一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法

本发明属于生物学分子标记分子遗传技术领域，具体涉及一种基于转录测序获得 青篱柴SSR引物的方法。

青篱柴(Tirpitzia sinensis)是亚麻科(Linaceae)青篱柴属(Tirpitzia的一种 灌木或小乔木，主要集中分布于我国贵州、广西和云南等西南喀斯特地区。青篱柴的茎和叶 能活血、止血、消肿止痛和接骨，在民间有较高的药用价值，而花具有很好的生态观赏价值， 可以引种栽培于园林庭院美化环境。尽管青篱柴具有重要的生态和经济效益，但其种质资 源研究工作仍较为薄弱，尤其SSR分子标记的研究还未见报道。

简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)是指由1～6个核苷酸为重复单位 组成的串联重复序列，随机、广泛、均匀地分布于真核生物基因组中，由于重复次数不同而 造成简单序列长度多态性(SSLP)。不同物种的简单重复序列差异很大，主要表现在重复次 数、基序类型、长度以及在染体上的分布情况等，从而反映出物种间高度的等位基因多样 性。虽然SSR序列具有高度多态性，但其两端的序列一般都比较保守和专一，因此可凭借两 端的保守序列设计特异性的SSR引物，通过PCR技术扩增出SSR序列，再利用琼脂糖凝胶电泳 或聚丙烯酰胺凝胶电泳技术获得其长度多态性。由于多态性高、技术重复性好，易于操作等 优点，目前，SSR分子标记一直被广泛应用于物种的遗传分析，已经在物种的纯度鉴定、基因 功能定位、分子辅助育种、遗传图谱构建以及亲缘关系分析等方面有广泛的应用。

目前，青篱柴尚无基因组信息及SSR引物。因此，针对青篱柴在SSR分子标记方面的 研究空白，如何基于转录组测序获取青篱柴SSR引物，从而更好的揭示青篱柴资源的亲缘关 系，探究其在不同地理分布区的遗传差异，揭示其物种分化过程，获取其优质物种资源成为 了该技术领域急需解决的技术难题。

本发明的目的之一是提供一种基于转录测序获得青篱柴SSR引物的方法，从而更 好地研究不同地理分布区青篱柴的遗传差异及亲缘关系，用于获取青篱柴优秀种质资源。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种基于转录测序获得青篱柴SSR引物的方法，包括以下步骤：

(1)取贵州省黔东南苗族侗族自治州的青篱柴作为样品，将同一株青篱柴根、茎、 叶3种组织做转录组测序；

(2)分析不同类型SSR重复单元的重复次数分布，利用MISA软件对青篱柴转录组测 序后组装出的Unigene序列进行SSR位点检测和分析，筛选SSR位点，搜索设置为单核苷酸重 复至少10次，二核苷酸重复至少6次，三至六核苷酸重复至少5次；

(3)采用Primer 3.0引物批量设计程序对SSR位点的两端序列进行引物设计；

(4)利用植物基因组DNA提取试剂盒提取来自黔南布依族苗族自治州不同地理位 置的20份青篱柴样品的DNA；

(5)根据引物设计原则，利用Primer Premier 5.0对(3)中已设计好的引物进行进 一步筛选，最终选取50对引物序列送至公司进行合成，引物合成后进行PCR扩增；

(6)采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选多态性引物，根据电泳检测显影结果， 分析其多态性。

优选地，所述步骤(1)中所述转录组测序中，转录组测序时所使用的是青篱柴根、 茎和叶片3种组织的混合RNA。

优选的，所述步骤(1)中所述转录组测序的具体步骤如下：采用全能型植物RNA提 取试剂盒(OminiPlant RNA Kit)分别提取青篱柴根、茎和叶片的总RNA，纯化分离总RNA中 的mRNA，以mRNA为模板合成双链cDNA，双链cDNA进行末端修复补平，加A尾并连接测序接头， 最后进行PCR扩增，得到符合测序要求的文库，用Illumina HiSeqTM2000对扩增后的文库进 行检测，使用Trinity软件组装测序数据得到Unigene。

