一株纤维素酶高产菌株及其筛选方法与应用

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一株纤维素酶高产菌株及其筛选方法与应用。

目前，世界各国都在积极研究利用非粮食手段生产生物燃料，用以解决日益严重的能源危机、气候问题以及粮食短缺问题。木质纤维素作为地球上储量最丰富的多糖类物质，利用其生产燃料乙醇已成为各国研究的热点领域。

但由于木质纤维素结构致密复杂，大多数微生物并不能将其作为直接碳源来生产乙醇，只有将其水解成可发酵单糖类物质后，才能被微生物利用。酶解法由于其反应条件温和、效率高、能耗低、选择性强以及环保效果好等优点，被广泛应用于纤维素水解过程中。酶解法水解纤维素的工艺对纤维素酶的需求量很大，纤维素酶成本较高。目前纤维素酶一般是采用特定菌株对生物质进行发酵来获得。例如专利CN201310431838.1采用乳酸菌和复合霉菌两段发酵金针菇菌糠生产纤维素酶，而专利CN201510267129.3则利用一种巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)经过诱导培养基振荡培养高效表达而得到纤维素酶，专利CN201510667840.8提到了一种纤维素酶产生菌及其筛选方法，通过挑取滤纸条上的透明圈菌落，实现筛选纤维素酶产生菌。但这些方法都存在一些弊端，专利CN201310431838.1采用了两段培养来获得纤维素酶，工艺流程复杂，产酶效率低成本高，不适合产业化；专利CN201510267129.3采用的是芽孢杆菌，存在纤维素酶产酶过程容易染菌，另外分离提纯困难等问题。另外，目前纤维素酶行业还普遍存在发酵产酶能力低，生产成本高，生产周期长等问题。专利CN201510667840.8则只是涉及了纤维素酶产生菌的一种实验筛选方法，未涉及菌种诱变改造及其筛选方法与产酶应用。

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一株纤维素酶高产菌株及其筛选方法与应用。

本发明补充丰富了现有纤维素酶行业的产酶菌株品种，提高了产酶活力，降低了纤维素酶成本，促进了生物质产乙醇产业化的发展，也有利于促进纤维素酶工业的发展。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一株纤维素酶高产菌株，命名为ZR/TR-UV-3，分类名为里氏木霉(Trichoderma reesei)，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17798，保藏日期为2019年06月13日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所述纤维素酶高产菌株，已经运用到公司50M3不锈钢罐发酵产酶的实际生产中。

所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)的菌株形态为：所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)在PDA斜面培养基上生长4-7天，开始为白小菌落，菌落比较小而且颜肉白很浅淡，看着有点像酵母菌和细菌菌落，然后慢慢长成颜稍白的单个菌落，并开始长出菌丝，但是气生菌丝很短，基内菌丝却生长旺盛穿透力强，把培养基很快变成绿，最后会长出少量的孢子，孢子颜为浅黄白。

所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)的显微形态为：所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)镜检形态菌丝短而粗状多分枝，菌丝顶部细尖。

所述纤维素酶高产菌株的出发菌株为保藏编号为CGMCC3.3711的里氏木霉(Trichoderma reesei)，本发明中，保藏编号为CGMCC3.3711的里氏木霉 (Trichodermareesei)购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，为一种成熟的容易得到的菌株。

本发明还提供所述纤维素酶高产菌株的筛选方法，以保藏编号为 CGMCC3.3711的里氏木霉(Trichoderma reesei)作为出发菌株，进行紫外诱变，得到所述纤维素酶高产菌株。

在本发明一个实施方式中，所述紫外诱变的条件为：避光条件下，采用15-25W 紫外灯在10-20cm的距离下震荡照射5-30min进行紫外诱变。

在本发明一个实施方式中，照射过程中，对出发菌株的孢子进行搅拌，搅拌速率为50～100r/min，此过程中，菌株的孢子存活率为5～10％。

在本发明一个实施方式中，所述纤维素酶高产菌株的筛选方法，具体包括以下步骤：

(1)紫外诱变：

以保藏编号为CGMCC3.3711的里氏木霉(Trichoderma reesei)作为出发菌株，取其孢子，紫外照射进行紫外诱变；将诱变后菌悬液涂布于筛选培养基平板，避光培养；

