一种关节疼痛的药物制剂的检测方法

一种关节疼痛的药物制剂的检测方法

技术领域：

本发明涉及药品的检测方法，特别是关节肿痛的金骨莲胶囊制剂的检测方法，属 于药品的技术领域。

背景技术：

痹证是指肢体肌肉、筋骨、关节发生酸痛、麻木、重着、屈伸不利，甚或关节红肿灼 热疼痛等为主要临床表现的病证。临床上具有渐进性或反复发作的特点。痹证的发生，与 体质的盛衰以及气候条件、生活环境有关。痹证初起，不难获愈，晚期病程缠绵，预后多 不良。痹证的诊断要点临床以肢体、关节疼痛、酸楚、麻木、重着、活动障碍为主要症状 表现。一般发病比较缓慢，部分开始可有发热、汗出、口渴、咽痛、全身不适等症状，继 之而出现关节症状。往往呈渐进性或不规则的发作性。实验室检查，可见血沉、抗“O” 增高，类风湿因子试验阳性等。本申请人发明的金骨莲胶囊具有祛风除湿、消肿止痛之功 效，用于风湿痹阻所致的关节肿痛、屈伸不利等症的。由于该药物是一种新药，目前 还没有有效的质量控制方法。

本申请人申请的专利CN200910312147.3公开了“关节肿痛的胶囊制剂的质量控 制方法”，该专利提供了一种金骨莲胶囊的检测方法，该方法仅对方中透骨香、大血藤和 金铁锁进行了TLC鉴别，对富马酸的进行了含量测定。由于金骨莲胶囊中含有透骨香、金 铁锁、大血藤、汉桃叶和八角枫五味药材，仅对透骨香、大血藤和金铁锁三味药进行TLC 鉴别是不能保证质量标准的完善和鉴别的精确性的，同时，金骨莲胶囊的物质基础研究还 不够完善，其有效成分尚未搞清楚。研究发现金骨莲胶囊每粒含汉桃叶以富马酸计不得少 于25.0μg，其中的富马酸含量较低，而且方中汉桃叶药材所含成分为富马酸黄酮类；另 外八角枫为有毒药材，如何限量有毒药材中的有毒成分是确保产品安全性的保障。因此， 进一步研究制定出金骨莲胶囊更为完善更为精确的检测方法，提高产品的质量来确保产品 的安全性，实现产品产业化生产是非常具有重大意义的。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种关节肿痛的药物制剂的检测方法，包括 性状、鉴别、检查和含量测定；该检测方法能全面有效地控制关节肿痛的金骨莲胶囊 质量，从而确保该药物的临床疗效和用药安全性。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：关节肿痛的胶囊制剂的检 测方法，这种胶囊这样制备：透骨香343g、汉桃叶400g、大血藤370g、八角枫50g、金 铁锁50g、淀粉125g，以上五味药材，金铁锁加水煎煮3小时，滤过，滤液备用，药渣 干燥后粉碎成细粉，备用；其余透骨香等四味，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液， 滤过，合并上述滤液，浓缩至60℃测相对密度为1.25～1.28的清膏，加入上述细粉及淀 粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，装入胶囊，制成1000粒；该检测方法由性状、鉴别、检 查和含量测定组成，其中鉴别是对透骨香、大血藤、金铁锁、八角枫的TLC鉴别，含量测 定是照中国药典2010年版一部附录VID高效液相谱法对胶囊中八角枫碱的含量测定， 照中国药典2010年版一部附录VA紫外-可见分光光度法对胶囊中总黄酮类的含量测定。

上述的关节肿痛的胶囊制剂的检测方法，具体是这样的：

性状：本品为胶囊剂，内容物为黄棕至红棕的粉末；气微，味微苦涩；

鉴别：以透骨香对照药材为对照、以：丙酮=9：1为展开剂,照薄层谱法 鉴别透骨香；以大血藤对照药材为对照、以甲苯：乙酸乙酯：甲酸=20:8:1为展开剂,照 薄层谱法鉴别大血藤；以金铁锁对照药材为对照、以：乙酸乙酯：甲醇：水 =15:40:22:10的下层溶液为展开剂，照薄层谱法鉴别金铁锁；以八角枫对照药材为对 照、以二甲苯：乙酸乙酯：甲醇：异丙醇；氨水=10:5:1:0.30:0.15为展开剂，照薄层 谱法鉴定八角枫；

