新型烯二芳基脲类化合物,其制备方法及其用途

新型烯二芳基脲类化合物,其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及通式(I)脲类P38蛋白激酶的脲类化合物，含有它们的药物组合物，制备这些药物的方法及它们的医药用途。

技术背景

丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)是细胞内蛋白激酶的一种，属于丝氨酸/苏氨酸激酶系列，能够作为细胞内众多活化反应和功能反应的调节介质，参与基因表达、细胞增殖和死亡等众多的功能性过程。p38 MAPK信号通路是MAPK家族的重要组成成员，它的活化是众多前炎性因子和压力因素作用的结果，不仅在众多包括炎性细胞增殖分化和扩增的细胞内信号反馈过程中发挥着非常重要的作用，而且参与应激反应的过程。有许多相关的文献描述了p38 MAPK相关的性质和在疾病研究中的应用以及前景。

p38 MAPK原先被认为是通过细胞因子发挥抑制作用的抗炎药物的结合蛋白(CSBP)，首先在1993年由Han等在实验中发现，1994年由Han等首先在小鼠肝脏细胞中克隆了p38 MAPK的基因，它是编码由360个氨基酸组成的38KD的蛋白，在炎性细胞因子的生物合成过程中发挥重要的调节作用。

目前发现的p38 MAPK家族包含着四种类型：p38α，p38β，p38γand p38δ。不同p38 MAPK亚型在组织分布、上游激酶调节、下游作用底物以及对细胞外刺激的反应都各有不同，不同亚型的p38 MAPK在结构上也有着不同程度的相似性。p38α和p38β在各种体内组织中都有着广泛的表达，同时它们包含了74％相同的氨基酸序列，并且它们都是特异性表达的，p38γ与p38α有着64％的氨 基酸同源性，p38γ则主要在骨骼肌中表达，而p38δ则在小肠、肺组织、肾上腺、前列腺等处比较常见。由于p38α和β在身体各部位的分布比较广泛，因而针对p38MAPK的抑制剂主要是针对p38α和β的抑制。许多证据表明p38 MAPK途径在炎症疾病和癌症中表现出重要的作用。对p38 MAPK在这些相关疾病中的作用进行了总结，同时也表明了p38 MAPK的抑制剂具有作为手段的潜在价值。

我们创造性发明了全新的新型脲类化合物用作P38 MAPK抑制剂的研究，通过高通量筛选评价了这类化合物在体外对P38 MAPK通路的抑制作用。发现几乎所有实施例化合物细胞活性与P38α酶活性都优于文献公认的P38抑制剂BIRB-796，其中化合物实施例1和文献报道的阳性对照药BIRB-796比较，MAPKAPK2抑制活性增强近10倍，P38α蛋白亲和力明显优于P38抑制剂SB203580。

本发明报道的具有高活性的P38 MAPK小分子抑制剂，用以克服炎症、炎症相关疾病及肿瘤疾病的难题，特别是窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病，为这类疾病的临床提供新的医学策略。

本发明目的在于提供一类新型的脲类化合物作为用于炎症性和肿瘤物的用途。

发明内容

1.本发明涉及通式(I)化合物或其异构体的内容

其中：

Ar₁为C₆-C₁₀芳香碳环，包括但不限于苯环、取代苯环、环辛四烯等；或C₃-C₁₀饱和不饱的非芳香杂环，包括但不限于环戊烷、环己烷、环戊烯、环己烯、环己二烯；C₅-C₁₀的芳香杂环，包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于咪唑、吡唑、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡嗪、嘧啶、吲哚、喹啉等；或者C₅-C₈的单杂环或者C₈-C₁₁的双杂环，包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于四氢呋喃、四氢噻吩、等；其中Ar₁独立并选择性的被一到多个R¹，R²所取代；

Ar₂为苯基、取代苯基、苄基、杂环、取代杂环、苯并五元或六元杂环。当为五元杂环时，环上包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于呋喃、吡咯、噻吩、噁唑、噻唑、二氢吡咯、二氢吡唑、二氢噻唑、二氢恶唑；当为六元杂环时，环上有1-4个O，S，N的杂原子，包括但不限于吡喃、噻喃、嘧啶、噁唑、哌嗪、噁嗪、噻嗪、吗啉等；当为苯并五元环时，环上包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于苯并呋喃、苯并吡咯、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并噻唑、苯并二氢吡咯、苯并二氢吡唑、苯并二氢噻唑、苯并二氢恶唑；当为苯并六元环时，环上有1-4个O，S，N的杂原子，包括但不限于苯并吡喃、苯并噻喃、苯并嘧啶、苯并噁唑、苯并哌嗪、苯并噁嗪、苯并噻嗪、烯等；所述的Ar₂可选择性的被1-4个选自下面的取代基取代：C₁-C₆的直连或支链烷烃，C₂-C₆的直连或支链烯烃，C₁-C₆的直连或支链烷氧基，C₂-C₆的直连或支链烯氧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙酰基，芳酰基，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羟基，氨基，单或双C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

L独立的为

(1)键

(2)C₁-C₁₀饱和或不饱和的直连或支链碳链，其中的一到多个亚甲基独立且选择性的被O，N，S(O)_m或者0-2个羰基所替代；并且所述的连接基团可以被一到多个卤素原子取代；

m＝0，1，2

P为苯基，萘基，喹啉基，异喹啉基，吡啶基，嘧啶基，哒嗪基，咪唑基，噁唑基，异噁唑基，噻唑基，异噻唑基，吡咯基，苯并咪唑基，呋喃基，噻吩基，吡喃基，哌嗪基，吡唑基，噻唑基，嘌呤基，吡唑并嘧啶基，吡咯并吡啶基，三氮唑基，四氮唑基，四氢吡喃基，四氢呋喃基，二氢萘基，四氢萘基，二氢异喹啉基，四氢异喹啉基，苯并呋喃基，苯并吡喃基，苯并噻唑基，苯并吡唑基，苯并三氮唑基，苯并噻嗪基；上述的苯基，萘环或者杂环可以选择性的被0-5个下述基团取代：卤素，C₁-C₆的直连或支链烷基，C₂-C₆的直连或支链烯烃，C₁-C₆的直连或支链烷氧基，C₂-C₆的直连或支链烯氧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙酰基，芳酰基，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羟基，氨基，单或双C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