(2)菌株富集及保藏

从筛选培养基平板中挑选好的诱变菌落进行筛选培养基斜面28-30℃富集培养4-7d，同时挑取孢子存于25％甘油管-70℃保存；

(3)菌株筛选及摇瓶验证

将培养好的诱变菌株与对照菌株一同进行摇瓶产酶验证及筛选，经过初筛和复筛，以及多次递增诱变育种，得到一株产酶性能比出发菌株提高70.6％的突变菌株，即所述纤维素酶高产菌株。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，取保藏编号为CGMCC3.3711的里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌种斜面，将孢子用生理盐水(0.9％氯化钠溶液) 洗至装有10mL生理盐水的100mL三角瓶中，28℃、180r/min震荡4h；将震荡后菌液通过装有脱脂棉的漏斗过滤至装有30mL生理盐水的250mL三角瓶中(以上两个三角瓶均装有玻璃珠)以去除菌丝体，保留孢子，震荡摇匀。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，用移液吸取上述孢子悬液于6cm 平皿中，菌液厚度1.5-2.5mm，避光条件下，采用25W紫外灯在15cm的距离下震荡照射20min进行紫外诱变。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，将诱变后菌悬液取0.1mL涂布于筛选培养基平板中，此为100梯度，之后将诱变后的孢子悬液全部倒入装有45mL 无菌水的三角瓶中，此为10-1梯度，再分别稀释至10-2、10-3、10-4等不同梯度，每个梯度于避光条件下涂布若干个筛选培养基平板，优选以10-1、10-2梯度涂布，未经紫外照射的为对照菌株，以10-4或其他合适梯度涂布于筛选培养基平板，均在 28-30℃避光培养4-7d。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，筛选培养基配方为：2％CMC-Na，0.2％蛋白胨，营养盐1％，微量元素0.1％，1.0％琼脂粉，120-122℃湿热灭菌 20-40min，趁热分装平板，冷却后使用。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，产酶发酵条件如下：

种液：2％葡萄糖，1％玉米浆粉，营养盐1％，微量元素0.2％，装量100mL/500mL 三角瓶，120-126℃湿热灭菌20-40min，接种量：无菌水2～3mL加入孢子斜面中，冲洗孢子后全部接入种液，28-30℃，100-180r/min培养24-36h；

发酵液：营养盐1-2％，微量元素0.1-0.3％，玉米浆粉1-1.5％，纤维素粉1-1.5％，麸皮0.5-1％，纸浆粉1-2％，pH4.5-5.0，装量100mL/500mL三角瓶，122-130℃灭菌30-60min，按10％接种成熟种液后，于28℃，120-200r/min培养，培养过程用氨水进行pH调整；

营养盐为硫酸镁、硫酸铵、硫酸钾、尿素、氯化钙或磷酸二氢钾等中的一种或多种，每种的加量为0.1-0.5％；

进行120h发酵产酶。

经过初筛和复筛，以及多次递增诱变育种，通过菌株筛选及摇瓶验证，得到一株产酶性能比出发菌株提高70.6％的突变菌株，该菌株与出发菌株在菌株形态、产孢子能力和产酶能力等方面皆有很大的突变。

原始出发菌株的菌株形态：原始出发菌株在PDA斜面培养基上生长4-7天，逐渐由浅白小菌落变为白丝状辐射生长，然后慢慢菌落变大菌丝变多并开始长孢子，之后孢子渐渐变为绿，最后绿孢子长满整个培养基表面。

原始出发菌株的显微形态：出发菌株镜检形态菌丝细长光滑均匀分枝少。

所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)的菌株形态为：所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)在PDA斜面培养基上生长4-7天，开始为白小菌落，菌落比较小而且颜肉白很浅淡，看着有点像酵母菌和细菌菌落，然后慢慢长成颜稍白的单个菌落，并开始长出菌丝，但是气生菌丝很短，基内菌丝却生长旺盛穿透力强，把培养基很快变成绿，最后会长出少量的孢子，孢子颜为浅黄白。

所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)的显微形态为：所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)镜检形态菌丝短而粗状多分枝，菌丝顶部细尖。

出发菌株的基内菌丝相对突变株不发达，基内菌丝少，培养基内基本无颜。本发明得到的突变菌株，与之不同的典型特征为菌丝生长慢，菌丝短，产孢子能力比较弱。

同时，本发明还对该纤维素酶高产菌株进行了摇瓶产酶平行验证，摇瓶产酶的平行验证结果如下表：

菌株编号 对照1 对照2 诱变菌1 诱变菌2 提高幅度 FPA(FPU/mL) 18.6 19.2 32.1 32.4 70.6％ 酶蛋白浓度g/L 2.22 2.33 3.72 3.86 66.6％