检查：符合中国药典2010年版一部附录IL胶囊剂项下有关的各项规定；

内容物：照中国药典2010年版一部附录XA醇溶性浸出物测定项下的热浸法测定，用 60%乙醇作溶剂，不得少于16.0%；

含量测定：以芦丁对照品为对照，照中国药典2010年版一部附录V A紫外-可见分光 光度法测定胶囊中的总黄酮含量；以八角枫碱为对照，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 照中国药典照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相谱法测定八角枫碱的含量。

前述的关节肿痛的胶囊制剂的检测方法，其中鉴别由以下组成：

（1）透骨香鉴别：取本品内容物3g，加甲醇30ml，加热回流30分钟，滤过，滤液 浓缩至0.5ml，作为供试品溶液；另取透骨香对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照薄 层谱法一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素 钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以：丙酮=9：1为展开剂，展开，取出，晾干， 用浓氨试液熏约5分钟，置于365nm紫外光灯下观察，供试品谱中，在与对照药材谱 相应的位置上，显相同颜的荧光斑点；

（2）大血藤鉴别：取本品内容物2g，加乙醚20ml，加热回流30分钟，放冷，滤过， 滤液挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取大血藤对照药材2g，同法制 成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录VIB薄层谱法试验，吸取对照药材溶 液5μl、供试品溶液10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上， 以甲苯：乙酸乙酯：甲酸=20:8:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液， 在105℃加热至斑点显清晰，供试品谱中，在与对照药材谱相应的位置上，显相同 颜的斑点；

（3）金铁锁鉴别：取本品内容物2g，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸 干，残渣加水30ml使溶解，加以水饱和的正丁醇提取两次，每次20ml，合并正丁醇液， 加氨试液30ml洗涤，弃去氨试液，再加以正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水洗液，正丁 醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取金铁锁对照药材1g，同法制 成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录VIB薄层谱法试验，吸取供试品溶液、 对照药材溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上， 以：乙酸乙酯：甲醇：水=15:40:22:10的下层溶液为展开剂，下层溶液为10℃ 以下展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显清晰，分别置 日光下及365nm紫外光灯下检视，供试品谱中，在与对照药材谱相应的位置上，显相 同颜的斑点；

（4）八角枫鉴别：取本品内容物1.5g，加氨饱和的50ml，加热回流30分 钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取八角枫对照 药材0.5g，同法制成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录VIB薄层谱法试验， 吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上， 以二甲苯：乙酸乙酯：甲醇：异丙醇；氨水=10:5:1:0.30:0.15为展开剂，展开，取出， 晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显清晰，供试品谱中，在与对照 药材谱相应的位置上，显相同颜的斑点。

前述的关节肿痛的胶囊制剂的检测方法，其中含量测定由以下组成：

（1）总黄酮含量测定：

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加60%乙醇制成0.35mg/ml的溶 液；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别 置25ml的容量瓶中，加水至5ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10% 硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，放置15分 钟；同法制备空白溶液，照中国药典2010年版一部附录VA紫外-可见分光光度法，在500nm 波长处，测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法：取本品内容物，混匀，取0.2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入60%乙醇 25ml，密塞，称定重量，超声处理1小时，放冷，称定重量，用60%乙醇补足减失的重量， 滤过，精密量取续滤液1ml，置25ml的容量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，至“加 水至5ml”起，依法测定吸光度，标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，计算，即得；

本品每粒含总黄酮以芦丁计，不得少于17.5mg；

（2）八角枫碱含量测定：

谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：缓冲液=22： 78为流动相，所述的缓冲液由0.2g庚烷黄酸钠、2.0g磷酸二氢钾、0.3ml磷酸加水到 1000ml而得；柱温30℃，流速为1.000ml/min，检测波长为259nm；理论板数按L（－） －八角枫碱峰计算应不低于6000；

对照品溶液的制备：精密称取L（－）－八角枫碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含 10μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本品内容物，混匀，取1.5g，精密称定，置150ml的锥形瓶 中，加氨水3ml润湿，密闭5分钟后，再加入80ml，70℃水浴回流50分钟，放 冷，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇适量溶解，并转移至10ml的容量瓶中，加甲醇稀释至 刻度，摇匀，用0.45um的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱仪，测定， 即得；

