一株海洋枯草芽孢杆菌及其分离和防治黄瓜枯萎病制剂

技术领域

本发明涉及黄瓜枯萎病的防治，具体地说是一株海洋枯草芽孢杆菌及其 对黄瓜枯萎病菌的防治。

背景技术

黄瓜枯萎病(Cucumber fusarium Wilt)又称萎蔫病、蔓割病，是一种世界 性的植物维管束病害。该病由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起，是一 类主要经土壤传播的维管束病害，在我国瓜类种植区普遍发生。据统计， 每年黄瓜枯萎病的发病率可达20％，甚至高达80-90％，导致了黄瓜的严重 减产。目前防治此类病害主要是化学农药，但长期大量使用化学农药，不 但严重污染环境、破坏生态平衡、威胁人类健康，而且导致病原菌的抗药 性越来越强，使病害越来越难以防治。生物防治能克服化学农药带来的弊 端，目前对于黄瓜枯萎病的生物防治方法主要有采用抗病品种、轮作和嫁 接。现有的黄瓜品种，仅少数品种具有一定的抗、耐病能力(如中农5号、 津春5号等)，即使栽培这些品种，病害还是年年发生；轮作的栽培方式可 以降低枯萎病的发病程度，但不能从根本上解决病害的发生；嫁接技术虽 能有效地防除枯萎病，但是，在生产上难以大面积推广。因此，通过寻求 新型的防病、治病手段，达到有效地控制黄瓜枯萎病的危害，已成为生产 实践中迫切需要解决的课题。基于生物农药的高效、安全、环保等优点以 及人们对黄瓜这种可以生食蔬菜的绿要求，对黄瓜枯萎病的生物防治已 经成为人们关注的焦点。在用于植物病害防治的菌中，枯草芽抱杆菌 (Bacilluss ubtilis)的研究很多，不仅有防病作用，而且有明显的促生增产效 果。已成为人们认同的具有抑制病菌防治病害的一类生防细菌。但该类细 菌用于黄瓜枯萎病的生物防治研究报道的较少。

发明内容

本发明涉及黄瓜枯萎病防治及海洋微生物应用技术，具体的说是一种黄 瓜枯萎病生物防治用海洋枯草芽孢杆菌制剂制造方法。

本发明所提供的海洋枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3512A，已经于2007年4月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址： 中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No.M 207051。

所述黄瓜枯萎病生物防治用海洋枯草芽孢杆菌制剂的制造方法为：

1)菌株初筛：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3512A，是从南海柳珊瑚中 分离得到。具体方法如下：在南海柳珊瑚生长区域，直接选取健康的、活 的柳珊瑚有机体，在无菌条件下清洗，取其生长点部位，切成0.5～1.0cm长 小块，装入无菌采样小瓶内，放置在水瓶(或液氮罐)中，带回实验室， 以样品∶无菌水＝1∶1研磨，获得新鲜柳珊瑚细胞提取液；对新鲜柳珊瑚 细胞提取液，采用平板稀释法(培养基中涂有0.001～0.01％柳珊瑚)，分离 海洋芽孢细菌，在盛有上述专用培养基的平皿上，涂刮平板，然后放入到 保温箱中培养；培养3～5天后，对平皿上长出的单菌落纯的微生物经再划 线纯化后，挑典型单菌落移至斜面保藏。本发明操作简单，结果理想，能 得到所需要的菌株。

2)菌株复筛：将上述初筛得到的单菌落斜面试管菌株进行平皿活化， 28℃48小时，采用平皿拮抗试验方法，以黄瓜枯萎病菌为靶子菌，按常规 方法在平皿上进行对峙的拮抗试验，在25～28℃保温箱中保温培养48～84 小时，取出对峙拮抗试验平皿，检测各个柳珊瑚海洋枯草芽孢杆菌菌株对 黄瓜枯萎病靶子菌的抑菌圈大小，抑菌直径达到18mm或18mm以上为合格， 选择编号保存。

3)海洋枯草芽孢杆菌在黄瓜根际的定殖试验：将海洋枯草芽孢杆菌试 管斜面菌种，移接扩繁，然后在25-30℃保温培养36-60小时，此时海洋枯 草芽孢杆菌菌苔已长得十分丰满，可以用无菌水刮洗下来，制成菌悬液， 使每毫升菌悬液中的菌体细胞数达到10亿个CFU以上，即达到109浓度， 可以与黄瓜盆栽土壤均匀混合，使每克土壤中的试验测定的枯草芽孢杆菌 的细胞数达105CFU以上，即每克土壤中达到10万个CFU细胞以上；土壤 装入盆内，每盆播种20粒黄瓜种子，按盆栽试验常规方法管理，每隔2周 测定一次，接入土中6周后，海洋枯草芽孢杆菌细胞数稳定在106CFU/克·土 水平的，说明得到的海洋枯草芽孢杆菌能在杉木根际土壤中定殖，此菌株 为有效菌株，可供应用试验或推广应用。从土壤中分离出来的定殖的枯草 芽孢杆菌对靶标菌的抑菌圈直径不低于接种前实验室测定的结果，即抑菌 圈直径≥18mm。

