一种鸭瘟活疫苗及其制备方法

一种鸭瘟活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸭瘟活疫苗及其制备方法，属兽用生物制品领域。

背景技术

鸭瘟（duck plague），也称为鸭病毒性肠炎（duck virus enteritis），是由鸭肠炎病毒（duck  enteritis virus）或称鸭瘟病毒（duck plague virus）或称鸭瘟疱疹病毒（duck plague herpesvirus） 引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性、热性、败血性的传染病，其特征是血管损伤、组织 出血、消化道粘膜糜烂、淋巴器官出现病变、实质器官退行性病变（Saif Y M.禽病学(第11 版).高福,苏敬良译.北京:中国农业出版社,2005：389‑398）。1923年荷兰首次报道了该病（Baudet, A.E.R.F.1923.Mortality in ducks in the Netherlands caused by a filterable virus.Fowl plague. Tijdschr Diergeneeskd 50:455–459.）。1957年，黄引贤在我国最早报道该病并分离到病毒（黄 引贤.拟鴨瘟的研究.华南农学院学报.1959,1:67‑78.）。该病发病率和死亡率很高，对水禽养殖 业危害很大。目前预防鸭瘟的主要措施为疫苗免疫接种。常用的疫苗有灭活疫苗和活疫苗。 鸭瘟灭活疫苗是由鸭瘟病毒鸭胚适应毒灭活后加油佐剂乳化而成。鸭瘟活疫苗是由鸭瘟病毒 鸡胚化弱毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥而成（中国兽药典委员会.中华人民共和 国兽药典二〇一〇年版（三部）.中国农业出版社，2011，本发明以下简称《兽药典》）。鸭瘟 病毒鸡胚化弱毒是鸭瘟病毒经过鸭胚连续传代10代后，再经鸡胚传代60多代致弱，对鸭的 致病力减弱。该病毒的全基因组约为158091bp（GenBank No.EU082088）。

本发明使用的原始种毒为中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）保存的鸭瘟疱疹 病毒强毒CVCC AV1221株，全基因组为162131bp（GenBank No.JQ673560），与鸭瘟病毒鸡 胚化弱毒相比，存在两个额外的大片段（3513bp和528bp）。

注：本发明所涉及的鸭瘟（duck plague），也称为鸭病毒性肠炎（duck virus enteritis），其 病原为鸭肠炎病毒（duck enteritis virus）/或称鸭瘟病毒（duck plague virus）/或称鸭瘟疱疹病 毒（duck plague herpesvirus）。

发明内容

本发明的目的是培育一株免疫原性和安全性都好的鸭肠炎病毒（duck enteritis virus）弱 毒病毒株，并用此弱毒株病毒作为鸭瘟活疫苗的生产毒种，制备出一种鸭瘟活疫苗提供鸭瘟 防疫使用。

本发明的技术方案

1.一株鸭肠炎病毒（duck enteritis virus）是一株弱毒株，该株病毒已于2013年04月26 日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CGMCC No.7460。

2.该鸭肠炎病毒CGMCC No.7460是鸭瘟疱疹病毒强毒株CVCC AV1221经鸡胚成纤维 细胞连续传代、克隆纯化得到的弱毒株病毒；CGMCC No.7460毒株全基因组为160330bp， 与鸭瘟疱疹病毒强毒CVCC AV1221株基因组（GenBank No.JQ673560）相比，缺失了 145818‑147618位的核苷酸共1801bp。

3.一种鸭瘟疫苗主要含有鸭肠炎病毒CGMCC No.7460株，其制备方法主要为：将鸭肠炎 病毒CGMCC No.7460株接种于SPF鸡胚制备的CEF单层细胞，培养至当病变率达75％以 上收获病毒培养物，加常规冻干稳定剂，混匀后再经冷冻真空干燥制成鸭瘟活疫苗。

给鸭接种有效剂量的疫苗，能使接种的鸭获得对鸭瘟疱疹病毒强毒株有效的免疫力。

4.该鸭肠炎病毒CGMCCNo.7460株的基因组145818‑147618位缺失区域按常规生物学技 术插入不同的水禽病毒的保护性抗原基因片段构建成相应的重组病毒，分别用于制备活载体 疫苗，同时预防鸭瘟和相应的水禽疾病。

本发明具体方式

1.生产种毒

1.1原始种毒来源

原始种毒为中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）保存的鸭瘟疱疹病毒强毒株， 目录编码为CVCC AV1221（见中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著. 中国兽医菌种目录第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p138）。

1.2弱毒株的培育

鸭瘟病毒AV1221株经无特定病原体（Specific pathogen free,SPF）鸡胚成纤维细胞（chick  embryo fibroblast,CEF）连续传代80代，克隆纯化得到的弱毒株，命名为鸭肠炎病毒（duck  enteritis virus）DEVC86株，该毒株已于2013年04月送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号 CGMCC No.7460。

1.3生物学特性

1.3.1繁殖特性

鸭瘟病毒DEVC86株接种SPFCEF细胞，感染复数（MOI）为0.01，测定病毒一步生长 曲线，结果见表1，培养48小时病毒含量达最高，为10^6.8TCID₅₀/0.1ml，说明该病毒在CEF 中具有良好的繁殖特性。

