禽类新城病疫苗用佐剂及其制备方法

禽类新城病疫苗用佐剂及其制备方法

技术领域

本发明系关于一种禽类疫苗用佐剂，特别是关于一种禽类新城病疫苗用佐剂及其 制备方法。

背景技术

疫苗接种被认为是用来预防病毒感染动物的最有效且最具效率的方式。然而，至 今仍有许多病毒性或细菌性疾病尚无可利用的疫苗，或还未能达到足够的免疫作用。此外， 许多疫苗因为其抗原效能太低或使用劣质佐剂、会产生严重副作用、稳定性低或是价格昂 贵而不适用。因此，亟需研发出更有效的疫苗或相关佐剂产品。

很多传染病控制计划的基础系通过用活的微生物或经灭活的微生物或其产物进 行疫苗接种来诱导专一性免疫。有效的疫苗接种程序容许在动物中形成针对专一抗原的免 疫记忆能力，从而在日后与抗原接触时在动物中引起快速且强烈的免疫反应。然而，有些抗 原仅具有弱免疫原性。所述等抗原可能无力诱导在日后攻毒时足以为动物提供有效保护的 免疫反应，或可能需要投与助增免疫原性以提供有效保护的其他药剂。

将抗原与称为佐剂的物质混合后，一起注射于动物体内可增强免疫系统对抗原的 免疫抗性，所述称为佐剂的物质系通过直接作用于免疫系统或通过修改抗原的药物动力学 特征，来增强动物体对野外病毒的抵御反应且藉此增加抗原与免疫系统的相互作用时间。

灭活抗原单独免疫动物时，不足于产生免疫原性，特别是免疫原性低、分子量小的 抗原。因此需要用不同种类的佐剂来增强抗原所诱导的免疫应答。国内外兽用疫苗生产商 推广应用的油质疫苗含有大量的矿物质油，在为养禽业保驾护航的同时也带来了不少的食 品安全问题，例如，肉鸡屠体的疫苗残留问题已经引起越来越多人的担忧。

油包水(W/0)型油质疫苗是由抗原液、界面活性剂及矿物质油混合后，在高剪切力 作用下制备而成。其免疫机理是在接种部位贮存一段时间，局部产生肉芽肿和炎症反应，吸 引巨噬细胞、淋巴细胞等聚集以识别抗原，产生抗体。同时，缓慢扩散的油质佐剂使抗原输 送到二级淋巴器官的时间延长，不断刺激机体的免疫系统，从而产生续期长、抗体水平高的 免疫效力。虽然国内外疫苗生产厂家的生产工艺不断改进，用油质量也不断提高，但由于这 种制剂的连续油相在注射部位有驻留的倾向，在不少的情形中，这种W/0型油质佐剂疫苗在 接种部位附近产生大量肉芽肿，保护性抗体产生速度慢、易对动物屠体质量造成不良影响， 并且在接种期间可能引起剧烈的疼痛。

水包油(0/W)型佐剂疫苗具有注射部位显现局部反应小且稳定性高的优势，然而 包含或者暴露在连续相中的抗原很快在注射部位分散和被体液酶分解，难以提供长期的保 护性抗体，常常需要特殊的免疫刺激剂和多次加强免疫，制备成本高，不被广泛使用。

因此，各界莫不期待开发出一种能够加强灭活抗原单独给予免疫动物时，会产生 不足免疫反应及效果；所以各界殷切期盼开发出一种能够解增加免疫反应及效果、且能具 有免疫反应持续力等的传统技术的问题点的佐剂。

发明内容

有鉴于此，本发明人等经由潜心研究用于解决传统技术问题点的各种可能方案， 进而开发出一种不但能够改善上述习用技术的问题点，而且针对现有技术的不足，提供一 种水包油包水型佐剂。本发明的佐剂可以减少现有灭活疫苗的用油量，加快被免疫动物相 应抗体的产生速度，减少疫苗制备成本，至此乃完成本发明。

《发明概要》

首先，对于本说明书中所使用的特定用语或名词进行描述性的说明；然而，下列说 明仅为例示性说明，非作为限制本发明说明书及权利要求。除非本说明书另有定义以外，在 本文中所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与 惯用的意义相同。

