇中消毒5～10s，以PBS漂洗干净后剪碎，加入3～5倍体积的消化液A，混合均匀后均匀涂布到外壁涂覆有0.1％明胶的培养瓶中，并将培养瓶倒置培养箱中27℃恒温，饱和湿度，5％CO2倒置干贴6～8h，然后向培养瓶中加入完全培养液正置继续培养10～15h，添加完全培养液继续培养2～5天，得到原代细胞；

2)待原代细胞铺满单层后，清除完全培养液，以PBS清洗2～3次，加入胰酶消化细胞，加入完全培养液，吹打悬起细胞，27℃恒温进行传代培养，得到剑尾鱼仔鱼细胞系。

本发明对剑尾鱼仔鱼进行细胞培养，初步确定了细胞的培养条件，进行了染体分析，检测了细胞对多种水生动物病毒的敏感性，并对抗生素类环境污染物利福平对细胞的诱导效应进行了研究，该细胞系的建立为后期水生动物病毒的研究及细胞系作为体外毒理学细胞模型应用于环境污染物的毒理学相关研究奠定了基础。

进一步，步骤1)中的消化液A为含有0.1％的胶原酶Ⅰ(w/v)和5％胎牛血清(w/v)的DMEM/F-12培养液。

进一步，完全培养液为胎牛血清、剑尾鱼脑细胞培养24～48h后的过滤液、碱性成纤维样生长因子、表皮生长因子、青霉素、链霉素、两性霉素B、 DMEM/F-12培养液的混合液；优选的，完全培养液为20％胎牛血清、10％～20％剑尾鱼脑细胞生长液、20ng/L碱性成纤维样生长因子、1ng/ml的表皮生长因子、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B，PH值为 7.2～7.4的DMEM/F-12培养液的混合液。

上述剑尾鱼脑细胞生长液的制备方法是：取培养24～48h的剑尾鱼脑细胞，将细胞培养液置于50mL离心管，4℃下，转速5000～6000rpm/min离心5～ 10min，取上清过滤膜，4℃保存。

本发明还提供了上述的剑尾鱼仔鱼细胞系在水产动物病毒分离中的应用。

本发明还提供了上述的剑尾鱼仔鱼细胞系在环境污染物监测中的应用。

图1为本发明实施例1剑尾鱼仔鱼细胞形态观察图；

图2为本发明实施例2剑尾鱼仔鱼细胞系的最适条件探究实验结果；

图3为本发明实施例3剑尾鱼仔鱼细胞系染体分析结果；

图4为本发明实施例4剑尾鱼仔鱼细胞系对不同水生动物病毒的敏感性实验CPE结果；

图5为本发明实施例4剑尾鱼仔鱼细胞系对不同水生动物病毒的敏感性实验电泳结果；

图6为本发明实施例5不同浓度利福平暴露剑尾鱼仔鱼细胞24h CYP3A 基因表达结果。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

剑尾鱼仔鱼细胞系SFF的构建

1.制备细胞培养液：

取GIBCO公司DMEM/F-12培养基，加入占所用总体积10～20％的胎牛血清， 10％～20％剑尾鱼脑细胞生长液，20ng/mL的碱性成纤维生长因子(bFGF)， 1ng/mL的表皮生长因子(EGF)，4℃存放，备用；

2原代培养:

取刚出生的剑尾鱼仔鱼(胎生)5～6尾，置于75％乙醇中消毒5～10秒， PBS漂洗干净后置于5mL的无菌青霉素小瓶中，瓶中含200ul PBS，用手术剪将其剪碎；加入3～5倍体积的消化液A，混合均匀；用将混合消化酶的碎组织块均匀涂布到预先用0.1％明胶涂覆外壁的培养瓶中；将培养瓶倒置放入饱和湿度的27℃,5％CO2培养箱中，倒置干贴6～8h后，缓慢加入2mL完全培养基正置继续培养10～15h，添加培养基至5～6mL，继续培养2～5天，得到生长至80％～90％汇合的原代细胞；其中，消化液A的成分是0.1％的胶原酶Ⅰ加 5％胎牛血清。