优选的，所述步骤(2)中所述利用MISA软件对青篱柴转录组测序后组装出的 Unigene序列进行SSR位点检测和分析，检测中对应的单核苷酸至少重复10次，二核苷酸至 少重复6次，三至六核苷酸至少重复5次，同时筛选被间隔小于或等于100bp碱基打断的复合 型SSR。

优选的，所述步骤(3)中所述对SSR位点两端序列进行引物设计的参数标准如下： Tm55-64℃，上、下游引物的Tm值相差小于5℃，引物长度为18-27bp，产物大小为10-300bp， GC含量为40％-60％，选取引物50对，尽量避免出现引物二级结构。

优选的，所述步骤(5)中所述扩增所用的反应体系为Template DNA(50ng/ul)1ul， 2x Master Mix(Promega)10ul，Forward primer(10uM/ul)0.5ul，Reverse primer(10uM/ ul)0.5ul，dd H2O 2ul，反应过程中，94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延 伸40s，36次循环，再72℃延伸7min，得到扩增产物，放于4℃保存。

优选的，所述步骤(6)中的具体步骤如下：

(1)配制1L6％变性聚丙烯酰胺凝胶，1L10xTBE缓冲液，50ulTEMED，1L10％过硫酸 铵，50ml0.5mol/LEDTA，1L硝酸银染液，500ml显影液(10gNaOH、0.2g Na2CO3、2ml甲醛)；

(2)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳过程为准备胶板，3％琼脂糖封胶，50ml6％胶储液、 50ulTEMED原液及250ul10％过硫酸铵溶液震荡混匀灌胶，加入10xTBE缓冲液吹孔，加 5ulPCR扩增产物400V电压下电泳跑胶2小时；

(3)将跑好胶的玻璃板用蒸馏水洗胶两次，轻晃，每次30s，加入AgNO3溶液银染 10min；

(4)用蒸馏水洗胶1min，加入显影液显15s，换用新的显影液，等待10-15min直到 显示出清晰的条带为止。

本发明的另一目的是提供一种能鉴定青篱柴品种的引物组。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

所述的鉴定青篱柴品种的引物组，其特征在于：包括8对SSR多态性引物组：

(1)QLC_01

上游引物：AAAAACCACACGAAACCGGC

下游引物：TCTTTTTCAGACAAATTTTCCTCCTCT

(2)QLC_06

上游引物：AAAACACTGACAAGCAATTAAAGAC

下游引物：GGTTCTCGGTACAAAGGAGGA

(3)QLC_13

上游引物：AAACCACCACAACCCACCAT

下游引物：CATCGGTACCGTACTTGGGG

(4)QLC_17

上游引物：AAACCAGCTGAAAAGCAGGC

下游引物：TCCACGTTCGTGACCTTCAC

(5)QLC_18

上游引物：AAACCATTTTAAAAGAAACGCTTCA

下游引物：CCTCATGGGAAGCCGAGTTT

(6)QLC_20

上游引物：AAACCCACCTTGTCCAAGCA

下游引物：TCAACAACAGCATTGGCAGC

(7)QLC_36

上游引物：TTTTCCCTCTTCGCCTTCCC

下游引物：ACTTGTCTCTTTCGTCGCGT

(8)QLC_43

上游引物：TTTGTCCATTTGCAAGCCGC

下游引物：ATCCATGAGGCTGCATCGAG

本发明的优点在于：

本发明通过使用Illumina HiSeqTM2000平台进行转录组测序的基础上，获得大量 的SSR信息，通过PCR检测，对选取的部分SSR进行验证和多态性分析，从而获得具有通用型 的多态性引物。本发明旨在利用分子标记技术明确青篱柴SSR的总体特点，开发青篱柴SSR 引物，为利用SSR分子标记进行青篱柴种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系的研 究奠定基础。