所述得到的对病原菌的抑制作用的海洋孢杆菌为枯草芽孢杆菌，用传 统的细菌学鉴定或16SrDNA序列检测证明其为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)。

4)海洋枯草芽孢杆菌发酵生产方法：

(1)、克氏瓶种子培养，采用500ml容积克氏瓶，装60ml培养基，121 ℃灭菌30分钟，冷却后放斜面，接种海洋枯草芽孢杆菌，而后将此克氏瓶 放在25～28℃保温箱中保温培养48～72小时，取出即可作为种子用。克氏 瓶种子培养用的培养基为改良淀粉培养基；

(2)、10L发酵生物应器发酵，罐装培养基为6L，培养基组成为改良 淀粉培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后，接种上述克氏瓶种子二瓶，下 培养36～48小时，即可放罐，此发酵液可用于制造微生物菌剂。

(3)、抗黄瓜枯萎病海洋枯草芽孢杆菌微生物制剂的制造，按照权力 要求3及4所述得到的柳珊瑚海洋枯草芽孢杆菌的发酵液，在实验室镜检 菌体生长良好，每毫升发酵液菌体细胞达到2亿个CFU以上，对黄瓜枯萎 病的拮抗抑菌圈直径在18mm以上，无杂菌，即为合格，可以制造微生物制 剂：

①液体制剂：将10L罐发酵生产的发酵液直接罐装在清洁的塑料筒中 保存，含菌细胞数达2亿个CFU/ml；

②固体制剂：将发酵液用无菌草炭粉混合拌匀，使含水量在15～20％ 左右，含菌细胞数在0.5亿个CFU/ml～1亿个CFU/ml；

本发明具有如下的优点：

1、所得到的海洋枯草芽孢杆菌3512A能够对黄瓜枯萎病进行有效的防 治，防病效率达70％以上，并且对人畜无害，不污染环境，避免大量应用 化学农药带来的弊端，满足人们对黄瓜这种可生食蔬菜的绿要求。别且 能够促进黄瓜的生长，增加黄瓜产量，可以认为是一优良的生防菌株或 PGPR菌株，具有开发为高质量的微生物生防制剂产品或PGPR产品的潜力。

2、所得到的海洋枯草芽孢杆菌3512A，在黄瓜根际土壤中定殖能力强 (进行黄瓜盆栽试验，接种3512A菌后6周，测定其在黄瓜根际土壤中的定 殖密度106CFU/克·土，从土壤中分离出来的定殖的3512A菌对靶标菌的抑 菌圈直径不低于实验室测定的结果，抑菌圈直径达18.00mm)，对黄瓜生长 无抑制，并有促进生长的作用，有利于应用推广。

附图说明

本发明中所涉及的Bacillus subtilis 3512A，已经于2007年4月23日保 藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC No.M 207051。

图1为海洋细菌3512A(即为本发明中涉及的Bacillus subtilis 3512A) 和相关菌株的系统发育树。

具体实施方式

本发明采用常规的平皿相互拮抗筛选模型和定向筛选相结合的方法， 其具体步骤：(1)在海洋珊瑚生长区域，直接选取健康的、活的柳珊瑚有 机体，在无菌条件下清洗，取其生长点部位，切成0.5～1.0cm长小块，装入 无菌采样小瓶内，放置在水瓶(或液氮罐)中，带回实验室，以样品∶无 菌水＝1∶1研磨，获得新鲜柳珊瑚细胞提取液；(2)对新鲜柳珊瑚细胞提 取液，采用专用培养基平板稀释法(培养基为加麦芽汁牛肉膏蛋白胨：牛 肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，麦芽汁1％，琼脂2％，pH7.0-7.2。121℃，灭菌 20分钟)中涂有0.001～0.01％柳珊瑚)，分离海洋芽孢细菌，在盛有上述培 养基的平皿上，涂刮平板，然后放入到保温箱中培养；(3)培养3～5天后， 对平皿上长出的单菌落纯的微生物经再划线纯化后，挑典型单菌落移至斜 面保藏；(4)以已经分离得到黄瓜根际土壤中主要致害真菌为靶标菌株， 与已经分离纯化得到海洋芽孢杆菌3512A菌株之间进行拮抗试验，检测其 对黄瓜枯萎病菌的抑制作用。具体为：以黄瓜枯萎病菌为靶子菌，按常规 方法在平皿上进行对峙的拮抗试验，在25-30℃保温36-60小时，取出平皿， 检测3512A菌株对靶子菌的抑菌圈大小。(5)通过盆栽试验筛选出具有高 效拮抗活性且能在黄瓜根际土壤中定殖的，在原位土壤中测定有明显抑制 黄瓜根际土壤中致害真菌(尖孢镰刀菌萎蔫专化型)作用的拮抗菌株，此 菌株同时要对黄瓜生长无抑制作用，或略有促进生长作用，进行挑选，经 16SrDNA分析确定其为枯草芽孢杆菌，所得到的菌株，即为高效菌株 3512A。