3.传代培养:

原代仔鱼细胞铺满单层后，用吸管除去旧培养液，用PBS清洗两遍，加入0.25％胰酶(含EDTA)1mL消化细胞，待镜下观察细胞变圆后，加入10mL 完全培养液，吹打悬起细胞，以1:2进行传代，加入完全培养液至5mL/瓶，放入27℃含5％CO2培养箱中进行传代培养；以后约3～5天传代一次；传至第 10代时，细胞培养液中胎牛血清含量减为总体积的10％，培养液中不再添加剑尾鱼脑细胞生长液、青霉素、链霉素、两性霉素B、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子(图1，图1中A为原代细胞；B为15代细胞；C为50代细胞； D为100代细胞)。

完全培养基配方为20％胎牛血清、10％～20％剑尾鱼脑细胞生长液、20ng/L 碱性成纤维样生长因子(bFGF)、1ng/mL的表皮生长因子(EGF)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B，PH值为7.2～7.4的 DMEM/F-12培养液。

剑尾鱼脑细胞生长液的制备：取培养24～48h的剑尾鱼脑细胞，将细胞培养液置于50mL离心管，4℃下，转速5000～6000rpm/min离心5～10min，取上清过滤膜，4℃保存备用。

实施例2

剑尾鱼仔鱼细胞系的最适条件确定

1、剑尾鱼仔鱼细胞系最佳培养基的确定

选择DMEM/F-12、M199、DMEM/F-12和L-15混合培养基(1:1)、L-15四种细胞培养基，并添加终浓度为10％的FBS制备细胞培养液。调整细胞密度为5×104mL-1，四种培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。确定其最适培养基为DMEM/F-12和L-15混合培养基(1:1)(图2A)。

2、剑尾鱼仔鱼细胞系最适血清浓度的确定

分别配制FBS浓度为5％、10％、15％、20％的培养液，调整细胞密度为5× 104mL-1，四种血清浓度培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线，发现FBS浓度为10％～20％均适合剑尾鱼仔鱼细胞系的培养(图2B)。

由图2可知，剑尾鱼仔鱼细胞系在胎牛血清15％的DMEM/F-12和L-15混合培养基(1:1)中，增殖最好。

实施例3

细胞的冻存与复苏

1、细胞的冻存

用胰酶消化法收集1瓶(25cm2)处于对数生长期的剑尾鱼仔鱼细胞，1000g 离心5min后弃去上清，用1mL冻存保护液(含20％FBS和10％DMSO的 DMEM/F-12和L-15混合(1:1)培养液)将细胞重悬后置于冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中于-80℃过夜，最后投入液氮(-196℃)中长期保存，并做好记录。

2、细胞的复苏

复苏细胞时，从液氮中取出冻存管，于37℃水浴中迅速解冻，1000g离心5min收集细胞后接种于25cm2的培养瓶中，放置于培养箱中27℃培养，待细胞贴壁后弃上清，更换培养液，继续培养。

将复苏后的细胞进行台盼蓝染，用细胞计数仪测定细胞的成活率＞90％ (图3)。

实施例4

剑尾鱼仔鱼细胞对5种水生动物病毒的敏感性

将生长状况良好的剑尾鱼仔鱼进行传代，充分混匀后分装至T25细胞培养瓶中，当细胞刚刚长满培养瓶底部时铺满瓶底80-90％时，选择相同生长状态的细胞，吸弃旧培养基，HBSS缓冲液清洗两次，分别接入1mL 4种常见的淡水鱼类病毒：鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)、蛙虹彩病毒(Frog virus3,FV3)、基因I型草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)，罗非鱼湖病毒(TiLV-2017A)，PBS作为空白对照组根据培养温度不同，分别设立空白对照，病毒孵育1h后，弃病毒液，加入5mL细胞维持液(含5％FBS的完全培养基)，接入种SVCV的细胞培养瓶置于22℃恒温培养箱，其他细胞瓶放置28℃的培养箱，每天观察细胞生长CPE情况，监测是否出现病变，一旦出现CPE病变，在细胞未完全脱落之前收集细胞悬液并进行核酸提取然后进行PCR检测，未出现病变的接毒组盲传3代后收集样本进行PCR实验，通过检测病毒转录本分析病毒是否在剑尾鱼仔鱼细胞中增殖。收集样本时将培养瓶取出，放置于-20℃冰箱过夜，后取出待培养基融化后，用力敲打培养瓶，使细胞完全脱落，吹打混匀冻融后，取出200μL细胞悬液于离心管中进行核酸提取。