R¹独立的为

(1)C₁-C₁₀饱和的直连或支链烷烃，所述的烷基可部分或全部被卤素原子取代，并且可以选择性的被1-3个苯基，萘环或以下杂原子取代：喹啉基，异喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，异噻唑基；上述的苯基，萘环或者杂环可以选择性的被0-5个下述基团取代：卤素，C₁-C₆的直连或支链烷基，C₂-C₆的直连或支链烯烃，C₁-C₆的直连或支链烷氧基，C₂-C₆的直连或支链烯氧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧 基，乙酰基，芳酰基，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羟基，氨基，单或双C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

(2)C₃-C₁₀的环烷基和环烯基，所述基团可部分或全部被卤素取代，或选择性的被1-3个C₁-C₆的直连或支链烷基或C₁-C₆烷氧基取代；上述的环烷基或者环烯基的1-3个亚甲基可以选择性的被O，NH，S，SO，SO₂，羰基，羟甲基取代；上述的环烷基或者环烯基的0-5个以下基团取代：卤素，C₁-C₆的直连或支链烷基或C₁-C₆烷氧基；

(3)C₃-C₁₀不饱和的直连或支链烯基，所述的烷基可部分或全部被卤素取代，并且选择性的被1-3个C₁-C₆的直连或支链烷基，苯基，萘基或以下杂环取代：喹啉基，异喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，异噻唑基；上述的苯基，萘环或者杂环可以选择性的被0-5个下述基团取代：卤素，C₁-C₆的直连或支链烷基，C₂-C₆的直连或支链烯烃，C₁-C₆的直连或支链烷氧基，C₂-C₆的直连或支链烯氧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙酰基，芳酰基，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羟基，氨基，单或双C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

(4)卤素，硝基，羟基，氨基，羧基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，以及各种单取代或是双取代的氨基化合物；

(5)NH₂-，R³NH-，R³₂N-，R³NCO-，R³CONH-，R³COO-，R³OCO-，R³S(O)_m-，R³S(O)_mNH-，R³NHS(O)_m-；

m＝0，1，2

R²独立的为

(1)芳环，芳杂环基以及稠和芳环，包括苯基，萘基，喹啉基，异喹啉基， 嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，异噻唑基，嘌呤基，吲哚基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯并吡唑基，苯并噻吩基，苯并噁唑基，苯并异噁唑基，苯并噻唑基，苯并异噻唑基，吡唑并嘧啶，吡咯并吡啶，1，2，3三氮唑基，1，2，4三氮唑基，四氮唑基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，二氢萘基，四氢萘基，二氢喹啉基，四氢喹啉基，二氢异喹啉基，四氢异喹啉基，茚基，茚烯基。上述芳环，芳杂环或者稠和芳环可独立的被0-5个R⁴基团所取代；

(2)C₃-C₁₀的环烷基和环烯基，所述基团可部分或全部被卤素取代，或选择性的被1-3个C₁-C₆的直连或支链烷基或C₁-C₆烷氧基取代；上述的环烷基或者环烯基的1-3个亚甲基可以选择性的被O，NH，S，SO，SO₂，羰基，羟甲基取代；上述的环烷基或者环烯基的0-5个以下基团取代：卤素，C₁-C₆的直连或支链烷基或C₁-C₆烷氧基；

(3)C₁-C₁₀的直连或者支链烷烃，所述烷基可部分或者全部被卤素原子取代；

(4)NH₂-，R³NH-，R³₂N-，R³NCO-，R³CONH-，R³COO-，R³OCO-，R³S(O)_m-，R³S(O)_mNH-，R³NHS(O)_m-；

m＝0，1，2

R³独立的为

氢原子，C₁-C₆饱和的直连或支链烷烃，C₁-C₆不饱和的直连或支链烯烃，苯基，萘基，芳杂环基，喹啉基，异喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，异噻唑基；m为0，1，2；

R⁴独立的为

(1)卤素，硝基，羧基，氰基，羟基，C₁-C₆饱和的直连或支链烷烃，C₁-C₆不饱和的直连或支链烯烃，C₃-C₁₀环烷基，C₃-C₁₀环烯基，三氟甲基，三氟甲氧基，C₁-C₆饱和及不饱和的直连和支链烷氧基；

(2)NH₂-，R³NH-，R³₂N-，R³NCO-，R³CONH-，R³COO-，R³OCO-，R³S(O)_m-，R³S(O)_mNH-，R³NHS(O)_m-；

另一方面，本发明提供包含化合物通式(I)化合物药物的药用组合物，其含有至少一种通式(I)化合物或其可药用盐、溶剂化物，一级一种或多种药用载体或赋形剂。

另一方面，本发明还涉及制备通式(I)化合物或者其药用盐或溶剂化物的方法。

再一方面，本发明涉及通式(I)化合物用于或预防细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病的药用用途。