表1鸭瘟疱疹病毒DEVC86株不同培养时间的病毒含量

注：‑，表示均未出现临床症状。

1.3.3免疫原性

取21日龄SPF鸭16只，分成4组，每组4只。第1‑3组，分别肌肉注射免疫10^‑4～10^‑6 稀释度的鸭瘟病毒DEVC86株，第4组不免疫，作为攻毒对照。免疫后14日，每只鸭肌肉 注射1000最小致死量（MLD）的鸭瘟病毒强毒（CVCCAV1221），观察14日，结果见表3， 10^2.8TCID₅₀的病毒能100%抵抗鸭瘟病毒强毒株的攻击，说明该病毒具有良好的免疫原性。

表3不同免疫剂量对鸭的保护性

1.3.4稳定性

鸭瘟病毒DEVC86株，在CEF连续传代20代后获得了鸭瘟病毒DEVC106株；DEVC86 株在SPF鸭体内连续传5代，获得了DEVC86‑D5。测定传代后毒株的免疫原性和对雏鸭的 安全性，结果表明，鸭瘟病毒DEVC106株和DEVC86‑D5免疫原性与DEVC86株一致；对7 日龄雏鸭安全，具有稳定的生物学特性，见表4。

表4鸭瘟病毒DEVC86株的稳定性

1.3.5全基因组序列

应用Roche公司的454技术，对鸭瘟病毒致弱毒株DEVC86（CGMCCNo.7460）株进行 全基因组测序，毒株全基因组为160330bp；与鸭瘟病毒强毒CVCCAV1221株（GenBank No. JQ673560）基因组162131bp相比，CGMCCNo.7460株缺失了145818‑147618位的核苷酸共 1801bp。

鸭瘟病毒致弱毒株DEVC86（CGMCCNo.7460）株可用作活载体，该鸭瘟病毒CGMCC  No.7460株的基因组145818‑147618位缺失区域按常规生物学技术插入不同的水禽病毒的保 护性抗原基因片段构建成相应的重组病毒，分别用于制备活载体疫苗，同时预防鸭瘟和相应 的水禽疾病。

2.制造疫苗方法

将鸭瘟病毒DEVC86株接种SPFCEF，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干 燥制成疫苗。

3.疫苗成品检验本发明涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典（中国兽药典 委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版（三部）.中国农业出版社，2011，本发明称《中 国兽药典》）的方法进行。

（1）性状淡黄海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

（2）无菌检验按《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

（3）支原体检验按《中国兽药典》进行检验，应无支原体生长。

（4）外源病毒检验按《中国兽药典》进行检验，应无外源病毒污染。

（5）鉴别检验将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特 异性血清混合，置室温作用60分钟后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔（48孔细胞板）， 每孔0.2ml,同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组应全部 出现病变，中和组应不出现细胞病变。

（6）安全检验用5～7日龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽 份，观察14日，应全部健活。

（7）效力检验 下列方法任择其一。

①病毒含量测定按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系 列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔（96孔细胞培养板）， 每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed‑Muench 法计算TCID₅₀。每羽份病毒含量应≥10^3.5TCID₅₀。

②用鸭检验用1～3周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1羽 份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注射1000MLD 鸭瘟病毒强毒（CVCC AV1221），观察14日。对照鸭应至少4只死亡，免疫鸭应至少8只保 护。

（8）剩余水分测定按《兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。

（9）真空度测定按《兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。

附图说明

图1：鸭肠炎病毒CGMCC No.7460株（DEVC86株）与鸭瘟疱疹病毒CVCC AV1221 株基因组比较示意图，CGMCC No.7460株缺失了145818‑147618位的核苷酸共1801bp。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及的微生物资源为鸭瘟疱疹病毒（duck plague herpesvirus）CVCCAV1221株来 自中国兽医药品监察所（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国 兽医菌种目录第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p138）及由该毒株人工致弱的鸭肠 炎病毒（duck enteritis virus）DEVC86株，该毒株已于2013年04月26日送交北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心保藏，保藏编号CGMCC No.7460。

本发明的积极意义

本发明涉及一种鸭瘟活疫苗及其制备方法。所提供的鸭肠炎病毒是人工致弱的鸭肠炎病 毒CGMCCNo.7460（DEVC86）株，能在CEF繁殖，病毒含量高，制造疫苗方便；雏鸭安全， 对鸡不致死，具有良好的生物安全性；免疫原性好，能有效地保护各品种鸭抵抗鸭瘟感染； 该鸭肠炎病毒CGMCC No.7460株的基因组145818‑147618位缺失区域按常规生物学技术插 入不同的水禽病毒的保护性抗原基因片段构建成相应的重组病毒。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

——疫苗的制备

本发明所提供的制备鸭瘟疫苗的方法，是将鸭瘟病毒CEF传代致弱株接种长满单层的无 特异性病原鸡的鸡胚成纤维细胞（SPF CEF），收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空 干燥制成疫苗。

1.细胞制备选择发育良好的9～11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培 养24小时左右长成单层备用。