剑尾鱼仔鱼细胞接种4种水生动物病毒后，如图4所示，其中，A为SFF 空白对照，B为SFF接种TiLV后产生的CPE，C为SFF接种SVCV后产生的CPE， D为SFF接种FV3后产生的CPE，E为SFF接种GCRV后产生的CPE，可见，细胞内出现明显的细胞病变(CPE)，在接种第5d收集各病毒悬液200μL提取核酸进行PCR检测。其中TiLV-2017A目的条带为700bp,SVCV的检测为半套式反应，反应结束后，两次PCR的产物能分别检测到714bp和606bp的片段，FV3目的条带为531bp，基因I型GCRV的目的条带为661bp。根据PCR及凝胶电泳实验结果，在接种各种病毒的细胞中均检测到了对应的目的条带(图5)，图5中，M:1000bp分子量标准；2,4,6,8,10:正常SFF细胞；1:感染 TiLV-2017A的SFF细胞3:感染SVCV的SFF细胞(套式PCR产物)；5:感染SVCV的SFF细胞(普通PCR产物)；7:感染FV3的SFF细胞；9:感染基因I型GCRV的SFF细胞，说明剑尾鱼仔鱼细胞系能够增殖病毒TiLV、FV3、 GCRV、SVCV，为水生动物的研究提供了有力的材料。

实施例5

利福平RIF暴露剑尾鱼脑细胞后对细胞素P450基因表达的影响

将剑尾鱼脑细胞悬浮液接种至六孔培养板中，至密度为2×105个/mL。以含10％(v/v)FBS的DMEM/F12和L-15(1:1)培养基置于5％CO2、27℃细胞培养箱中预培养24h，待细胞贴壁生长后，吸去培养基，重新加入含不同浓度的 RIF或对照的培养基，继续培养48h进行暴露实验。RIF溶于二甲基亚砜DMSO，溶剂的最终浓度不超过0.1％。DMSO暴露组设为对照。RIF暴露浓度梯度为10、 20、50、100nmol·L-1。暴露结束后，倒去培养基，用D-hanks缓冲液清洗，经处理后细胞用于CYP3A基因表达检测。

经RIF诱导的剑尾鱼仔鱼细胞样本，提取总RNA，经Real-time RT-PCR扩增，选用管家基因(β-actin)对CYP3A基因mRNA进行相对表达量分析。经SPSS 16.0统计软件中Paired-Samples T-Test检验样本差异分析。

图6为不同浓度RIF对剑尾鱼仔鱼细胞CYP3A mRNA表达的影响，实验结果表明，诱导后48h所有浓度诱导组与对照组相比，CYP3A mRNA表达量显著性增高(p<0.01)，且10～100nmol·L-1与CYP3A mRNA表达量之间存在很好的剂量-效应关系，随着诱导浓度的加大，基因的表达量随之升高，在浓度组 50nmol·L-1达到最大的基因表达量。本研究结果显示，在10～100nmol·L-1浓度RIF暴露下，CYP3A mRNA水平明显升高。

上述实施例将剑尾鱼仔鱼细胞系对环境污染物利福平进行了相关生物标志物细胞素P450基因水平的检测，结果证实该细胞系都能有效的检测利福平RIF对生物标志物的诱导效应，可以作为检测环境污染物的实验材料，为剑尾鱼用于环境污染物的检测提供了一个理想的体外研究体系。