如本文中所使用，"疫苗组合物"为可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。 因此，在受检者已接种抗原的后，疫苗可预防、推迟或减轻曝露于相同或相关抗原的受检者 的疾病发展的严重程度(相对于未接种疫苗的受检者)。通过疫苗所提供的保护性免疫可为 体液(抗体介导)免疫或细胞免疫，或两者。例如，疫苗接种可消除或降低病原体或受感染细 胞的负荷，或产生任何其他可量测的感染减轻。疫苗接种亦可降低已免疫(已接种疫苗)的 受检者的肿瘤负荷。

如本文中所使用，术语"保护性免疫"系指当受检者已曝露于抗原，从而在受检者 中引起免疫反应(主动/后天或被动/先天，或两者)时抵御抗原所获得的免疫力，从而使抗 原失活及/或降低抗原负荷且形成免疫记忆(例如记忆T细胞或B细胞)。

通过疫苗接种所提供的保护性免疫可能为部分的或仅在一部分已接种疫苗的受 检者中提供。因此，疫苗可在一部分免疫体中诱发保护性免疫，因为有些个体可能无力建 立强免疫反应或保护性免疫反应或(在有些情况下)任何免疫反应。此能力不够可能归因于 个体的遗传背景或归因于免疫缺乏病状(后天或先天性)或免疫抑制(例如，由于经化学疗 法或使用免疫抑制药物以例如预防器官排斥反应或抑制自体免疫病状)。向一部分免 疫体提供保护的疫苗仍然适用且视为有效。

如本文中所使用，术语"佐剂"系指当连同抗原投与时，使受检者对彼抗原的免疫 反应增强的化合物。

具体而言，根据本发明的一观点可以提供一种禽类新城病疫苗用佐剂，其系由至 少包括：约35.0重量份至约95.0重量份的油剂；约1.0重量份至约5.0重量份的乳化剂；约 2.0重量份至约10.0重量份的胶质萃取物；约1.0重量份至约15.0重量份的缓冲剂；及约1.0 重量份至约5.0重量份的界面活性剂所组成；其所述佐剂可以提高禽类新城病疫苗中抗原 在生物体内，对免疫系统刺激的时间增加，进而可以增加禽类的记忆性免疫效果。

在本发明的禽类新城病疫苗用佐剂中，为了提高防止新城病的感染或增加疫苗稳 定性及效能而达到防疫的效果，可以使用佐剂做为佐剂为使产品达到良好的功效。根据本 发明的一观点，在实际施用时，所述禽类新城病疫苗用佐剂(Adj)与禽类新城病抗原液 (Vat)的掺混比(Adj：Vat)为1：5(v/v)～1：1(v/v)。例如，在本发明的所述禽类新城病疫苗 用佐剂(Adj)与禽类新城病抗原液(Vat)的掺混比的比例可以是在约1：5(v/v)～1：1(v/v)； 在某些具体实施例中，较佳为在约1：6(v/v)的范围；更佳为在约1：5(v/v)的范围；特佳为在 约1：4(v/v)的范围；最好的为约在1.02：0.98(v/v)的范围。

其上述，其所述禽类新城病抗原液(Vat)为如下三株病毒株中的至少一种所制备。 这三株病毒株于2015年12月23日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中 心，是保藏号是CCTCC NO:V201548、名称为鸡七型新城疫病毒(Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND02的病毒株，保藏号是CCTCC NO:V201555、名称为鸡七型新 城疫病毒(Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND04的病毒株，和保藏 号是CCTCC NO:V201556、名称为鸡七型新城疫病毒(Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND06的病毒株。

具体而言，根据本发明的一观点可以提供一种禽类新城病疫苗用佐剂，其系由油 剂、乳化剂、胶质萃取物、缓冲剂、及界面活性剂的比例并未特别限制，只要不造成禽类的伤 害和可达到防疫效果即可。举例来说，例如，在本发明的禽类新城病疫苗用佐剂中，油剂、乳 化剂、胶质萃取物、缓冲剂、及界面活性剂的比例可以是在约35重量份：约1重量份：约2重量 份：约1重量份：约1重量份至约95重量份：约5重量份：约10重量份：约15重量份：约5重量份； 在某些具体实施例中，较佳为在约25重量份：约0.25重量份：约1重量份：约0.25重量份：约 0.25重量份至约99重量份：约5.75重量份：约10.75重量份：约15.75重量份：约5.75重量份 的范围；更佳为在约30重量份：约0.5重量份：约1重量份：约0.5重量份：约0.5重量份至约96 重量份：约5.5重量份：约10.5重量份：约15.5重量份：约5.5重量份的范围；特佳为在约35重 量份：约1重量份：约2重量份：约1重量份：约1重量份至约95重量份：约5重量份：约10重量 份：约15重量份：约5重量份的范围。