本品每粒含八角枫以L（－）－八角枫碱（C₁₀H₁₄N₂）计，应为0.007～0.30mg。

为了研究关节肿痛的金骨莲胶囊的检测方法，申请人进行了大量的实验以筛选最 佳方案，具体如下：

1、八角枫鉴别：

八角枫是金骨莲胶囊处方中的药材之一，通过查阅相关文献资料，确认八角枫药材中 所含成份八角枫碱，既是活性成份，又是有毒成分。以八角枫对照药材与八角枫碱同时为 对照进行鉴别，在不同的提取条件与展开下，分别通过在365nm紫外光灯下检视，5%香草 醛硫酸溶液加热显，稀碘化铋钾试液，改良碘化铋钾试液显，结果，八角枫碱对照品 均无斑点显现，为此采用八角枫对照药材进行了以下实验：

1.1、供试品制备方法的选择：以下方法内容物取样量为1.5g。

表1提取方法选择

以上方法展出的每一张板喷显剂前，都在紫外光灯365nm下进行检视，阴性均有干 扰，用改良碘化铋钾或者稀碘化铋钾显，都未展出八角枫碱对照品斑点；其余斑点成像 不清晰；改用方法5，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显清晰，主斑点圆整 清晰，阴性无干扰，故选用。

1.2、展开系统的选择：

表2展开系统的选择

样品液的制备：取本品内容物1.5g，加氨饱和的50ml，加热回流30分钟， 放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

阴性对照溶液的制备：取参照处方工艺制备，制得的八角枫的阴性样品1.5g，自制， 同样品液的制备方法。

照薄层谱法（附录VIB）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲 基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，结果显示以二甲苯：乙酸乙酯：甲醇：异丙醇： 氨水=10：5：1：0.30：0.15为展开剂，斑点清晰，无干扰。

通过比较上述方法，以方法5的供试品制备方法和显方法，以及前述展开剂系统， 方法简单，节约成本，易点样，斑点清晰，故选用。

2、总黄酮含量测定：

由于方中汉桃叶药材所含成分为富马酸黄酮类，经过前期研究工作，用HPLC法测定 样品中的富马酸含量，效果较差，因此，照中国药典2010年版一部附录V A紫外-可见分 光光度法测定胶囊中的总黄酮含量其研究方法如下：

2.1、仪器与试药

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），KQ－500DB 型数字超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司（功率250W,频率40KHz）。

2.2、芦丁对照品：100080-200707含量92.5%，购自中国食品药品检定研究院，乙 醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠试剂均为分析纯，水为超纯水。

2.3、样品：金骨莲胶囊，批号20110601、20110902、20111001、20111002、20111101、 20120201、20120401、20120501、20120502、20120503，由贵州民族药业股份有限公司提 供。

2.4、检测条件：供试品提取液为60%乙醇，以芦丁为对照品，500nm为测定波长。

2.5、对照品溶液的制备：取芦丁对照品0.03586g，加60%乙醇制成0.3317mg/ml的 溶液。

2.6、标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml， 分别置25ml的容量瓶中，加水至5ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加 10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，放置15 分钟；同法制备空白溶液，照中国药典2010年版2005年版一部附录V A紫外-可见分光 光度法，在500nm波长处，测定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲 线，并计算得回归方程。

表3线性的测定结果

结果表明，在选定的测量范围内，芦丁的检测量和吸收度均具有良好的线性关系，相 关系数r均大于0.999，在0.0132682～0.0.066341mg范围内呈良好的线性关系。

2.7、供试品溶液的制备：取样品内容物，混匀，取0.2g，精密称定，置锥形瓶中， 精密加入60%乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理1小时，放冷，称定重量，用60%乙 醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液1ml，置25ml的容量瓶中，照2.6的方法， 测定吸光度。

2.8、仪器精密度考察：取上述已配制好的线性对照品溶液吸收度为中间值溶液，重 复测定6次，结果表明：6次进样精密度良好，RSD为0.1%，精密度好，试验误差小。结 果见表4：