2.病毒液的制备按体积比1.0%～1.5%的接毒量接种CEF细胞单层，37～38℃培养36～ 72小时，当病变率达75％以上收获病毒液，‑20℃结冻保存。

3.半成品的检验

3.1无菌检验 每组分别取样，按《中国兽药典》二〇一〇年版三部进行，为无菌生长。

3.2病毒含量测定 每0.1ml病毒含量≥10^5.5TCID₅₀。

3.3配苗及分装 将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗 生素，充分混匀，定量分装。

3.4冻干 分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版）附录437页迅 速进行冷冻真空干燥。

实施例2

——疫苗成品检验

（1）性状5批淡黄海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

（2）无菌检验按《中国兽药典》规定方法进行检验，5批疫苗均无菌生长。

（3）支原体检验按《中国兽药典》规定方法进行检验，5批疫苗均无支原体生长。

（4）外源病毒检验按《中国兽药典》规定方法进行检验，5批疫苗均无外源病毒污染。

（5）鉴别检验将5批疫苗分别用灭菌生理盐水稀释至100TCID₅₀/0.1ml，与等量抗鸭 瘟病毒特异性血清混合，置室温作用60min后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔（48孔细 胞板），每孔0.2ml,同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组 全部出现病变，5批疫苗的中和组均未出现细胞病变。

（6）安全检验用5～7日龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽 份，观察14日，均健活，无全身和局部反应，结果见表5。

表5鸭瘟活疫苗（DEVC80株）成品安全检验结果

（7）效力检验下列方法任择其一。

①病毒含量测定按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系 列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔（96孔细胞培养板）， 每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed‑Muench 法计算TCID₅₀。检验结果见表6。

表6各批疫苗病毒含量

②用鸭检验取3周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1羽份， 另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注射1000MLD鸭瘟 病毒强毒(CVCCAV1221)，观察14日，对照组全部死亡，免疫组均100%保护，结果见表7。

表7鸭瘟活疫苗（DEVC80株）效力检验——攻毒保护试验结果

（8）剩余水分测定按《兽药典》附录进行测定，结果见表8，均符合规定。

表8各批疫苗剩余水分测定

（9）真空度测定 按《中国兽药典》附录进行测定，5批疫苗出现紫辉光，符合规定。

实施例3

————鸭瘟活疫苗（DEVC86株）与商品化疫苗效力对比试验

取25只8周龄易感鸭，分成3组。第1组，10只，肌肉注射鸭瘟病毒DEVC86株活疫 苗001批，1羽份/只；第2组，10只，肌肉注射鸭瘟病毒鸡胚化弱毒活疫苗（企业生产，批 号2012003），1羽份/只5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注 射1000MLD鸭瘟病毒强毒(CVCCAV1221)，观察14日，对照组全部死亡，免疫组均100% 保护，结果见表9，表明鸭瘟病毒DEVC86株制备的活疫苗与商品化疫苗效果一致。

表9鸭瘟活疫苗（DEVC86株）与商品化疫苗效力对比试验

实施例4

————鸭瘟活疫苗（DEVC86株）与鸭瘟病毒鸡胚化弱毒疫苗种毒安全性对比试验

取10只7日龄SPF鸭，分成2组，每组5只。第1组，肌肉注射鸭瘟病毒DEVC86株， 10^6.0TCID₅₀/只；第2组，肌肉注射现有商品化疫苗——鸭瘟病毒鸡胚化弱毒活疫苗种毒（CVCC  AV1222，F63，2008年4月冻干），10^6.0TCID₅₀/只。隔离饲养，观察14日，接种鸭全部健活， 未出现任何临床症状，结果见表10，说明鸭瘟病毒DEVC80株和鸭瘟病毒鸡胚化弱毒疫苗种 毒，对雏鸭安全。

表10对不7日龄雏鸭安全性

注：‑，表示均未出现临床症状。

实施例4

鸭肠炎病毒致弱毒株DEVC86（CGMCCNo.7460）株可用作活载体，在基因组缺失区域 （145818‑147618位）插入禽流感病毒的保护性抗原基因片段构建成的重组病毒，制备活载体 二联疫苗，同时预防鸭瘟和禽流感。

实施例5

鸭肠炎病毒致弱毒株DEVC86（CGMCCNo.7460）株可用作活载体，在基因组缺失区域 （145818‑147618位）按常规生物学技术插入水禽副粘病毒的保护性抗原基因片段构建成的重 组病毒，制备活载体二联疫苗。

实施例6

鸭肠炎病毒致弱毒株DEVC86（CGMCCNo.7460）株可用作活载体，在基因组缺失区域 （145818‑147618位）按常规生物学技术插入鸭病毒性肝炎病毒的保护性抗原基因片段构建成 的重组病毒，制备活载体二联疫苗。

实施例7

鸭肠炎病毒致弱毒株DEVC86（CGMCCNo.7460）株可用作活载体，在基因组缺失区域 （145818‑147618位）按常规生物学技术插入小鹅瘟病毒的保护性抗原基因片段构建成的重组 病毒，制备活载体二联疫苗，同时预防鸭瘟和小鹅瘟。