依照本发明的一观点，可使用于本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的所述佐剂配合 使用的抗原液并未特别加以限定，举例来说，例如可以是死毒抗原、次单位抗原、核酸抗原。 根据本发明的某些具体实施例，所述抗原液来源例如可以是自死毒抗原、次单位抗原、核酸 抗原、其衍生物、及彼等的混合物构成组中所选出的至少一种；适用于本发明的抗原液较 佳使用来源为死毒抗原、次单位抗原、或核酸抗原；更佳使用来源为死毒抗原。

依照本发明的一观点，可使用于本发明的禽类新城病疫苗用佐剂中所述油剂并未 特别加以限定，举例来说，例如可以是矿物油、植物油。根据本发明的某些具体实施例，所述 油剂来源例如可以是自药用级白油、花生油、矿物油、植物油、维生素E、其衍生物、及彼等的 混合物构成组中所选出的至少一种；适用于本发明的油剂较佳使用来源为药用级白油、 花生油、矿物油、植物油、或维生素E；更佳使用来源为药用级白油、花生油、矿物油、或维生 素E；特佳使用来源为药用级白油、或矿物油。

依照本发明的一观点，可使用于本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的所述乳化剂并 未特别加以限定，举例来说，例如可以是卵磷脂、豆磷脂、司盘85、司盘83、司盘80、司盘65、 司盘60、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯等。根据本发明的某些具体实施例，所述乳化剂例 如可以是自卵磷脂、豆磷脂、司盘85、司盘83、司盘80、司盘65、司盘60、单硬脂酸甘油酯、单 油酸甘油酯中的至少一种；适用于本发明的乳化剂较佳使用为卵磷脂、豆磷脂、司盘85、司 盘83、司盘80、司盘65、司盘60、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯；更佳使用为卵磷脂、豆磷 脂、司盘85、司盘83、司盘80、司盘65、或司盘60；特佳使用来源为卵磷脂、豆磷脂、司盘85、司 盘83、司盘80、或司盘65。

依照本发明的一观点，可使用于本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的所述胶质萃取 物并未特别加以限定，举例来说，例如可以是芦荟萃取物、五加皮萃取物、马齿苋萃取物、葡 萄柚萃取物、柿子叶萃取物、β-葡聚醣、桑黄蘑萃取物、冬虫夏草萃取物。根据本发明的某些 具体实施例，所述胶质萃取物来源例如可以是自芦荟萃取物、五加皮萃取物、马齿苋萃取 物、葡萄柚萃取物、柿子叶萃取物、β-葡聚醣、桑黄蘑萃取物、冬虫夏草萃取物、其衍生物、及 彼等的混合物构成组中所选出的至少一种；适用于本发明的胶质萃取物较佳使用来源为 芦荟萃取物、五加皮萃取物、马齿苋萃取物、葡萄柚萃取物、柿子叶萃取物、β-葡聚醣、桑黄 蘑萃取物、或冬虫夏草萃取物；更佳使用来源为芦荟萃取物、五加皮萃取物、马齿苋萃取物、 葡萄柚萃取物、或β-葡聚醣；特佳使用来源为芦荟萃取物、五加皮萃取物、或β-葡聚醣。