表4精密度测定结果

2.9、重复性考察：取同一批样品（批号20120201）测定，按2.7方法平行操作6次， 分析方法的重复性良好。结果见表5：

表5重复性测定结果

取样量（g） 含量（mg/g）按芦丁重量计

0.2011 106.0074

0.1960 104.5472

0.2002 106.2410

0.2030 107.6508

0.2018 107.5679

0.2050 108.2614

平均值 106.7126

RSD(%) 1.3

2.10、稳定性考察：取重复性中同一供试液，分别于配制后0，5，10，15，20、 30min，实验结果提示：供试品溶液制备后30分钟内稳定，吸收度无明显变化。

表6稳定性测定结果

2.11、回收率试验

取批号为20120201样品（含总黄酮106.7126mg/g），称约0.1g共6份，精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入用60%乙酸配制的芦丁对照品溶液（浓度为0.5115mg/ml）2ml， 按供试品溶液制备方法制备样品溶液，测定，计算回收率，平均回收率为103.1%，结果 见表7：

表7回收率测定结果

结论：在本方法中对照品回收率为101.48～104.47%，RSD为1.0%，回收率符合规 定要求。

2.12、样品含量测定：

按上述方法对10批样品进行含量测定，结果见表8:

表8样品总黄酮的测定结果

2.13、样品含量限度确定：

测得样品的总黄酮量在18.3～30.4mg/粒之间，平均含量为25.2mg/粒。通过查阅有 关资料，汉桃叶含富马酸是叶较茎枝为多，但据生产厂家反应，投料生产用的是茎或茎枝， 几乎没有叶，考虑到原药材的药用位，采收季节、产地均可能影响总黄酮的含量,及上述 10批样品的实际测定结果，故将含量限度定为：本品每粒含总黄酮以芦丁计，不得少于 17.5mg。

3、八角枫含量测定：

3.1仪器与试药：

热电高效液相谱仪，变龙谱处理系统(配有四元梯度泵、在线脱气装置、自动 进样器、柱温箱、DAD检测器)

八角枫碱对照品，批号：10110058含量94.0%，购自阿法埃莎天津化学有限公司。甲 醇（谱醇，Merck公司）；水为超纯水。氨水、、庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾试 剂试药均为分析纯。

样品：金骨莲胶囊，批号20110601、20110902、20111001、20111002、20111101、 20120201、20120202、20120401、20120403、20120501、20120502、20120503，由贵州民 族药业股份有限公司提供。

3.2、谱条件：甲醇：缓冲液（0.2g庚烷黄酸钠、2.0g磷酸二氢钾、0.3ml磷酸加 水到1000ml）=22：78为流动相，柱温30℃，流速为1.000ml/min，检测波长为259nm； 理论板数按L（－）－八角枫碱峰计算应不低于6000。

3.2.1、流动相与谱柱的选择：

流动相选择：

流动相：乙腈－水（8∶92）、乙腈－0.1%冰醋酸（8∶92）、甲醇-0.1%三乙胺（8：92 磷酸调节PH3.4）、甲醇-含1%三乙胺和0.005mol/L庚烷磺酸钠的0.05mol/L磷酸二氢钾 溶液(用磷酸调节PH3.0)(8：92)、甲醇-(冰醋酸-0.25mol/L醋酸铵(1：33))(8：92)、乙 腈-缓冲液（0.2g庚烷黄酸钠、2.0g磷酸二氢钾加水到1000ml）(9：91)、甲醇-缓冲 液（0.2g庚烷黄酸钠、2.0g磷酸二氢钾、0.3ml磷酸加水到1000ml）(22：78)。

上述流动相，经试验比较，结果表明：采用甲醇-缓冲液（0.2g庚烷黄酸钠、2.0g 磷酸二氢钾、0.3ml磷酸加水到1000ml）(22：78)作为流动相，L（－）－八角枫碱与其 它组分的都能很好分开，峰形较好。

谱柱选择：柱子采用氨基柱、硅胶柱、C₁₈柱，结果氨基柱、硅胶柱不出峰，采用C₁₈柱峰形好。

3.2.2检测波长选择：取配制成一定浓度的L（－）－八角枫碱对照品，注入液相 谱，用DAD检测扫描，得到L（－）－八角枫碱的紫外吸收光谱，L（－）－八角枫碱在 259nm处有最大吸收，即采用259nm。