用于防治黄瓜枯萎病的海洋枯草芽孢杆菌3512A已在中国典型培养物 保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC No.M207051。海洋枯草芽孢杆菌3512A 具有典型枯草芽孢杆菌特征，芽孢柱状、中生、不膨大。菌体为杆状或短 杆状，革兰氏染阳性，菌落呈淡黄、不透明、干燥、表面粗糙，边缘 不规则。水解淀粉，接触酶阳性，利用柠檬酸盐，能在7％NaCl和45℃生 长，分子生物学鉴定3512A菌株的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌的序列 相似性最高为99.4％。3512A菌株能在黄瓜根际土壤中高密度定殖(＞ 106CFU/g·土)，对黄瓜枯萎病有很好的防治效果(抑菌率＞60％，防效达 70％以上)；

通过本发明制造出来的防治黄瓜枯萎病的海洋枯草芽孢杆菌制剂，是 一种高效、无毒、安全、无残留、能促进黄瓜绿生态体系发展的微生物 制剂，有发展前途。

用本发明筛选方法得到的海洋枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)3512A， 具有高效防治黄瓜枯萎病的作用，并对黄瓜生长无抑制作用且具有很好的 促生长效果，对环境友好。

防治黄瓜枯萎病的海洋枯草芽孢杆菌制剂的制造方法步骤如下：

1、样品采集：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3512A，是从南海柳珊瑚 中分离得到。具体方法如下：在南海柳珊瑚生长区域，直接选取健康的、 活的柳珊瑚有机体，在无菌条件下清洗，取其生长点部位，切成0.5～1.0cm 长小块，装入无菌采样小瓶内，放置在水瓶(或液氮罐)中，带回实验室， 待分离筛选目的菌所用。

2、菌株初筛：样品∶无菌水＝1∶1研磨，获得新鲜柳珊瑚细胞提取液； 对新鲜柳珊瑚细胞提取液，采用平板稀释法(培养基中涂有0.001～0.01％柳 珊瑚)，分离海洋芽孢细菌，在盛有上述专用培养基的平皿上，涂刮平板， 然后放入到保温箱中培养；培养3～5天后，对平皿上长出的单菌落纯的微 生物经再划线纯化后，挑典型单菌落移至斜面保藏

3、菌株复筛：将上述初筛得到的单菌落斜面试管菌株进行平皿活化， 28℃培养48小时，采用平皿拮抗试验方法，以黄瓜枯萎病菌为靶子菌，按 常规方法在平皿上进行对峙的拮抗试验，在25～28℃保温箱中保温培养 48～84小时，取出对峙拮抗试验平皿，检测各个柳珊瑚海洋枯草芽孢杆菌 菌株对黄瓜枯萎病靶子菌的抑菌圈大小，抑菌直径达到18mm或18mm以上 为合格，选择编号保存。