表中，对照1、对照2采用的都是出发菌株，诱变菌1、诱变菌2采用的是同样的突变菌株。

同时，本发明还进行了发酵罐产酶验证。

进行发酵罐产酶验证的方法为：

种子液培养：将筛选得到的菌株接种到装有上述种子培养基的500ml摇瓶内，装液量为100-150ml，转速100-180r/min，于28-30℃培养24-36h，当菌丝沉降量为90％时，以10％的接种量(v/v)接种于10L发酵罐中。

发酵罐培养：培养基装液量为4-8L，发酵条件为：温度25℃-32℃(自控)， pH4.5-5.5(以5-25％碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液或氨水溶液流加，在线实时自控调节)，搅拌转速(在线实时调节)100r/min-500r/min，通气量3L/min-15L/min，罐压0.02MPa-0.08MPa。同时，定期检测发酵液的糖和氮含量，并根据糖的消耗，及时补充糖液和氮源。产酶发酵时间为96-144h。

按同条件进行对照菌株的产酶发酵验证。

平行验证结果如下表：

菌株编号 对照1 对照2 诱变菌1 诱变菌2 提高幅度 FPA(FPU/mL) 108.3 111.5 183.7 178.1 64.6％ 酶蛋白浓度g/L 12.5 13.2 21.1 21.0 63.8％

表中，对照1、对照2采用的都是出发菌株，诱变菌1、诱变菌2采用的是同样的突变菌株。

本发明还进行了电泳图谱验证，电泳图谱验证采用常规实验操作手段。

通过电泳图谱显示，突变菌株所产纤维素酶蛋白显示的电泳条带与对照的出发菌株存在明显不同，有两个条带突变菌株颜比对照的明显要深。

所述纤维素酶高产菌株用于发酵产纤维素酶。

与现有技术相比，本发明得到了一株产酶性能比出发菌株提高70.6％的突变菌株，该菌株与出发菌株在菌株形态、产孢子能力和产酶能力等方面皆有很大的突变。

图1为出发菌株与突变菌株的菌株形态照片；

图2为出发菌株的显微形态照片；

图3为突变菌株的显微形态照片；

图4为新菌株产酶液电泳图谱。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

本实施例的出发菌株为保藏编号为CGMCC3.3711的里氏木霉(Trichodermareesei)，本发明中，保藏编号为CGMCC3.3711的里氏木霉(Trichoderma reesei) 购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，为一种成熟的容易得到的菌株。

本实施例提供纤维素酶高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)紫外诱变

取实验室保存的菌种斜面，将孢子用生理盐水(0.9％氯化钠溶液)洗至装有 10mL生理盐水的100mL三角瓶中，28℃、180r/min震荡4h；将震荡后菌液通过装有脱脂棉的漏斗过滤至装有30mL生理盐水的250mL三角瓶中(以上两个三角瓶均装有玻璃珠)以去除菌丝体，保留孢子，震荡摇匀；用移液吸取上述孢子悬液于6cm平皿中，菌液厚度约2mm，避光条件下，采用25W紫外灯在15cm的距离下震荡照射20min进行紫外诱变；将诱变后菌悬液取0.1mL涂布于筛选培养基平板中，此为100梯度，之后将诱变后的孢子悬液全部倒入装有45mL无菌水的三角瓶中，此为10-1梯度，再分别稀释至10-2、10-3、10-4等不同梯度，每个梯度于避光条件下涂布若干个筛选培养基平板，优选以10-1、10-2梯度涂布。未经紫外照射的为对照菌株，以10-4或其他合适梯度涂布于筛选培养基平板，均在28-30℃避光培养4-7d。

步骤(1)中，筛选培养基配方为：2％CMC-Na，0.2％蛋白胨，营养盐1％，微量元素0.1％，1.0％琼脂粉，120-122℃湿热灭菌20-40min，趁热分装平板，冷却后使用。

(2)菌株富集及保藏

从筛选培养基平板中挑选好的诱变菌落进行筛选培养基斜面28-30℃富集培养4-7d，同时挑取孢子存于25％甘油管-70℃保存。

(3)菌株筛选及摇瓶验证

将培养好的诱变菌株与对照菌株一同进行摇瓶产酶验证及筛选，经过初筛和复筛，以及多次递增诱变育种，得到一株产酶性能比出发菌株提高70.6％的突变菌株，即所述纤维素酶高产菌株。

产酶发酵条件如下：

种液：2％葡萄糖，1％玉米浆粉，营养盐1％，微量元素0.2％，装量100mL/500mL 三角瓶，120-126℃湿热灭菌20-40min，接种量：无菌水2～3mL加入孢子斜面中，冲洗孢子后全部接入种液，28-30℃，100-180r/min培养24-36h；