3.2.3柱温的选择：取同一批样品(批号20120201）以同样的提取方法、提取时间、 提取溶剂，对不同柱温量作了比较试验。

表9柱温的选择

为使主峰的保留时间合理，即采用30℃。

3.3、对照品溶液制备：精密称取L（－）－八角枫碱对照品10.97mg，加甲醇制成 每1ml含10.312μg的溶液，即得。

3.4、样品溶液的制备：取装量差异项下的内容物混匀，取约1.5g，精密称定，置150ml 的锥形瓶中，加氨水3ml润湿，密闭5分钟后，再加入80ml，70℃水浴回流50 分钟，放冷，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇适量溶解，并转移至10ml的容量瓶中，加甲 醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

（1）提取方法及溶剂的选择：以下称量为1.5g，参照有关文献，对提取方法行了比 较试验，用同一批样品(批号20120201)以不同的提取方法和溶剂提取测定，采用方法7， L（－）－八角枫碱含量较高。结果见表10：

表10提取方法的选择

（2）提取溶剂加入量的考察：对提取溶剂加入量50ml、80ml进行了比较试验，用同 一批样品(批号20120201)共2份,结果加入80ml溶剂提取量测得值高于50ml，选择了溶 剂提取量为80ml。

表11提取溶剂加入量的考察

（3）氨水加入量的考察：对氨水润湿的加入量进行了比较试验，用同一批样品(批号 20120201)共2份,结果加入3ml与4ml无差别，选择了3ml。

表12氨水加入量的考察

（4）提取时间的选择：用同一批样品(批号20120201)共2份，采用上述方法7，对 回流的时间作了比较试验，结果表明：回流30分钟、50分钟已基本提取完全。为使样 品充分提取完全，选择50分钟。

表13提取时间的比较

提取时间（min) L（－）－八角枫碱含量（mg/粒）

30 0.015

50 0.016

60 0.015

120 0.015

（5）水浴回流温度的的选择：用同一批样品(批号20120201)共2份，采用上述方法 7，对水浴回流的温度作了比较试验，结果表明：70℃回流略高于80℃。选择水浴温度 为70℃。

表14提取时间的比较

水浴回流温度（℃) L（－）－八角枫碱含量（mg/粒）

70 0.016

80 0.014

3.5、空白试验：

取处方中除八角枫外的其他药材，按处方剂量及制法和工艺要求制备缺八角枫的空白 样品，照含量测定项下样品溶液的制备方法制成阴性对照样品溶液，同法进行测定，结果 在与对照品相同的保留时间位置，无其他干扰峰出现，表明除八角枫的其他药材和辅料对 L（－）－八角枫碱峰无干扰。

3.6、测定法：分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各10μl，注入液相谱仪，以 外标法计算测定，即得。

3.7、纯度考察：经纯度考察是单峰。精密吸取对照品溶液、样品溶液各10μl注入 液相谱仪，用DAD检测，结果其纯度因子均在计算出的阈值限值内，并且两者的吸收光 谱一致。

3.8线性关系考察：分别精密量取上述对照品溶液制备下的溶液2、5、10、15、20、 25μl注入液相谱仪，记录谱图，以进样量对峰面积回归，计算L（－）－八角枫碱 的线性方程，相关系数，并绘制标准曲线，结果见表15：

表15线性测定结果

结果表明，在选定的测量范围内，L（－）－八角枫碱的检测量和峰面积均具有良好 的线性关系，相关系数r均大于0.999，在0.02062～0.25780μg范围内呈良好的线性关 系。

拟合成过原点的直线方程为Y＝964046.629X，将线性关系考察的最低进样量与最高 进样量分别代入两方程进行计算，所得峰面积相对偏差为0.79％（低）～0.19％（高）。 由此可作截距近似为零，故正文中采用外标一点法计算L（－）－八角枫碱含量。

3.9仪器精密度考察：精密量取上述已配制好的对照品溶液10μl，注入液相谱仪， 重复测定6次，结果表明：6次进样精密度良好，RSD小于0.4%，精密度好，试验误差小。 结果见表16：