在又一方面，本发明提供通式(I)化合物用于或预防细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病，危险因子或病症的方法，包括给予有此需要的对象或是预防有效量的本发明化合物。本发明中所述的细胞因子(TNF-α，IL-1等)介导的疾病，危险因子或病症包括下列疾病：类风湿性关节炎，慢性肺阻塞，窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤，牛皮癣性关节炎，莱特尔氏综合征，痛风，骨关节炎，外伤性关节炎，急性滑膜炎，类风湿性脊柱炎，痛风性疾病和其他关节疾病，败血症，脓毒性休克，骨髓增生异常综合征，中毒性休克，脑性疟，脑膜炎，局部出血性中风，骨质疏松，充血性心力衰竭，冠状动脉旁路搭桥术，肾小球性肾炎，慢性肾衰竭，糖尿病，糖尿病性视网膜病，节 段性回肠炎，溃疡性结肠炎，肌肉退化，湿疹，接触性皮炎，牛皮癣，结膜炎，癌症的辅助等。

在本发明的一个实施方式中，本发明提供了通式(I)化合物及其药用盐或溶剂化物，

其中：

Ar₁为C₆-C₁₀芳香碳环，包括但不限于苯环、取代苯环、环辛四烯等；或C₃-C₁₀饱和不饱的非芳香杂环，包括但不限于环戊烷、环己烷、环戊烯、环己烯、环己二烯；C₅-C₁₀的芳香杂环，包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于咪唑、吡唑、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、吡嗪、嘧啶、吲哚、喹啉等；或者C₅-C₈的单杂环或者C₈-C₁₁的双杂环，包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于四氢呋喃、四氢噻吩、等；其中Ar₁独立并选择性的被一到多个R¹，R²所取代；

Ar₂为苯基、取代苯基、苄基、杂环、取代杂环、苯并五元或六元杂环。当为苯并五元环时，环上包括一到多个选自O，N，S的杂原子，包括但不限于苯并呋喃、苯并吡咯、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并噻唑、苯并二氢吡咯、苯并二氢吡唑、苯并二氢噻唑、苯并二氢恶唑；当为苯并六元环时，环上有1-4个O，S，N的杂原子，包括但不限于苯并吡喃、苯并噻喃、苯并嘧啶、苯并噁唑、苯并哌嗪、苯并噁嗪、苯并噻嗪、烯等；所述的Ar₂可选择性的被1-4个选自下面的取代基取代：C₁-C₆的直连或支链烷烃，C₂-C₆的直连或支链烯烃，C₁-C₆的直连或支链烷氧基，C₂-C₆的直连或支链烯氧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧基， 乙酰基，芳酰基，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羟基，氨基，单或双C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

L独立的为

(1)键

(2)C₁-C₁₀饱和或不饱和的直连或支链碳链，其中的一到多个亚甲基独立且选择性的被O，N，S(O)_m或者0-2个羰基所替代；并且所述的连接基团可以被一到多个卤素原子取代；

m＝0，1，2

P为苯基，萘基，喹啉基，异喹啉基，吡啶基，嘧啶基，哒嗪基，咪唑基，噁唑基，异噁唑基，噻唑基，异噻唑基，吡咯基，苯并咪唑基，呋喃基，噻吩基，吡喃基，哌嗪基，吡唑基，噻唑基，嘌呤基，吡唑并嘧啶基，吡咯并吡啶基，三氮唑基，四氮唑基，四氢吡喃基，四氢呋喃基，二氢萘基，四氢萘基，二氢异喹啉基，四氢异喹啉基，苯并呋喃基，苯并吡喃基，苯并噻唑基，苯并吡唑基，苯并三氮唑基，苯并噻嗪基；上述的苯基，萘环或者杂环可以选择性的被0-5个下述基团取代：卤素，C₁-C₆的直连或支链烷基，C₂-C₆的直连或支链烯烃，C₁-C₆的直连或支链烷氧基，C₂-C₆的直连或支链烯氧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙酰基，芳酰基，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羟基，氨基，单或双C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

R¹独立的为

(1)C₁-C₁₀饱和的直连或支链烷烃，所述的烷基可部分或全部被卤素原子取代。

(2)C₃-C₁₀的环烷基和环烯基，所述基团可部分或全部被卤素取代。

(3)C₃-C₁₀不饱和的直连或支链烯基，所述的烷基可部分或全部被卤素取代。

(4)卤素，硝基，羟基，氨基，羧基，氰基，三氟甲基，三氟甲氧基，以及各种单取代或是双取代的氨基化合物；

(5)NH₂-，R³NH-，R³₂N-，R³NCO-，R³CONH-，R³COO-，R³OCO-，R³S(O)_m-，R³S(O)_mNH-，R³NHS(O)_m-；

m＝0，1，2

R²独立的为

(1)芳环，芳杂环基以及稠和芳环取代；

(2)C₃-C₁₀的环烷基和环烯基，所述基团可部分或全部被卤素取代。

(3)C₁-C₁₀的直连或者支链烷烃，所述烷基可部分或者全部被卤素原子取代；

(4)NH₂-，R³NH-，R³₂N-，R³NCO-，R³CONH-，R³COO-，R³OCO-，R³S(O)_m-，R³S(O)_mNH-，R³NHS(O)_m-；

m＝0，1，2

R³独立的为

氢原子，C₁-C₆饱和的直连或支链烷烃，C₁-C₆不饱和的直连或支链烯烃，苯基，萘基，芳杂环基，喹啉基，异喹啉基，嘧啶基，吡嗪基，哌嗪基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，噻唑基，噁唑基，异噁唑基，异噻唑基；m为0，1，2；

R⁴独立的为

(1)卤素，硝基，羧基，氰基，羟基，C₁-C₆饱和的直连或支链烷烃，C₁-C₆ 不饱和的直连或支链烯烃，C₃-C₁₀环烷基，C_3-C₁₀环烯基，三氟甲基，三氟甲氧基，C₁-C₆饱和及不饱和的直连和支链烷氧基；