发酵液：营养盐1-2％，微量元素0.1-0.3％，玉米浆粉1-1.5％，纤维素粉1-1.5％，麸皮0.5-1％，纸浆粉1-2％，pH4.5-5.0，装量100mL/500mL三角瓶，122-130℃灭菌30-60min，按10％接种成熟种液后，于28℃，120-200r/min培养，培养过程用氨水进行pH调整；

营养盐为硫酸镁、硫酸铵、硫酸钾、尿素、氯化钙或磷酸二氢钾等中的一种或多种，每种的加量为0.1-0.5％；

进行120h发酵产酶。

经过初筛和复筛，以及多次递增诱变育种，通过菌株筛选及摇瓶验证，得到一株产酶性能比出发菌株提高70.6％的突变菌株，该菌株与出发菌株在菌株形态、产孢子能力和产酶能力等方面皆有很大的突变。

参考图1，原始出发菌株的菌株形态：原始出发菌株在PDA斜面培养基上生长4-7天，逐渐由浅白小菌落变为白丝状辐射生长，然后慢慢菌落变大菌丝变多并开始长孢子，之后孢子渐渐变为绿，最后绿孢子长满整个培养基表面。

参考图2，原始出发菌株的显微形态：出发菌株镜检形态菌丝细长光滑均匀分枝少。

参考图1，所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)的菌株形态为：所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)在PDA斜面培养基上生长4-7天，开始为白小菌落，菌落比较小而且颜肉白很浅淡，看着有点像酵母菌和细菌菌落，然后慢慢长成颜稍白的单个菌落，并开始长出菌丝，但是气生菌丝很短，基内菌丝却生长旺盛穿透力强，把培养基很快变成绿，最后会长出少量的孢子，孢子颜为浅黄白。

参考图3，所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)的显微形态为：所述纤维素酶高产菌株(突变菌株)镜检形态菌丝短而粗状多分枝，菌丝顶部细尖。

出发菌株的基内菌丝相对突变株不发达，基内菌丝少，培养基内基本无颜。本发明得到的突变菌株，与之不同的典型特征为菌丝生长慢，菌丝短，产孢子能力比较弱。

所得到的突变的纤维素酶高产菌株，命名为ZR/TR-UV-3，分类名为里氏木霉(Trichoderma reesei)，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17798，保藏日期为2019年06月13日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所述纤维素酶高产菌株，已经运用到公司50M3不锈钢罐发酵产酶的实际生产中。

同时，本发明还对该纤维素酶高产菌株进行了摇瓶产酶平行验证，摇瓶产酶的平行验证结果如下表：

菌株编号 对照1 对照2 诱变菌1 诱变菌2 提高幅度 FPA(FPU/mL) 18.6 19.2 32.1 32.4 70.6％ 酶蛋白浓度g/L 2.22 2.33 3.72 3.86 66.6％

表中，对照1、对照2采用的都是出发菌株，诱变菌1、诱变菌2采用的是同样的突变菌株，即本申请所述纤维素酶高产菌株。

同时，本发明还进行了发酵罐产酶验证。

进行发酵罐产酶验证的方法为：

种子液培养：将筛选得到的菌株接种到装有上述种子培养基的500ml摇瓶内，装液量为100-150ml，转速100-180r/min，于28-30℃培养24-36h，当菌丝沉降量为90％时，以10％的接种量(v/v)接种于10L发酵罐中。

发酵罐培养：培养基装液量为4-8L，发酵条件为：温度25℃-32℃(自控)， pH4.5-5.5(以5-25％碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液或氨水溶液流加在线实时自控调节)，搅拌转速(在线实时调节)100r/min-500r/min，通气量3L/min-15L/min，罐压0.02MPa-0.08MPa。同时，定期检测发酵液的糖和氮含量，并根据糖的消耗，及时补充糖液和氮源。产酶发酵时间为96-144h。

按同条件进行对照菌株的产酶发酵进行验证。

平行验证结果如下表：

菌株编号 对照1 对照2 诱变菌1 诱变菌2 提高幅度 FPA(FPU/mL) 108.3 111.5 183.7 178.1 64.6％ 酶蛋白浓度g/L 12.5 13.2 21.1 21.0 63.8％

表中，对照1、对照2采用的都是出发菌株，诱变菌1、诱变菌2采用的是同样的突变菌株，即本申请所述纤维素酶高产菌株。

本发明还进行了电泳图谱验证，电泳图谱验证采用常规实验操作手段。

参考图4，通过电泳图谱显示，突变菌株所产纤维素酶蛋白显示的电泳条带与对照的出发菌株存在明显不同，有两个条带突变菌株颜比对照的明显要深。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。