表16精密度测定结果

3.10、重复性考察：取同一批样品（批号20120201）测定，平行操作6次，分析方 法的重复性良好。结果见表17：

表17重复性测定结果

取样量（g） 含量（mg/g）按L（－）－八角枫碱重量计

1.5010 0.06286

1.5015 0.06191

1.5099 0.06399

1.5010 0.06250

1.5011 0.06271

1.5005 0.06305

平均值 0.06284

RSD(%) 1.1

3.11、耐用性考察

（1）稳定性考察：取同一批样品(批号20120201）按供试品溶液制备方法制备样品 溶液，于室温下0、1、2、3、4、5、6、14小时进样1次，考察L（－）－八角枫碱在室 温下的溶液稳定性，结果表明，样品溶液在室温条件下14小时内基本稳定。结果见表18：

表18稳定性测定结果

（2）不同谱柱考察：取同一批号的样品（批号：20120201）共2份，按样品处理 方法制备样品溶液，按上述谱条件进样计算，结果，每种C₁₈都能分离，且峰形好。见下 表19：

表19不同谱柱考察测定结果

（3）不同柱温的考察：取同一批样品(批号20120201）共2份，以同样的提取方法、 提取时间、提取溶剂，对不同柱温作了比较试验。

表20不同柱温的考察结果

（4）不同波长的考察取同一厂家同一批号的样品（批号：20120201）共2份，按 样品处理方法制备样品溶液，对正负2nm的波长进行考察，按上述谱条件进样计算，结 果见下表21：

表21不同波长考察测定结果

3.12、回收率试验：

取批号为20120201样品（含L（－）－八角枫碱0.062842mg/g），混匀，取样品约 0.75g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入用甲醇配制的L（－）－八角枫碱 对照品溶液（浓度为0.051559mg/ml）1ml，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，测定， 计算回收率，平均回收率为97.5%，结果见表22：

表22回收率测定结果

结论：在本方法中对照品回收率为95.70～100.29%，RSD为1.8%，回收率符合规定 要求。

3.13样品含量测定：

按正文收载的方法对12批样品进行含量测定，结果见表23:

表23样品的八角枫碱测定结果

3.14样品含量限度的确定：

八角枫药材的标准为《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版，没有含量测定，， 标准规定该药材的药用部位为细须根(白龙须)或干燥支根(白金条)，处方使用量为须根 1～3g,支根为3～6g，测定的10原药材中有须根、有须根与支根的混合物等，含量为 0.016%-0.95%，根须中含量最高。据报道,兔静注毒藜碱最小致死量约为253.5mg，以最 高含量0.95%即9.5mg/g计算，处方的投料量为50g,制粒为1000粒，即每粒相当于原生粉 0.05g,按80%的转移率，即每粒为0.38mg，每天的最高服用量约为3mg，大大低于最小致死 量253.5mg，但因八角枫碱在该成方制剂中药理作用尚不明确，八角枫碱既是有效成分， 也是毒性成分，故拟定处方高含量的80%作为样品高限值，即每粒含八角枫碱0.30mg；12 批成药样品在测定含量在0.0045～0.054mg/粒之间，平均含量为0.019mg/粒,以平均含量 的40%即0.007mg/粒为低限，与药材推算相符合。故将含量限度定为：“本品每粒含八角枫 以L（－）－八角枫碱（C₁₀H₁₄N₂）计，为0.007～0.30mg。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明建立了关节肿痛的胶囊的金骨莲胶 囊制剂的检测方法，科学合理，准确度高，重现性好，能全面有效地控制金骨莲胶囊的质 量，确保了该制剂的临床疗效及安全性。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的说明。

具体实施方式：

实施例1：制备关节肿痛的金骨莲胶囊

处方：透骨香343g、汉桃叶400g、大血藤370g、八角枫50g、金铁锁50g、淀粉125g；

制法：以上五味药材，金铁锁加水煎煮3小时，滤过，滤液备用，药渣干燥后粉碎成 细粉，备用；其余透骨香等四味，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，合并上 述滤液，浓缩至60℃测相对密度为1.25～1.28的清膏；加入上述细粉及淀粉，混匀，干燥， 粉碎，过筛，装入胶囊，制成1000粒。