(2)NH₂-，R³NH-，R³₂N-，R³NCO-，R³CONH-，R³COO-，R³OCO-，R³S(O)_m-，R³S(O)_mNH-，R³NHS(O)_m-；

在本发明的一个优选实施方式中，本发明提供了通式(I)化合物及其药用盐或溶剂化物，

其中：

Ar₁为C₆-C₁₀芳香碳环，包括取代的3-叔丁基苯基吡唑，N-(5-叔丁基-2-甲氧基苯基)甲磺酰胺取代；

Ar₂为苯基、取代苯基、苄基，苯并六元环，苯并吡喃、苯并噻喃、苯并嘧啶、苯并噁唑、苯并哌嗪、苯并噁嗪、苯并噻嗪、烯等；所述的Ar₂可选择性的被1-4个选自下面的取代基取代：C₁-C₆的直连或支链烷烃，C_2-C₆的直连或支链烯烃，C₁-C₆的直连或支链烷氧基，C₂-C₆的直连或支链烯氧基，卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，乙酰基，芳酰基，甲氧羰基，乙氧羰基，苯磺酰基，羟基，氨基，单或双C₁-C₄取代的磺酰胺基，氰基，硝基；

L独立的为

(1)键

(2)C₁-C₁₀饱和或不饱和的直连或支链碳链，其中的一到多个亚甲基独立且选择性的被O，N，S(O)_m或者0-2个羰基所替代；

m＝0，1，2

P为苯基，吗啉基，苯并吡唑基，苯并三氮唑基，苯并噻嗪基；

本发明优选的化合物包括：

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(6-甲基吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基]脲

N-{3-{3-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧]苯基}脲}-5-叔丁基-2-甲氧基苯}甲基磺酰胺

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-(3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

4-{5-{3-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}脲}-3-叔丁基-1H-吡唑-1-基}苯基磺酰胺

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(3-甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(2-甲氧基-4-甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(4-溴苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(对甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(对硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

4-{5-{3-{5-[(1H-吡唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}脲}-3-叔丁基-1H-吡唑-1-基}苯磺酰胺

1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-(2-氧基-4-甲基苯)-1H-吡唑-5-基]脲

1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基]脲

1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

N-{5-叔丁基-2-甲氧基-3-{3-[5-(2-乙氧基吗啉)苯甲基]脲}苄基}甲基磺酰胺

1-[3-叔丁基-1-(6-甲基吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基]-3-[2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

1-[3-叔丁基-1-(5-氯-2-羟基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-[2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

1-[3-叔丁基-1-(2-甲氧基-4-甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-[2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

1-[3-叔丁基-1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-[2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

1-[3-叔丁基-1-(4-甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-[2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

4-{3-叔丁基-5-{3-[2-(2-乙氧基吗啉)苄基]脲}-1H-吡唑-1-基}苯磺酰胺

1-(3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-[2-(2-乙氧基吗啉)苄基]脲

以及其可药用盐或溶剂化物。

本发明提供了通式(I)化合物及其药用盐的制备方法。

R₁为苯环上单取代或多取代的基团

取代的苯肼A与氰基频那酮B于80℃乙醇回流8小时得到中间体C；1-叔丁基-4-甲氧基苯E与发烟硝酸在80℃冰醋酸中反应3小时的中间体F；中间体F与硫氢化钠在80℃乙醇溶液中回流3小时得中间体G；中间体G与甲磺酰氯在DMF溶液中反应12小时得到中间体H；中间体H与氢化铝锂在四氢呋喃溶液中反应1小时得到中间体I；中间体C，I通过与氯甲酸三氯乙酯在0℃四氢呋喃溶液中反应12小时得到中间体D，J。

邻氰基氟苯K与3-甲基-4-氨基苯酚L在90℃DMSO溶液中反应4小时得到中间体M；中间体M和亚硝酸异戊酯、乙酸酐在甲苯溶液中90℃回流反应8小时得到中间体N；中间体L在65℃四氢呋喃溶液中通过氢化铝锂还原1小时得到中间体0。

邻氰基氟苯Q与2-吗啉乙醇在DMF溶液中反应12小时得到中间体R；中间体R与氢化铝锂在65℃四氢呋喃溶液中反应1小时得到中间体S。

5-氟-2-硝基苯酚与溴丙炔在DMF溶液中反应12小时得到中间体2；中间体2与3-甲基-4-氨基苯酚在90℃DMSO溶液中反应4小时得到中间体3；中间体3与亚硝酸异戊酯在甲苯溶液中回流反应8小时得到中间体4；中间体4与氯化亚锡在乙醇溶液回流反应2小时得到中间体5，；中间体5与(BOC)₂在二氯甲烷溶液中反应得到中间体6；中间体6在二苯醚溶液中高温反应得到中间体7。

中间体D，J与中间体O，S，及中间体7在DMSO溶液中反应得到终产物 通式(I)化合物。

再一方面，本发明提供一种用于克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病药物组合物，其包含上述式I的化合物，或它们的异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，以及至少一种药学上可接受的载体。

再一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上述式I的化合物，或它们的异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，另外包含一种或多种克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病药物组合物，其包含上述式I的化合物，以及至少一种药学上可接受的载体。

再一方面，本发明提供上述式I的化合物，或它们的异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，它们用作克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病药物。

再一方面，本发明提供一种克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病及肿瘤性疾病的方法，其包括向该受试者给予有效量的上述式I的化合物，或它们的异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或N-氧化物，并且任选联合给予一种或多种其它抗炎药物。