4、定殖试验：将海洋枯草芽孢杆菌试管斜面菌种，移接扩繁，然后在 25-30℃保温培养36-60小时，此时海洋枯草芽孢杆菌菌苔已长得十分丰满， 可以用无菌水刮洗下来，制成菌悬液，使每毫升菌悬液中的菌体细胞数达 到10亿个CFU以上，即达到109浓度，可以与黄瓜盆栽土壤均匀混合，使 每克土壤中的试验测定的枯草芽孢杆菌的细胞数达105CFU以上，即每克 土壤中达到10万个CFU细胞以上；土壤装入盆内，每盆播种20粒黄瓜种 子，按盆栽试验常规方法管理，接入土中6周后，海洋枯草芽孢杆菌细胞 数稳定在106CFU/克·土水平的，说明得到的海洋枯草芽孢杆菌能在黄瓜根 际土壤中定殖，此菌株为有效菌株，经测量对黄瓜的生长无抑制作用，而 却有一定促进生长的效果(株高、叶绿素含量、结果重量都较不接菌的对 照有所增加，试验与对照盆栽各4盆，盆栽试验时间不短于三个月)。叶绿 素含量测定采用丙酮提取法，分别在幼苗期和开花结果期各测一次，取黄 瓜植株已全部展开的第2片叶(功能叶)测定叶绿素含量。经测定，接种 海洋枯草芽孢杆菌后黄瓜叶片的叶绿素含量较对照高5％，差异达到显著水 平。从土壤中分离出来的已定殖的枯草芽孢杆菌对靶标菌的抑菌圈直径不 低于接种前实验室测定的结果，抑菌圈直径≥18mm。经检测，此海洋枯草 芽孢杆菌能够在无机磷培养基上生长且产生明显的透明圈，说明其有解磷 的作用，即能够促使土壤中难溶性的磷变成可溶性的磷，进而促进黄瓜对 磷元素的吸收。另外其无菌发酵滤液稀释1000倍后能够显著促进水培黄瓜 幼苗根系的生长，说明有一定的生长刺激作用。海洋枯草芽孢杆菌3512A 在黄瓜根际定殖试验和它对黄瓜生长的促进及增产的结果表明，此菌株可 供为进一步的推广应用进行扩大试验。

5、海洋枯草芽孢杆菌发酵：(1)、克氏瓶种子培养，采用500ml容积 克氏瓶，装60ml培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后放斜面，接种海洋枯 草芽孢杆菌，而后将此克氏瓶放在25～28℃保温箱中保温培养48～72小时， 取出即可作为种子用。克氏瓶种子培养用的培养基为改良淀粉培养基，其 组成为：可溶性淀粉2％，牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，pH自 然。

(2)、10L发酵生物反应器发酵，罐装培养基为6L，培养基组成为改 良淀粉培养基，即可溶性淀粉2％，牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％， 其余为水，pH自然。121℃灭菌30分钟，冷却后，接种上述克氏瓶种子二 瓶，种子用200ml无菌水洗下后，应用无菌技术接种至10L容积生物反应 器中，发酵生产的培养条件为：罐压0.05Mpa，罐温28℃±1℃，通风量为 6L/min，搅拌速度为200rpm。在此条件下培养36～48小时，即可放罐，此 发酵液可用于制造微生物菌剂。

(3)、抗黄瓜枯萎病海洋枯草芽孢杆菌微生物制剂的制造，上述得到 的柳珊瑚海洋枯草芽孢杆菌的发酵液，在实验室镜检菌体生长良好，每ml 发酵液菌体细胞达到2亿个CFU以上，对黄瓜枯萎病的拮抗抑菌圈直径在 18mm以上，无杂菌，即为合格，可以制造微生物制剂：

①液体制剂：将10L罐发酵生产的发酵液直接罐装在清洁的塑料筒中 保存，含菌细胞数达2亿个CFU/ml；

②固体制剂：将草炭粉121℃灭菌30min，凉干后与发酵液混合拌匀， 15～20％左右，含菌细胞数在0.5亿个CFU/ml～1亿个CFU/ml；

用本发明获得用于防治黄瓜枯萎病的海洋枯草芽孢杆菌3512A有效菌 株，经测定具有如下特征：

(1)菌体的形态特征

海洋细菌3512A具有典型的芽孢菌特征，菌体短杆状，革兰氏染阳 性，周生鞭毛，有芽孢，芽孢椭圆、中生、不膨大。菌落淡土黄、不透 明、表面粗糙、边缘不规则。

(2)生理生化特征

淀粉水解、盐耐受以及碳源利用，测定结果见表2。海洋细菌3512A接 触酶阳性，45℃可以生长，7％NaCl生长，能够水解淀粉；利用葡萄糖、 棉子糖、木糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖、果糖、木聚糖、糊精、淀粉、 丙二酸盐、纤维二糖、明胶；能够利用柠檬酸盐，不能利用半乳糖、肌醇、 山梨糖、鼠李糖、菊糖、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐。

(3)分子生物学鉴定

海洋细菌3728的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)的 序列相似性最高为99.5％，在系统发育树(进化树)中也与枯草芽孢杆菌 (Bacillus Subtilis)处于同一分枝上，见附图。