依照本发明的一观点，可使用于本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的所述缓冲剂并 未特别加以限定，举例来说，例如可以是磷酸钠缓冲剂、磷酸钾缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂。根 据本发明的某些具体实施例，所述缓冲剂来源例如可以是自磷酸钠缓冲剂、磷酸钾缓冲剂、 Tris-HCl缓冲剂、柠檬酸钠-磷酸盐缓冲剂、两性离子缓冲剂、Hepes缓冲剂、马来酸盐缓冲 剂、其衍生物、及彼等的混合物构成组中所选出的至少一种；适用于本发明的缓冲剂较佳 使用来源为磷酸钠缓冲剂、磷酸钾缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂、柠檬酸钠-磷酸盐缓冲剂、两性 离子缓冲剂、Hepes缓冲剂、或马来酸盐缓冲剂；更佳使用来源为磷酸钠缓冲剂、磷酸钾缓冲 剂、Tris-HCl缓冲剂、柠檬酸钠-磷酸盐缓冲剂、或两性离子缓冲剂；特佳使用来源为磷酸钠 缓冲剂、磷酸钾缓冲剂、柠檬酸钠-磷酸盐缓冲剂、或两性离子缓冲剂。

依照本发明的一观点，可使用于本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的所述界面活性 剂的并未特别加以限定，举例来说，例如可以是聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯 (Labrasol)、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温81、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油、普朗 尼克F-68、聚氧乙烯月桂醇醚等。根据本发明的某些具体实施例，所述界面活性剂例如可以 是自聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐温20、吐温40、吐温60、吐温 80、吐温81、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油、普朗尼克F-68、聚氧乙烯月桂醇醇醚中的至少一 种；适用于本发明的界面活性剂较佳使用为聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯 (Labrasol)、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温81、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油、普朗 尼克F-68、或聚氧乙烯月桂醇醇醚；更佳使用为聚氧乙烯脂肪醇、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯 (Labrasol)、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温81、或吐温85；特佳使用来源为辛酸葵酸 聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温81、或吐温85。

具体而言，根据本发明的一观点可以提供一种禽类新城病疫苗用佐剂的制备方 法，其系包括以下步骤:将约35.0重量份至约95.0重量份的油剂、约1.0重量份至约5.0重量 份的乳化剂、及约1.0重量份至约10.0重量份的胶质萃取物，以第一反应条件予以充分乳化 混合而形成乳化液；由上述(a)所得的所述乳化液中加入约1.0重量份至约15.0重量份的缓 冲剂、及约1.0重量份至约2.5重量份的界面活性剂充分混合并于第二反应条件下形成禽类 新城病疫苗用佐剂。

依照本发明的一观点，可使用于本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的制备方法，其 中(a)第一反应条件包括于65℃～80℃的温度下，振幅20mm～25mm，搅拌转速1200rpm～ 2400rpm，进行反应1～3小时后，水油度(HLB)于10～16的间。

另，依照本发明的一观点，可使用于本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的制备方法， 其中(b)第二反应条件包括于55℃～65℃的温度下且调整pH值为6.8～7.4，振幅14mm～ 18mm，搅拌转速800rpm～1200rpm，进行反应2～3小时。

又，依照本发明的一观点，可使用于本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的制备方法， 其中所述油剂为矿物油；所述乳化剂为司盘80；所述胶质萃取物为芦荟萃取物；所述缓冲剂 为；所述界面活性剂为吐温20。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

具体实施方式

以下，针对本发明的实施态样列举不同的具体实施例而更加详尽地叙述与说明， 以便使本发明的精神与内容更为完备而易于了解；然而，本项技艺中具有通常知识者应当 明了本发明当然不受限于此等实例而已，亦可利用其他相同或均等的功能与步骤顺序来达 成本发明。

此外，通过下述具体实施例，可进一步证明本发明可实际应用的范围，但不意欲以 任何形式限制本发明的范围。

在以下实施例及实验中所使用的各种试剂为市售可购得的。例如，矿物油为采用 德国汉圣H&R公司制作的产品(例如，商品名：药用级白油70号)；禽类新城病抗原液为采用 台湾国年实业有限公司委托屏东科技大学制作的产品(例如，商品名：其本发明所用禽类新 城病抗原液为如下三株病毒株中的至少一种所制备；这三株病毒株于2015年12月23日保藏 于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，为保藏号是CCTCC NO:V201548、名 称为鸡七型新城疫病毒(Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND02的病 毒株，保藏号是CCTCC NO:V201555、名称为鸡七型新城疫病毒(Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND04的病毒株，以及保藏号是CCTCC NO:V201556、名称为鸡七 型新城疫病毒(Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND06的病毒株，将 上述完成生物保藏的三株鸡七型新城疫病毒接种至受精11天之鸡胚胎中，孵化96小时后采 收该病毒，然后将病毒以最终浓度为0.2％的福尔马林(formalin,Sigma,USA)去活性)；乳 化剂为采用SIGMA公司生产的司盘80(例如，商品名：S6760)；界面活性剂为采用SIGMA公司 生产的吐温20(例如，商品名：P2287)。