再一方面，本发明提供上述式I的化合物或它们的异构体、药学上可 接受的盐、溶剂化物或N-氧化物在制备药物中的用途，其中所述药物用于克服炎症、炎症相关疾病、肿瘤及窒息性气体或刺激性气体造成的急性肺损伤疾病。

现将本申请说明书和权利要求书中出现的用于描述本发明的术语定义如下。对于特定的术语，如果本申请中定义的含义与本领域技术人员通常理解的含义不一致，则以本申请中定义的含义为准；如果在本申请中没有定义，则其具有本领域技术人员通常理解的含义。

本发明中使用的术语“烷基”是指直链或支链一价饱和烃基。“C₁-C₁₀烷基”是指具有1～10个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基、庚基和辛基等。术语“C₁-C₆烷基”意指具有1～6，即1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链烷基，典型地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基等。相似地，术语“C₁-C₃烷基”意指具有1、2或3个碳原子的直链或支链烷基，即甲基、乙基、正丙基和异丙基。本发明中的烷基优选是C₁-C₆烷基，更优选是C₁-C₃烷基。

本发明中使用的术语“卤素”是指氟、氯、溴以及碘原子。

本发明中使用的术语“芳香基”是指包含至少一个不饱和芳环的任选被取代的单环或二环烃环系统，优选具有6～10，即6、7、8、9或10个碳原子的芳基。本发明中的芳香基的实例包括苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、吲哚基和茚基等。本发明中的芳香基可以被以下基团取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、卤素、羟基、氨基、硝基、单(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆卤代烷基或C₁-C₆卤代烷氧基。

本发明中使用的术语“芳香杂环基”是指包含至少一个独立地选自N、O或S的杂原子的任选被取代的单环或双环不饱和芳环系统，优选具有5～10， 即5、6、7、8、9或10个原子的芳香杂环基。“芳香杂环基”的实例包括但不限于噻吩基、吡啶基、噻唑基、异噻唑基、呋喃基、吡咯基、三唑基、咪唑基、三嗪基、噁二唑基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、咪唑酮基、噁唑、噻唑酮基、四唑基、噻二唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、四氢三唑并吡啶基、四氢三唑并嘧啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、硫茚基、吲哚基、异吲哚基、吡啶酮基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、喹啉基、酞嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、咪唑并吡啶基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并哒嗪基、噁唑并哒嗪基、噻唑并哒嗪基、蝶啶基、呋咱基、苯并三唑基、吡唑并吡啶基和嘌呤基等。本发明中的杂芳基可以被以下基团取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、卤素、羟基、氨基、硝基、单(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆卤代烷基或C₁-C₆卤代烷氧基。

本发明中使用的术语“环烷基”是指3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的饱和碳环基团。该环烷基可以是单环或者多环稠合系统，而且可以稠合在芳环上。这些基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基等。本文的环烷基可以是未取代的，或者在一个或多个可取代的位置被合适的基团取代。例如，本发明中的环烷基可任选被以下基团取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、腈基、卤素、羟基、氨基、硝基、单(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆卤代烷基或C₁-C₆卤代烷氧基。

本发明中使用的术语“杂环基”是指包含至少一个和最多四个独立地选自N、O或S的杂原子的任选被取代的单环和双环饱和、部分饱和或不饱和的环状系统，优选具有4～10，即4、5、6、7、8、9或10个原子的5、6或7元杂环基，条件是该杂环基的环不含两个相邻的O或S原子。优选的杂环基包括但不限于吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、基、吗啉基或哌嗪基等。本发明中的杂环基可以被以下基团取代：C₁-C₆烷基、 C₁-C₆烷氧基、腈基、卤素、羟基、氨基、硝基、单(C₁-C₆)烷基氨基、二(C₁-C₆)烷基氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆卤代烷基或C₁-C₆卤代烷氧基。

本发明中使用的术语“芳基烷基”是指被一个或多个如上定义的芳基取代的如上定义的烷基。优选的芳基烷基是芳基-C₁-C₃烷基。本发明中的芳基烷基的实例包括苄基和苯基乙基等。

本发明中使用的术语“芳香杂环基烷基”是指被如上定义的芳香杂环基取代的如上定义的烷基。更优选的芳香杂环基烷基是5-或6-元杂芳基-C₁-C₃-烷基。本发明中的杂芳基烷基的实例包括吡啶基乙基等。

本发明中使用的术语“杂环基烷基”是指被如上定义的杂环基取代的如上定义的烷基。更优选的杂环基烷基是5或6元杂环基-C₁-C₃-烷基。本发明中的杂环基烷基的实例包括四氢吡喃基甲基。

本发明中使用的术语“药学上可接受的盐”意指在制药上可接受的并且具有母体化合物的所需药理学活性的本发明化合物的盐。这类盐包括：与无机酸或与有机酸形成的酸加成的盐，所述的无机酸诸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；所述的有机酸诸如乙酸，丙酸，己酸，环戊丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，萘磺酸，樟脑磺酸，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，羟基萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，粘康酸等；或在母体化合物上存在的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子或碱土金属离子取代时形成的盐；或与有机碱形成的配位化合物，所述的有机碱诸如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，N-甲基葡糖胺等。

本发明中使用的术语“溶剂化物”意指本发明化合物与制药上可接受的溶剂结合形成的物质。制药上可接受的溶剂包括水，乙醇，乙酸等。溶剂化物包括化学计算量的溶剂合物和非化学计算量的溶剂合物，优选为水合物。 本发明的化合物可以用水或各种有机溶剂结晶或重结晶，在这种情况下，可能形成各种溶剂化物。