(4)海洋细菌3512A对黄瓜枯萎病菌的抑制作用

海洋细菌3512A对Fusarium oxysporum具有很强的抑菌活性，抑菌圈直 径达到18.3mm，无菌发酵液稀释10倍，其抑菌率达到70.83％。

应用例

将上述筛选得到的海洋枯草芽孢杆菌3512A试管斜面菌种，移接扩繁， 然后在28℃保温培养48h，此时菌苔已长得十分丰满，可以用无菌水刮洗 下来，制成菌悬液，使每毫升菌悬液中的菌体细胞数达到10亿个CFU以 上，即达到109浓度，可以与黄瓜盆栽土壤(潮棕壤)均匀混合，使每克土 壤中的试验测定的枯草芽孢杆菌的细胞数达105CFU以上，即每克土壤中达 到10万个CFU细胞以上；土壤装入盆内，每盆播种20粒黄瓜种子，按盆 栽试验常规方法管理，每周定期测定在土壤中定殖的海洋细菌数目。定殖 测定采用稀释平板法，取黄瓜根际土壤少许，用无菌水进行稀释，在牛肉 膏蛋白胨加麦芽汁琼脂平板上涂布，28℃保温培养48h。挑选与所接3512A 形态一致的典型菌落进行计数，同时抽查对黄瓜枯萎病菌的抗菌活性，应 达到90％以上的菌落具有抗菌活性。结果证明此分离自柳珊瑚海洋枯草芽 孢杆菌菌株3512A，可在黄瓜根际土壤中定殖，接种6周后，测定细胞数 能稳定在106CFU/克土的水平，10周后细胞数稳定在105～106CFU/克土的 水平，说明为有效菌株。

海洋枯草芽孢杆菌3512A发酵：(1)、克氏瓶种子培养，采用500ml容 积克氏瓶，装60ml培养基，121℃灭菌30分钟，冷却后放斜面，接种海洋 枯草芽孢杆菌，而后将此克氏瓶放在25～28℃保温箱中保温培养48～72小 时，取出即可作为种子用。克氏瓶种子培养用的培养基为改良淀粉培养基， 其组成为：可溶性淀粉2％，牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，pH 自然。

(2)、10L发酵生物反应器发酵，罐装培养基为6L，培养基组成为改 良淀粉培养基，即可溶性淀粉2％，牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％， 其余为水，pH自然。121℃灭菌30分钟，冷却后，接种上述克氏瓶种子二 瓶，种子用200ml无菌水洗下后，应用无菌技术接种至10L容积生物反应 器中，发酵生产的培养条件为：罐压0.05Mpa，罐温28℃±1℃，通风量为 6L/min，搅拌速度为200rpm。在此条件下培养36～48小时，即可放罐，此 发酵液可用于制造微生物菌剂。

(3)、抗黄瓜枯萎病海洋枯草芽孢杆菌微生物制剂的制造，上述得到 的柳珊瑚海洋枯草芽孢杆菌的发酵液，在实验室镜检菌体生长良好，每ml 发酵液菌体细胞达到2亿个CFU以上，对黄瓜枯萎病的拮抗抑菌圈直径在 18mm以上，无杂菌，即为合格，可以制造微生物制剂：

①液体制剂：将10L罐发酵生产的发酵液直接罐装在清洁的塑料筒中 保存，含菌细胞数达2亿个CFU/ml；

②固体制剂：将草炭粉121℃灭菌30min，凉干后与发酵液混合拌匀， 15～20％左右，含菌细胞数在0.5亿个CFU/ml～1亿个CFU/ml。

经测定对黄瓜有一定促进生长的效果(株高、叶绿素含量、结果重量 都较不接菌的对照有所增加，试验与对照盆栽各4盆，盆栽试验时间不短 于三个月)。叶绿素含量测定采用丙酮提取法，分别在幼苗期和开花结果期 各测一次，取黄瓜植株已全部展开的第2片叶(功能叶)测定叶绿素含量。 接种海洋枯草芽孢杆菌3512A后黄瓜叶片的叶绿素含量较对照高5％，差 异达到显著水平。

经检测，此海洋枯草芽孢杆菌能够在无机磷培养基上生长且产生明显 的透明圈，说明其有解磷的作用，即能够促使土壤中难溶性的磷变成可溶 性的磷，进而促进黄瓜对磷元素的吸收。另外其无菌发酵滤液稀释1000倍 后能够显著促进水培黄瓜幼苗根系的生长，说明有一定的生长刺激作用。

表13512A对开花结果期黄瓜枯萎病的防治效果

表23512A对黄瓜产量的影响(g)

表中数据为4×4拉丁方处理的8次重复的平均值±标准差。*表示差 异显著，**表示差异极显著。