《制备禽类新城病疫苗用佐剂》

《制备例1》

首先，将3.5L的药用级的白油、0.5L的卵磷脂及0.5L的司盘80，一起加入调配瓶 中，再加入1.5L的磷酸钾缓冲液(磷酸二氢钾34g，1mol/L氢氧化钠溶液175ml，蒸馏水 825ml，pH值7.2)、1.5L的两性离子缓冲液(NaCl 8g，KCl 0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢 钾0.2g，CaCl₂ 0.1g，含6个结晶水的氯化镁0.1g溶于1L ddH₂O中)，利用搅拌机(型号:UHM- 10，厂牌:NIHONSEIKI日本)在无菌环境下，温度65℃下，振幅20mm，搅拌转速1200rpm，反应 进行60分钟，充分混合后得乳化液M1，水油度10。

接着，如表1所示，将1L的芦荟胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g芦荟，进一 步可以萃取出芦荟胶质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度为18.8g/ml)、1L 的五加皮胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g五加皮，进一步可以萃取出五加皮胶质萃 取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度为18.8g/ml)一起加入乳化液M1，再同时加 入0.25L的吐温20、0.25L的吐温80，在无菌环境下于室温下先行均匀搅拌2小时；继续利用 超高速均质机以800rpm，振幅14mm、55℃均质搅拌1小时，pH值调整为6.8，然后经由冷凝降 温而得到本发明的禽类新城病疫苗用佐剂(S1)。

《制备例2》

首先，将6.0L的药用级的白油、0.5L的卵磷脂及0.5L的司盘80，一起加入调配瓶 中，再加入1.5L的磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾34g，1mol/L氢氧化钠溶液175ml，蒸馏水 825ml，pH值7.2)、1.5L的两性离子缓冲液(NaCl8g，KCl 0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢 钾0.2g，CaCl₂ 0.1g，含6个结晶水的氯化镁0.1g溶于1L ddH₂O中)，利用搅拌机(型号:UHM- 10，厂牌:NIHONSEIKI日本)在无菌环境下，温度70℃下，振幅22mm，搅拌转速1600rpm，反应 进行80分钟，充分混合后得乳化液M2，水油度12。

接着，如表1所示，将0.5L的芦荟胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g芦荟，进 一步可以萃取出芦荟胶质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度20g/ml)、0.5L 的五加皮胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g五加皮，进一步可以萃取出五加皮胶质萃 取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度20g/ml)一起加入乳化液M2，再同时加入 0.5L的吐温20、0.5L的吐温80，在无菌环境下于室温下先行均匀搅拌2.2小时；继续利用超 高速均质机以900rpm，振幅16mm、60℃均质搅拌1.2小时，pH值调整为7.0，然后经由冷凝降 温而得到本发明的禽类新城病疫苗用佐剂(S2)。

《制备例3》

首先，将7L的三酸甘油脂、0.25L的卵磷脂及0.25L的司盘80，一起加入调配瓶中， 再加入0.2L的磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾34g，1mol/L氢氧化钠溶液175ml，蒸馏水825ml，pH 值7.2)、0.8L的两性离子缓冲液(NaCl8g，KCl 0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g， CaCl₂ 0.1g，含6个结晶水的氯化镁0.1g溶于1L ddH₂O中)，利用搅拌机(型号:UHM-10，厂牌: NIHONSEIKI日本)在无菌环境下，温度75℃下，振幅23mm，搅拌转速2000rpm，反应进行120分 钟，充分混合后得乳化液M3，水油度14。