本发明的药物组合物包括有效剂量的本发明式式I化合物或其异构体、药学上可接受的盐或水合物和一种或多种适宜的药学上可接受的载体。这里的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着剂。

当局部用药时，特别是局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，可根据不同的患面或器官将本发明化合物制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：

当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不 加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温60，十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

具体实施方式

下面的具体实施例是本发明的优选实施方案，其不应理解为对本发明构成任何限制。

化合物的熔点由RY-1熔点仪测定，温度计未较正。质谱由Micromass ZabSpec高分辨率质谱仪(分辨率1000)测定。¹H NMR由JNM-ECA-400超导NMR仪测定，工作频率¹H NMR 400MHz，¹³C NMR 100MHz。

实施例

实施例 1 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(6-甲基吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基]脲

在250mL茄型瓶中加入100mL乙醇，(30mmol)特戊酰基乙腈，(33.63mmol)2-甲基-5-吡啶肼，搅拌下滴加3.6mL浓盐酸，加热回流8小时，冷却，浓缩，残余物用稀氢氧化钠调pH 10-11，用乙酸乙酯提取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到的固体用乙酸乙酯/石油醚重结晶得到白晶体C，收率80％。3-叔丁基-2-(4-甲基吡啶基)-5-氨基吡唑(3.5mmolC)置于100ml三颈瓶中，以30ml四氢呋喃溶解，将三颈瓶置于低温槽降温至-20℃，搅拌下分批加入2.9g碳酸氢钠，15min后，逐滴滴加氯甲酸三氯乙酯(3.5mmol)，控制溶液温度不超过0℃，滴加完毕后，继续搅拌30min，然后升温至0℃反应12h.反应完毕，混合物过滤，滤渣用乙酸乙酯冲洗，滤液浓缩，收率83％。

7.9g 2-氟-苯睛K溶于50ml DMSO中，分批加入27g碳酸钾。混合液室温搅拌30min。称取4.78g3-甲基-4-氨基苯酚L加入反应液，将混合液加热至90℃，反应12h。反应毕。反应液倒入200ml冰水，置于冰箱中，3h后，取出，有黄固体M析出，过滤，干燥。收率93％。0.8g 2-(4-胺-3-甲基苯氧基)苯腈M溶于30ml无水甲苯，依次加入1.14g和0.3g乙酸钠。混合液置于油浴中，加热至80℃，逐滴加入0.6g亚硝酸异戊酯，反应8h，反应完毕，反应液过滤，浓缩，以柱层析分离产物N，收率80％。称取0.35g四氢锂铝加入15ml无水四氢呋喃中，反应瓶置于冰浴中，称取0.8g 2-((1-乙酰基-1H-吲唑-5-基)氧基)苯腈N溶10ml无水四氢呋喃，溶液逐滴滴入四氢锂铝的混悬 液，滴加完毕后，65℃回流搅拌1h。反应毕，混合液中加入乙醇至无气泡产生，过滤，浓缩，以柱层析分离产物O，产率73％。

在50mL三口瓶中加入20mL二甲亚砜，加入化合物0.5mmol2，2，2-三氯乙基-(3-叔丁基-1-(4-甲基吡啶基)-1H-吡唑-5-基)酰胺D，再加入化合物2-((1H-吲唑-5-基)氧基)苯甲胺0.5mmol，滴加0.5ml三乙胺入反应，加热80℃反应1小时。冷却，倒入150ml水中，用乙酸乙酯提取3次，有机层用饱和氯化钠洗涤3次，无水硫酸钠干燥过夜，浓缩，柱层析分离产物，产率58％。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.24(s，1H，)，8.83(s，1H)，8.59(s，1H)，7.99(s，1H)，7.82(d，1H，J＝8.8)，7.57(d，1H，J＝8.8)，7.35(d，1H，J＝8.0)，7.25(m，4H)，7.10(m，4H)，6.73(d，1H，J＝8)，6.23(s，1H)，4.30(d，2H，J＝5.6)，1.25(s，12H)。(M+H)+：496.Mp：118-120℃。

实施例 2 N-{3-{3-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧]苯基}脲}-5-叔丁基-2-甲氧基苯}甲基磺酰胺

5.6g 1-叔丁基-4-甲氧基苯置于50ml三颈瓶中，将三颈瓶置于冰浴中，取17.5ml浓硝酸和浓硫酸的混合物(1∶1.5)，逐滴加入三颈瓶，控制瓶内温度不超过50℃，滴毕后，将三颈瓶置于油浴锅加热至55℃，反应三小时，然后滴加另一浓硝酸和浓硫酸的混合液14ml(1∶1)，滴加完毕后，加热至90℃，反应三小时。反应完毕，混合液倒入约100ml冰水中，用氢氧化钠饱和液调节PH至中性，然后以乙酸乙酯50ml×3提取，提取液加入无水硫酸钠干燥，然后 浓缩，拌样过柱，产率70％。1.27g 5-叔丁基-2-甲氧基-1，3-二硝基苯溶于盛20ml甲醇的100ml茄形瓶中，加热至回流，然后将新制备的硫氢化钠溶液加入反应瓶，反应三小时。反应毕，混合液浓缩后，用乙酸乙酯提取混合液，提取液用无水硫酸钠干燥，然后，柱谱分离得产物，收率95％。2.24g 5-叔丁基-2-甲氧基-3-硝基苯胺置于50ml三颈瓶中，用10ml无水甲苯溶解，溶液中加入处理过的3ml吡啶，室温搅拌15min，然后逐滴加入1.3g甲磺酰氯，确保溶液温度不高于35℃.滴加完毕后，室温反应16h。反应毕，混合液中加入100ml水，10ml稀盐酸，混合均匀后，分离有机层，用饱和氯化钠溶液和水各洗两次，有机层中加入正庚烷25ml，然后将混合液置于冰箱中，有白晶体析出，过滤，用正庚烷洗滤饼，得产物，收率80％。5.0g N-(5-叔丁基-2-甲氧基-三硝基苯)甲磺酰胺加入250ml茄形瓶中，加入50ml乙酸乙酯溶解，然后加入50ml乙醇和15g氯化亚锡，将茄形瓶置于油浴中加热至回流，反应2h.反应毕，反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液，有气泡以及沉淀产生，至不再有气体产生，过滤，滤液用乙酸乙酯提取三次，干燥、浓缩，产率45％。0.68g N-(3-氨基-5-叔丁基-2-甲氧基苯基)甲磺酰胺置于100ml三颈瓶中，溶于30ml四氢呋喃，将三颈瓶置于低温槽降温至-20℃，搅拌下分批加入2.1g碳酸氢钠，15min后，逐滴滴加0.63g氯甲酸三氯乙酯，控制溶液温度不超过-15℃，滴加完毕后，继续搅拌30min，然后升温至0℃反应24h.反应完毕，混合物过滤，滤渣用乙酸乙酯冲洗，滤液浓缩，拌样过柱，收率85％。