实施例2：关节肿痛的金骨莲胶囊检测方法，由以下内容组成：

性状：本品为胶囊剂，内容物为黄棕至红棕的粉末；气微，味微苦涩；

鉴别：（1）透骨香鉴别：取本品内容物3g，加甲醇30ml，加热回流30分钟，滤过，滤 液浓缩至0.5ml，作为供试品溶液；另取透骨香对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照 中国药典2010年版一部附录VIB薄层谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同 一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以：丙酮=9：1为展开剂，展开， 取出，晾干，用浓氨试液熏约5分钟，置365nm紫外光灯下观察，供试品谱中，在与对照 药材谱相应的位置上，显相同颜的荧光斑点；

（2）大血藤鉴别：取本品内容物2g，加乙醚20ml，加热回流30分钟，放冷，滤过， 滤液挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取大血藤对照药材2g，同法制 成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录VIB薄层谱法试验，吸取对照药材溶 液5μl、供试品溶液10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上， 以甲苯：乙酸乙酯：甲酸=20:8:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液， 在105℃加热至斑点显清晰，供试品谱中，在与对照药材谱相应的位置上，显相同 颜的斑点；

（3）金铁锁鉴别：取本品内容物2g，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸 干，残渣加水30ml使溶解，加以水饱和的正丁醇提取两次，每次20ml，合并正丁醇液， 加氨试液30ml洗涤，弃去氨试液，再加以正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水洗液，正丁 醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取金铁锁对照药材1g，同法制 成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录VIB薄层谱法试验，吸取供试品溶液、 对照药材溶液各5～10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上， 以：-乙酸乙酯：甲醇：水=15:40:22:10在10℃以下放置的下层溶液为展开剂， 展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显清晰，分别置日光 下及紫外光灯(365nm)下检视，供试品谱中，在与对照药材谱相应的位置上，显相同 颜的斑点；

（4）八角枫鉴别：取本品内容物1.5g，加氨饱和的50ml，加热回流30分钟， 放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取八角枫对照药材 0.5g，同法制成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录VIB薄层谱法试验，吸 取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上， 以二甲苯：乙酸乙酯：甲醇：异丙醇：氨水=10:5:1:0.30:0.15为展开剂，展开，取出， 晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显清晰，供试品谱中，在与对照 药材谱相应的位置上，显相同颜的斑点；

检查：符合中国药典2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

浸出物：照中国药典2010年版一部附录X A醇溶性浸出物测定项下的热浸法测定，用 60%乙醇作溶剂，不得少于16.0%；

含量测定：

（1）总黄酮测定

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加60%乙醇制成0.35mg/ml的溶液；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别 置25ml的容量瓶中，加水至5ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝 溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，放置15分钟；同法制 备空白溶液，照中国药典2010年版一部附录VA紫外-可见分光光度法，在500nm波长处，测 定吸光度；以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法：取本品装量下的内容物，混匀，取约0.2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加 入60%乙醇25ml，密塞，称定重量，在功率250W,频率40KHz条件下超声处理1小时，放冷， 称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液1ml，置25ml的容量瓶中， 照标准曲线的制备项下的方法，至“加水至5ml”起，依法测定吸光度，标准曲线上读出 供试品溶液中芦丁的浓度，计算，即得；

本品每粒含总黄酮以芦丁计，不得少于17.5mg；

（2）八角枫测定：

照高效液相谱法（中国药典2010年版一部附录VI D）测定；

谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：缓冲液） =22：78为流动相，所述缓冲液制备方法为：0.2g庚烷黄酸钠、2.0g磷酸二氢钾、0.3ml 磷酸加水到1000ml，柱温30℃，流速为1.000ml/min，检测波长为259nm；理论板数按L（－） －八角枫碱峰计算应不低于6000；

对照品溶液的制备：精密称取L（－）－八角枫碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含10 μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本品装量差异项下的内容物，混匀，取约1.5g，精密称定，置 150ml的锥形瓶中，加氨水3ml润湿，密闭5分钟后，再加入80ml，70℃水浴回流 50分钟，放冷，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇适量溶解，并转移至10ml的容量瓶中，加甲 醇稀释至刻度，摇匀，用0.45um的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱仪，测定， 即得；

本品每粒含八角枫以L（－）－八角枫碱（C10H14N2）计，为0.007～0.30mg。