接着，如表1所示，将0.5L的芦荟胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g芦荟，进 一步可以萃取出芦荟胶质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度22.1g/ml)、 0.5L的五加皮胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g五加皮，进一步可以萃取出五加皮胶 质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度22.1g/ml)一起加入乳化液M3，再同时 加入0.25L的吐温20、0.25L的吐温80，在无菌环境下于室温下先行均匀搅拌2小时；继续利 用超高速均质机以1000rpm，振幅17mm、62℃均质搅拌1小时，pH值调整为7.2，然后经由冷凝 降温而得到本发明的禽类新城病疫苗用佐剂(S3)。

《制备例4》

首先，将9.5L的矿物油、0.1L的卵磷脂，一起加入调配瓶中，再加入0.1L的磷酸盐 缓冲液(磷酸二氢钾34g，1mol/L氢氧化钠溶液175ml，蒸馏水825ml，pH值7.2)，利用搅拌机 (型号:UHM-10，厂牌:NIHONSEIKI日本)在无菌环境下，温度80℃下，振幅25mm，搅拌转速 2400rpm，反应进行180分钟，充分混合后得乳化液M4，水油度16。

接着，如表1所示，将0.1L的芦荟胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g芦荟，进 一步可以萃取出芦荟胶质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度25.8g/ml)、 0.1L的五加皮胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g五加皮，进一步可以萃取出五加皮胶 质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度25.8g/ml)一起加入乳化液M4，再同时 加入0.1L的吐温20，在无菌环境下于室温下先行均匀搅拌1小时；继续利用超高速均质机以 1200rpm，振幅18mm、65℃均质搅拌2小时，pH值调整为7.4，然后经由冷凝降温而得到本发明 的禽类新城病疫苗用佐剂(S4)。

依据上述《制备例1～4》其比例及数据记载于《表1》如下：

《表1》

再来，将450毫升～600毫升的制备例S1～制备例S4放于2000毫升烧杯中，再来将 乳化均质机放入烧杯中，让制备例S1～制备例S4的本发明禽类新城病佐剂覆盖乳化均质机 的搅拌棒达2/3(约15公分)，转动乳化均质机(型号:T.T-S.M-S，厂牌:台湾大鼎机械)的高 速剪切力至3000rpm缓缓将350毫升～600毫升的抗原加入转动中的制备例S1～制备例S4中 (抗原不足350毫升时可加缓冲液补足至350毫升)；最后，当350毫升抗原都加完时可将转速 调成5000rpm，在进行最后搅拌时间五至十分钟。其详细配比方式记录于下《表2》中。

《表2》

ND实验1为检测含本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的疫苗V1～V4应用于防疫禽类 VII型新城病的效用，用1日龄SPF鸡只30只分为5组，分别为控制例皮下注射25μL/每只鸡的 由CB-ND02所制成的抗原液，实施例1为点鼻方式10μL/每只鸡的含本发明的禽类新城病疫 苗用佐剂的疫苗V1，实施例2为皮下注射25μL/每只鸡的含本发明的禽类新城病疫苗用佐剂 的疫苗V2，实施例3为肌肉注射30μL/每只鸡的含本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的疫苗 V3，实施例4为皮下注射32μL/每只鸡的含本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的疫苗V4。

于接种后三周再补强免疫一次，其注射的疫苗与第一次相同，补强免疫两周后牺 牲鸡只，所有试验鸡只分别于接种前(PI-0wk)、接种后1周(PI-1wk)、接种后2周(PI-2wk)及 接种后3周(PI-3wk)采血，并检测血液中细胞增殖试验。鸡只牺牲后取其脾脏细胞，进行检 测脾脏细胞中CD4⁺及CD8⁺细胞的百分比。

检测血液中细胞增殖试验、及脾脏细胞中CD4⁺/CD8⁺细胞百分比的检测方法分别叙 述于后段。

于接种后三周再补强免疫一次，其注射的疫苗与第一次相同，补强免疫两周后牺 牲鸡只，所有试验鸡只分别于接种前(PI-0wk)、接种后1周(PI-1wk)、接种后2周(PI-2wk)及 接种后3周(PI-3wk)采血，并检测血液中细胞增殖试验。鸡只牺牲后取其脾脏细胞，进行检 测脾脏细胞中CD4⁺及CD8⁺细胞的百分比。