采用实施例1的方法，将其中的2，2，2-三氯乙基-(3-叔丁基-1-(4-甲基吡啶基)-1H-吡唑-5-基)酰胺改为上述的2，2，2-三氯乙基(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲磺酰胺)苯基)酰胺，得到白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

9.06(s，1H)，8.85(s，1H)，8.39(s，1H)，8.04(d，J＝2.0，1H)，7.76(d，1H，J＝9.2)，6.96(d，1H，J＝2.4)，6.58(d，1H，J＝10.0)，6.49(d，1H，J＝9.2)，5.72(d，1H，J＝10.0)，4.05(t，2H，J＝6.0)，3.70(s，3H)，3.57(t，4H，J＝4.8)，3.06(s，3H)，2.69(t，2H，J＝6.0)，1.42(s，6H)，1.24(s，9H)MS：538(M+H)，560(M+Na).Mp：112-114℃。

实施例 3 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-(3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.09(s，1H，)，8.30(s，1H)，7.99(s，1H)，7.57(d，1H，J＝8.8)，7.48(m，4H)，7.39(m，1H)，7.26(m，3H)，7.10(m，2H)，6.94(t，1H，J＝5.6)，6.75(d，2H，J＝8.4)，4.32(m，2H)，1.27(s，9H)。(M+H)+：481.Mp：86-88℃。

实施例 4 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为4-甲氧基苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.10(s，1H，)，7.99(s，1H)，7.62(s，1H，)，7.56(d，1H，J＝8.8)，7.29(d，2H，J＝8.0)，7.21(m，5H)，7.07(m，3H)，6.72(d，1H，J＝8.0)，6.59(t，1H，J＝5.6)，4.24(d，2H，J＝5.6)，2.38(s，3H)，1.32(s，9H)。(M+H)+：510.Mp：259-260℃。

实施例 5 4-{5-{3-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}脲}-3-叔丁基-1H-吡唑-1-基}苯基磺酰胺

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为磺酰胺基苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.10(s，1H，)，8.49(s，1H)，8.00(s，1H，)，7.92(d，1H，J＝8.8)，7.71(d，2H，J＝8.8)，7.59(d，1H，J＝8.8)，7.47(s，2H)，7.29(m，3H)，7.13(m，2H)，6.99(m，1H)，6.77(d，1H，J＝6.4)，6.36(s，1H)，4.34(d，2H，J＝5.6)，1.27(s，9H)。(M+H)+：560.Mp：146-148℃。

实施例 6 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(3-甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为间甲基苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.11(s，1H，)，8.30(s，1H)，7.99(s，1H，)，7.57(d，1H，J＝8.8)，7.36(m，1H)，7.25(m，6H)，7.11(m，2H)，6.97(t，1H，J＝5.6)，6.74(d，1H，J＝8)，6.25(s，1H)，4.31(d，2H，J＝5.6)，2.46(s，3H)，1.24(s，9H)。(M+H)+：495.Mp：94-96℃。

实施例 7 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(2-甲氧基-4-甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为2-甲氧基-4-甲基苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.09(s，1H，)，8.23(s，1H)，7.99(s，1H，)，7.57(d，1H，J＝8.8)，7.34(m，3H)，7.25(m，4H)，7.10(m，2H)，6.93(t，1H，J＝5.6)，6.74(d，1H，J＝8)，6.23(s，1H)，4.31(d，2H，J＝5.6)，2.35(s，3H)，1.25(s，12H)。(M+H)+：525.Mp：116-118℃。

实施例 8 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为4-氯苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.10(s，1H，)，8.34(s，1H)，7.99(s，1H，)，7.57(d，1H，J＝8.8)，7.51(m，4H)，7.25(m，3H)，7.10(m，2H)，6.91(t，1H，J＝6.4)，6.75(d，1H，J＝8)，6.25(s，1H)，4.31(d，2H，J＝6)，1.25(s，12H)。(M+H)+：515.Mp：134-136℃。

实施例 9 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(4-溴苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为4-溴苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.13(s，1H，)，8.38(s，1H)，8.00(s，1H，)，7.66(d，2H，J＝8.4)，7.58(d，1H，J ＝8.8)，7.25(m，3H)，7.11(m，2H)，6.94(t，1H，J＝5.6)，6.74(d，1H，J＝8)，6.27(s，1H)，4.31(d，2H，J＝5.6)，1.25(s，12H)。(M+H)+：561.Mp：109-111℃。