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

图1为本发明实施例中QLC_01引物的电泳结果。

图2为本发明实施例中QLC_13引物的电泳结果。

图3为本发明实施例中QLC_17引物的电泳结果。

图4为本发明实施例中QLC_20引物的电泳结果。

以下将结合具体实施例对本发明做进一步的阐述：

实施例中所用植物材料如下：

转录组测序所用样品采自贵州省黔东南苗族侗族自治州施秉县。

SSR扩增时DNA提取所用的青篱柴样品20个，编号1-20，分别来源于贵州省黔南布 依族苗族自治州的荔波、独山、平塘、惠水和长顺5个县(表1)。

表1、20份青篱柴实验材料采集信息

实施例：一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法，其步骤如下：

取贵州省黔东南州施秉县的青篱柴作为样品，将同一株青篱柴个体上的根、茎及 叶片组织分别用锡箔纸包裹作好标记，迅速放入液氮中，经消毒处理后，进行转录组测序。

采用全能型植物RNA提取试剂盒(OminiPlant RNA Kit)分别提取青篱柴根、茎和 叶片的总RNA，纯化分离总RNA中的mRNA，以mRNA为模板合成双链cDNA，双链cDNA进行末端修 复补平，加A尾并连接测序接头，最后进行PCR扩增，得到符合测序要求的文库，用Illumina HiSeqTM2000对扩增后的文库进行检测，使用Trinity软件组装测序数据得到Unigene。

分析不同类型SSR重复单元的重复次数分布，利用MISA软件对青篱柴转录组测序 后组装出的Unigene序列进行SSR位点检测和分析，筛选SSR位点，搜索设置为单核苷酸重复 至少10次，二核苷酸重复至少6次，三至六核苷酸重复至少5次；

采用Primer 3.0引物批量设计程序对SSR位点的两端序列进行引物设计，引物参 数设置为Tm55-64℃，上、下游引物的Tm值相差小于5℃，引物长度为18-27bp，产物大小为 10-300bp，GC含量为40％-60％，

利用植物基因组DNA提取试剂盒提取采自黔南布依族苗族自治州不同地理位置的 20份青篱柴幼嫩叶片样品DNA，其具体步骤如下：

(1)取超低温冰箱保存的0.5g植物叶片材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干；

(2)植物叶片材料剪成1cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中；

(3)加入液氮速冷，研磨成细粉(越细越好)；

(4)在5ml离心管中加入CTAB抽提缓冲液2.5ml，60℃水浴保温1小时；

(5)15000rpm，离心10分钟，上清液转入另一个新的离心管中；

(6)加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀抽提至水乳胶融状；

(7)15000rpm，离心10分钟；

(8)上清液转入另一个新的离心管中；

(9)加入2/3倍体积预冷异丙醇，-20℃保温30min-1hr，缓缓混匀DNA成絮状折出；

(10)15000rpm，离心10分钟，弃上清液；

(11)DNA沉淀用70％乙醇洗2次；

(12)加入400μl TE buffer溶解DNA，得到的DNA放-20℃保存待用。

根据引物设计原则，利用Primer Premier 5.0对已设计好的引物进行进一步筛 选，最终选取50对引物序列送至公司进行合成，SSR≥10bp，搜索设置为单核苷酸至少重复 10次，二核苷酸至少重复6次，三至六核苷酸至少重复5次；引物设计的参数标准为Tm55-64 ℃，上、下游引物的Tm值相差小于5℃，引物长度为18-27bp，产物大小为10-300bp，GC含量为 40％-60％，尽量避免出现引物二级结构；50对引物引物合成后进行PCR扩增，反应体系为 Template DNA(50ng/ul)1ul，2x Master Mix(Promega)10ul，Forward primer(10uM/ul) 0.5ul，Reverse primer(10uM/ul)0.5ul，dd H2O 2ul；反应过程中，94℃预变性5min，94℃ 变性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s，36次循环，再72℃延伸7min，得到扩增产物，放于4℃ 保存。

采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选多态性引物，实验前需要配制1L6％变性聚 丙烯酰胺凝胶，1L10xTBE缓冲液，50ulTEMED，1L10％过硫酸铵50ml0.5mol/LEDTA，1L硝酸银 染液，500ml显影液(10gNaOH、0.2g Na2CO3、2ml甲醛)放4℃待用，其电泳过程具体步骤如下：