《细胞增殖试验的检测方法》

细胞增殖试验采取鸡只血液，以1077密度梯度培养液(density gradient medium)分离其PBMC细胞，计数细胞，调整细胞数为2x10⁵个细胞/100μL/孔分注于96孔盘中，分别加入1g/50μL/孔的Con A(Sigma，USA)与同等体积的培养液，各三重复，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养48小时，加入10μL/孔BrdU试剂标示细胞，再培养24小时，1000rpm、10分钟离心，除去上清液，加入200μL/孔FixDenat溶液，置于室温30分钟，除去FixDenat溶液并加入100μL/孔抗-Brd U-pod工作液，置于室温90分钟，除去抗-Brd U-pod工作液，加入300μL/孔洗涤液，重复三次清洗，去除洗涤液，加入100μL/孔底物溶液，置于室温5分钟呈，以ELISA reader 370nm波长读取数值。将各实施例每组6只鸡只试验结果的细胞增殖的百分比平均值分别记录于《表3》。

《表3》

《CD4+/CD8+细胞百分比的检测方法》

CD4+/CD8+细胞表面抗原检测将细胞液浓度调整为2×10⁵细胞，分别以禽类单株 抗体IgG1-FITC及IgG1-PE染的细胞液，作为阴性对照组(isotype control)。检测鸡细胞 表面抗原CD4+及CD8+，将anti-CD4单株抗体及anti-CD8单株抗体(Beckman Coulter, Inc.USA)分别加入待测细胞液中，混合均匀后，置于冰上避光作用30分钟后，于4℃下以300 ×g离心5分钟。去除上清液后加入PBS悬浮细胞，于4℃下以300×g离心5分钟清洗细胞，重 复清洗2次。最后加入100μL含有1％多聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS悬浮细胞，以流式 细胞仪(Coulter Epics Altra Flow Cytometry，Beckman Coulter，CA)分析其细胞表面抗 原，再以软件(Expo 32v1.0MultiCOMP Software，Applied Cytometry Systems， Sheffield，UK)分析其CD4+及CD8+细胞百分比。将各实施例每组6只鸡只试验结果的病毒力 价的平均值分别记录于《表4》。

《表4》

根据如上述表4所示，在对照组中，所述未施打本发明的禽类新城病疫苗用佐剂的 鸡只血液中的免疫细胞仅增加15-18％；相对地，在实施例1～4中，经施打本发明的禽类新 城病疫苗用佐剂的鸡只则显示血液中免疫细胞的增加幅度至少超过30％，且经过时间拉长 的观察，本发明之禽类新城病疫苗用佐剂可以增加免疫保护力，因为鸡只血液中的免疫细 胞三周后测试，都本原本接种对照组前高出50％。

另外，CD4⁺/CD8⁺细胞百分比的结果亦显示：在对照组没有使用本发明的所述禽类 新城病疫苗用佐剂，而CD4⁺/CD8⁺细胞百分比约为10％/18％；另一方面，在实施例1～4中，经 施打本发明的禽类新城病疫苗用佐剂之疫苗的鸡只，CD4⁺/CD8⁺细胞百分比约为25％/35％ 以上，显示出接种使用本发的所述禽类新城病疫苗用佐剂可以提高鸡只体内CD4⁺/CD8⁺细胞 的比例，进一步证明提高免疫力及对抗新城病的效果。

从而，可以确认经施打所述禽类新城病疫苗用佐剂之疫苗的鸡只能够增加免疫保 护能力，进而具有对抗新城病感染的优异的效果。所以，本发明的禽类新城病疫苗用佐剂能 够明显地提高鸡只的免疫力及免疫细胞增殖，增强疫苗对鸡只在新城病上诱发保护性免疫 反应。

综上所述，本发明的内容已经以如上的实施例举例说明了，然而本发明并非仅限 定于此等实施方式而已。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神 和范围内，当可再进行各种的更动与修饰；例如，将前述实施例中所例示的各技术内容加以 组合或变更而成为新的实施方式，此等实施方式也当然视为本发明所属内容。因此，本案所 欲保护的范围也包括后述的权利要求及其所界定的范围。

【生物材料保藏】

将本发明该病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center For Type Culture Collection，CCTCC)，保藏日为2015年12月23日；CB-ND02病毒株的保藏号为CCTCC NO:V201548，CB-ND04病毒株的保藏号为V201555、CB-ND06病毒株的保藏号为CCTCCNo: V201556。