一种改善动脉粥样硬化炎症的动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合物制备方法及应用

本发明属于食品微生物技术领域，尤其涉及一种降脂抗炎改善动脉粥样硬化益生菌与磷虾油组合物片剂、颗粒剂、胶囊剂制备方法及应用效果。

动脉粥样硬化与心血管疾病的发生发展密切相关，并伴随着严重的并发症。现有的研究都认为动脉粥样硬化是一个复杂的代谢紊乱过程，其发生和发展是在遗传和环境因素的基础上，由多种危险因素共同作用导致的。动脉粥样硬化斑块的发展涉及异常的炎症细胞募集、泡沫细胞形成、平滑肌细胞增殖、细胞外基质合成、活性氧产生和动脉重塑等。在这些变化中,炎症在动脉粥样硬化的发生和发展过程中起关键作用。益生菌通过调节脂质代谢改善动脉粥样硬化的研究较多，但从炎症通路方向探究的仍然较少，未能系统阐述益生菌与动脉粥样硬化炎性反应间的关系。

从南极磷虾(Euphausia superba)中提取的磷虾油(KO)含有丰富的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等不饱和脂肪酸，对于脂质代谢炎症反应起关键调节作用。KO还含有一定剂量的虾青素，该成分被认为是磷虾油在人类受试者中的抗炎、镇痛和降血脂特性的原因。有研究发现磷虾油可以改善肠道内菌结构及代谢产物，例如磷虾油对宿主和微生物组氨酸代谢的关键代谢物的抑制作用有助于其抗炎活性。近年来，活性物质与益生菌交互作用改善疾病的效用备受瞩目，但其益生菌靶向调控参与改善疾病的具体机制仍未研究透彻，益生菌与活性物质交互作用机制也不明确。因此，筛选并开发优良的改善动脉粥样硬化益生菌+活性物质组合产品具有重要的研究意义和应用价值。

现有专利或专利申请的共同点都是应用益生菌与多种成分混合使用来预防或缓解动脉粥样硬化，益生菌与单独活性物质互作改善疾病的相关研究较少，其相关机制不明确。有关益生菌与磷虾油组合的动脉粥样硬化炎性反应缓解物质目前未见报道。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种改善动脉粥样硬化组合物、片剂、颗粒剂、胶囊剂制备方法及应用、尤其涉及一种能够显著缓解动脉粥样硬化炎症反应的动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合物及其用途。

本发明是这样实现的，一种改善动脉粥样硬化组合物，所述改善动脉粥样硬化组合物由动物双歧杆菌F1-7和磷虾油（动物双歧杆菌F1-7菌液与磷虾油混合，比例为1:5~1:10，浓度分别为108 CFU/mL和6 mg）组成。

本发明的目的在于提供一种改善动脉粥样硬化组合物片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服制剂在抵抗炎症反应改善动脉粥样硬化中的应用，其特征在于，动物双歧杆菌F1-7与磷虾油磷虾油组合后，具有减少炎性发生，缓解动脉粥样硬化的功能。

本发明的另一目的在于提供一种改善动脉粥样硬化组合物片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服制剂在抵抗炎症反应改善动脉粥样硬化中的机制，其特征在于，通过作用TLR4/NFκB途径，减少肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β（IL-1β）的表达，减轻炎症反应，进而起到缓解动脉粥样硬化的作用。

根据权利要求2所述复合制剂，其特征在于：所述组合物添加保健食品、特殊医学配方食品、特殊膳食食品可接受的辅料，制成片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服制剂供商业生产

本发明涉及的仅需单菌株+单种活性物质便具有良好的改善动脉粥样硬化效果，因此可以作为搭配传统药物的优良微生物制剂，用于调节炎症反应改善脂质斑块堆积。因此，本发明主要有以下优点：（1）菌株抗炎性能突出。本发明提供的动物双歧杆菌F1-7具有良好的动脉粥样硬化相关炎症改善能力。（2）组合物缓解动脉粥样硬化斑块效果显著。当动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合后，针对Apoe-/-小鼠，具有显著的改善效果，效果优于二者单独作用。

综上，本发明提供的益生菌组合物具有优良的缓解动脉粥样硬化炎性反应效果，具有非常广泛的应用前景。

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的改善动脉粥样硬化组合物产品的制备方法流程图。

图2 是本发明实施例提供的动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合对Apoe-/-小鼠的主动脉横切片HE示意图。

图3是本发明实施例提供的动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合对Apoe-/-小鼠血清炎性因子IL-1β含量示意图。

图4是本发明实施例提供的动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合对Apoe-/-小鼠血清炎性因子TNF-α含量示意图。

图5是本发明实施例提供的动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合对Apoe-/-小鼠主动脉炎性因子相关指标表达的组化示意图。

图6 是本发明实施例提供的动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合对Apoe-/-小鼠炎性反应关键基因表达水平示意图。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种改善动脉粥样硬化组合物、制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的改善动脉粥样硬化组合物由动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组成。所述的动物双歧杆菌F1-7在中国典型培养物保藏中心保藏，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期2020年12月02日，保藏号为CCTCC NO: M 2020833，分类名称为动物双歧杆菌亚种F1-7 Bifidobacterium animalis subsp F1-7。动物双歧杆菌F1-7的16sRNA的序列为：GGGTGGGGGGCGTTCTTACACATGCAGTCGAACGGGATCCCTGGCAGCTTGCTGTCGGGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCAACCTGCCCTGTGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATACCGGATGCTCCGCTCCATCGCATGGTGGGGTGGGAAATGCTTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGTGATGGCCCACCAAGGCGTTGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTTCAAGGGCAAGGCACGGTTTCGGCCGTGTTGAGTGGATTGTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCCTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCTTTCCACGGGTCCCGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTGCCGGATCGCCGTGGAGACACGGTTTCCCTTCGGGGCCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCGCATGTTGCCAGCGGGTGATGCCGGGAACTCATGTGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGCGGTGCGACACGGTGACGTGGGGCGGATCGCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGGTGGCCCGACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCTAAGGGTAAGAACTCG。

如图1所示，本发明实施例提供的改善动脉粥样硬化组合物的制备方法包括以下步骤：S101，动物双歧杆菌冻干粉制备：将动物双歧杆菌接种到发酵罐的增菌MRS培养基中培养，发酵液依次进行冷冻前预冷处理、预冻处理、主干燥处理及解析干燥处理，完成双歧杆菌冻干产品的制备；S102，动物双歧杆菌F1-7和磷虾油复合制剂的制备：将108 CFU/mL的动物双歧杆菌F1-7与6 mg 磷虾油混合，比例为1:5~1:10，制备得到复合制剂；S103 动物双歧杆菌F1-7和磷虾油复合制剂干预Apoe-/-小鼠测定其炎症反应指标和相关代谢基因表达；S104，动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物添加辅料制成片剂、颗粒剂、胶囊剂等固体口服制剂。

具体实施例

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1、动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物对动脉粥样硬化改善作用

对心血管组织进行HE染(图2)，动脉粥样硬化组Aope-/-小鼠心血管内皮细胞广泛损伤脱落,脂质沉积,见平滑肌细胞胞浆空泡状,胞浆疏松淡染，平滑肌细胞排列紊乱，且血管内壁明显可见较大斑块样物质。磷虾油组可见少量斑块附着于内壁，小鼠心血管内膜轻度破损, 平滑肌细胞排列较整齐，有增生，胞核密度增加，一些平滑肌细胞有空泡状改变。而益生菌组以及动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合组基本无斑块沉着，小鼠心脏动脉内膜光滑，内皮细胞完整，内膜下间隙较小，平滑肌细胞排列相对整齐，胞浆染红染。

实施例2、动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物抗炎效果

测定动脉粥样硬化小鼠体内炎性变化水平，发现动物双歧杆菌F1-7，磷虾油以及二者混合物可以有效改善小鼠血清炎性水平。与AS组相比，动物双歧杆菌F1-7、磷虾油和动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合可以显著降低血清中IL-1β（图3）以及TNF-α（图4）的水平，且各组间无统计学差异。

TLR4免疫组化染（图5）显示，与动脉粥样硬化模型组AS相比，动物双歧杆菌F1-7，磷虾油与二者混合物组TLR4阳性区域显著降低，其中动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合作用效果优于其他两组。MYD88的免疫组化结果与TLR4一致，三组均能减少主动脉窦MYD88的表达含量，减少促炎信号的转导，动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组作用效果最优。NFκB的组化结果显示三组均可改善动脉粥样硬化小鼠的炎性表达。

实施例3、动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物抗炎机制

测定肠道内炎性反应相关基因的表达情况（图6）。与AS组相比，动物双歧杆菌F1-7，磷虾油以及二者混合物能够显著降低TNF-α的表达。其中，动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组的作用效果显著优于其他两组。给与益生菌、磷虾油及混合物干预后，IL-1β的表达显著降低，各组间无差异。干预组还能有效降低TLR4/MYD88/NF-κB通路上关键基因的表达，从而抑制下游炎性因子TNF-α和IL-1β的水平。动物双歧杆菌F1-7和磷虾油调节TLR4和MYD88的作用效果无差异，动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合下调效果最显著。在NFκB的下调作用中，，动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组的结果无差异且优于组合组（p<0.05）。总结三组干预组的抗炎效果，动物双歧杆菌F1-7，磷虾油以及二者混合物均能有效改善炎性反应中组合组的作用效果优于二者单独作用。研究发现动物双歧杆菌F1-7和磷虾油互作能够起到更好的抗炎效果，改善动脉粥样硬化相关的炎性反应。

实施例4、产品与剂型

（1）动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物片剂

将动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物配合片剂领域的原辅材料葡萄糖、乳糖、微晶纤维素、硬脂酸镁以及脱脂奶粉等，经常规制剂技术制成的片状制剂。

（2）动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物颗粒

将动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物添加辅料奶粉、淀粉、常规甜味剂、香精等调味剂配比进行生产。

（3）动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物胶囊剂

动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物经胶囊机制作成为胶囊产品。

本发明涉及的仅需单菌株+单种活性物质便具有良好的动脉粥样硬化缓解作用。通过动脉粥样硬化模型Apoe-/-小鼠进行验证,益生菌动物双歧杆菌F1-7和磷虾油混合物能够有效缓解动脉粥样硬化斑块的堆积。因此，本发明主要有以下优点：1. 动物双歧杆菌Bifidobacterium animalissubsp F1-7具有改善动脉粥样硬化的效果，起到有效抗炎作用。2.组合物减少动脉粥样硬化斑块效果显著。当动物双歧杆菌F1-7和磷虾油组合后，针对动脉粥汤硬化模型Apoe-/-小鼠，具有显著的改善效果。动物双歧杆菌F1-7和磷虾油互作可以通过作用于TLR4/MYD88/NF-κB通路有效改善机体炎性反应，减少斑块形成，且优于二者单独作用。