(1)胶板的准备：使用蒸馏水清洗玻璃板以及梳子，晾干；用无水乙醇擦净干燥的 玻璃板，晾干；将有耳和无耳的玻璃板对贴于橡胶框中，并用夹子固定，水平放于桌面上；

(2)封胶：用1000ul微量移液吸取已溶解的3％琼脂糖，沿玻璃板边缘快速顺下 滴，将两面玻璃板充分封死，防止漏胶。靠近自己的一端垫高约2cm，静置30min，准备灌胶；

(3)灌胶：取50ml 6％胶储液，加入50ul TEMED原液和250ul 10％过硫酸铵溶液， 迅速震荡混匀。快速地将胶灌入两块玻璃板之间，等到胶液到达胶底部时，迅速水平放置 胶。将梳子反插入胶板之间，插梳子时两端平整，用力均匀，梳子紧贴玻璃板，插入约1cm(注 意不要带气泡)。在插入梳子数分钟内注意观察，防止漏胶，静置1小时以上，以便使胶液充 分凝固。整个灌胶过程应快速，防止胶液凝固；

(4)吹孔：向中间槽加入1×TBE缓冲液，要淹没过内玻璃板约1cm，然后平行用力地 拔出梳子，用200ul的微量移液进行吹孔，充分的清理点样槽，把小孔内从胶中析出的尿 素清理干净，加样过程中也要及时清理后面每个梳孔的尿素；

(5)加样：用10ul的微量移液按序向每个点样孔中加入5ul PCR产物，每加完一 次换头，首位各留1-2个孔，加DNA Marker；

(6)电泳：向两侧槽中加入1xTBE缓冲液至玻璃板中间位置即可，打开电源，然后稳 定电压400V电泳，至指示剂Loading Buffer的带移动至胶的底部(约2小时)，停止电泳，拆 下胶板；

(7)撬玻璃板：平行用力将梳子拔出，然后用小刀片伸入两玻璃板之间约1cm处，刀 片平行于玻璃板，稍用力，小心缓慢地将两块玻璃板分开，无凝胶的玻璃板及梳子放于水槽 中清洗，回收的琼脂糖胶回收放于三角瓶中以便下次重复利用，胶玻片放于医用瓷盘中，准 备银染；

(8)银染：取下带胶的玻璃板，用蒸馏水洗胶两次，轻轻晃动，每次清洗30s，加入事 先配制好的AgNO3溶液银染10min，用蒸馏水洗胶1min，加入显影液显15s，换用新的显影 液，等待10-15min直到显示出清晰的条带为止，用蒸馏水冲洗，贴上顺序标签，观察并拍照 记录，用保鲜膜将凝胶密封好放4℃冰箱保存，在50对引物中选出如下表2中8对多态性高能 稳定扩增的引物；

表2、8对多态性引物

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

本发明的一种基于转录测序获得青篱柴引物的方法，在高通量测序手段获得青篱 柴转录组序列的基础上，对所得序列使用MISA软件工具检测筛选SSR点，其最大的优点是方 发简单、快捷、费用低。利用SSR分子标记技术明确青篱柴的总体特点，开发青篱柴引物，为 利用SSR分子标记进行青篱柴种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基 础，从而更好地应用在分子育种中。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 贵州师范大学

<120> 一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法

<130> 2018LYW-53

<141> 2018-06-04

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

aaaaaccaca cgaaaccggc 20

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

tctttttcag acaaattttc ctcctct 27

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

aaaacactga caagcaatta aagac 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

ggttctcggt acaaaggagg a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

aaaccaccac aacccaccat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

catcggtacc gtacttgggg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

aaaccagctg aaaagcaggc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

tccacgttcg tgaccttcac 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

aaaccatttt aaaagaaacg cttca 25

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<211> 20

<212> DNA

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cctcatggga agccgagttt 20

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tcaacaacag cattggcagc 20

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<212> DNA

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ttttccctct tcgccttccc 20

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<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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tttgtccatt tgcaagccgc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 16

atccatgagg ctgcatcgag 20