实施例 10 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为4-氟苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.12(s，1H，)，8.31(s，1H)，8.00(s，1H，)，7.58(d，1H，J＝8.8)，7.51(m，2H)，7.25(m，5H)，7.10(m，2H)，6.93(t，1H，J＝5.6)，6.74(d，1H，J＝8)，6.25(s，1H)，4.31(d，2H，J＝5.6)，1.25(s，12H)。(M+H)+：499.Mp：108-110℃。

实施例 11 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(对甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为4-甲基苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.13(s，1H，)，8.22(s，1H)，8.01(s，1H，)，7.58(d，1H，J＝8.8)，7.37(m，2H)，7.25(m，3H)，7.06(m，4H)，6.95(t，1H，J＝5.6)，6.75(d，1H，J＝8)，6.23(s，1H)，4.31(d，2H，J＝5.6)，3.80(s，3H)，1.25(s，9H)。(M+H)+：495.Mp：91-93℃。

实施例 12 1-{2-[(1H-吲唑-5-基)氧基]苄基}-3-[3-叔丁基-1-(对硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例1的方法，将其中的2-甲基-5-吡啶肼改为4-硝基苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.12(s，1H，)，8.62(s，1H)，8.31(d，2H，J＝8.8)，8.00(s，1H，)，7.83(d，2H，J＝8.8)，7.57(d，1H，J＝8.8)，7.26(m，3H)，7.08(m，3H)，6.74(d，1H，J＝8)，6.32(s，1H)，4.31(d，2H，J＝5.6)，1.26(s，9H)。(M+H)+：526.Mp：128-130℃。

实施例 13 4-{5-{3-{5-[(1H-吡唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}脲}-3-叔丁基-1H-吡唑-1-基}苯磺酰胺

采用实施例1的方法，6.7g5-氟-2-硝基苯酚溶于60ml DMF，加入8.3g碳酸钾剧烈搅拌，冰浴中，滴加8g 3-溴丙炔，滴加完毕，常温反应12h。反应毕，将混合液倒入200ml冰水中，有黄固体析出，将混合液放入冰箱，2h后，取出，过滤，得到黄固体，收率97％。1.95g4-氟-2-(2-丙炔-1-氧基)-硝基苯溶于40ml DMF，称取4g碳酸钾加入瓶中，室温搅拌约30min，称取1.53g 3-甲基-4-硝基苯酚加入瓶中，将反应瓶置于油浴中加热至100℃，反应3h.反应毕，冷却，反应液加入100ml水，以乙酸乙酯提取三次，提取液水洗、干燥、浓缩，收率90％。1.6g 2-甲基-1-硝基-4-(4-硝基-3-(2-丙炔-1-氧基)苯氧基)苯置于150ml茄形瓶，加入20ml甲醇溶解，溶液加热至回流，加入新制备的硫氢化钠溶液，回流反应3小时。反应毕，冷却，乙酸乙酯提取反应液，提取液干燥、浓缩，以柱层析分离产物，收率75％。0.8g 2-甲基-4-(4-硝基-3-(2-丙炔-1-氧基)苯氧基)胺置于100ml茄形瓶中，以20ml无水甲苯溶解，依次加入1.14g和0.3g乙酸钠。混合液置于油浴中，加热至80℃，逐滴加入0.6g亚硝酸异戊酯，反应18h，反应毕，反应液过滤，浓缩，以柱层析分离产物，收率80％。2.0g 5-(4-硝基-3-(2-丙炔-1-氧基)苯氧基-1H-吲唑溶于盛40ml乙酸乙酯的250ml茄形瓶中，分别加入40ml乙醇和4.5g氯化亚锡，将茄形瓶置于油浴中，加热至回流，反应6h。反应毕，反应液中加入 饱和碳酸氢钠至不再有气泡产生，过滤，滤液用乙酸乙酯提取，提取液干燥，浓缩。收率54％。2g 4-((1H-吲唑-5-基)氧基)-2-(2-丙炔-1-氧基)苯胺置于100ml茄形瓶，溶于25ml二氯甲烷，茄形瓶置于低温槽中，降温至-10℃，滴加3ml三乙胺，取3.9g(BOC)₂O分批加入反应瓶中，保持反应液温度-10℃以下，反应48h。反应毕，反应液水洗，干燥，柱层析分离产物，收率92％。1.6g N-(4-((1H-吲唑-5-基)氧基)-2-(2-丙炔-1-氧基)苯基)-O-叔丁基氧胺溶于20ml二苯醚，反应液加热至195-200℃，反应3h。反应毕，减压蒸馏除去二苯醚，剩余物乙酸乙酯溶解，以柱层析分离产物，收率30％。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.08(s，1H，)，9.14(s，1H)，8.52(s，1H)，7.99(m，3H)，7.86(d，1H，J＝8.8)，7.73(d，2H，J＝8.8)，7.54(m，3H)，7.17(s，1H)，7.10(dd，1H，J＝2.4，8.8)，6.62(d，1H，J＝10.0)，6.41(m，2H)，5.93(m，1H)，4.87(d，2H，J＝1.6)，1.24(s，9H).(M+H)+：600.Mp：171-173℃。

实施例 14 1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-(2-甲氧基-4-甲基苯)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例13的方法，将其中的4-磺酰胺基苯肼改为4-甲基苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.07(s，1H，)，8.92(s，1H)，8.51(s，1H)，7.97(s，1H)，7.87(d，1H，J＝8.8)，7.54(d，2H，J＝8.8)，7.37(m，4H)，7.17(d，1H，J＝2.4)，7.11(dd，1H，J＝2.4，8.8)，6.61(m，1H)，6.38(s，1H)，6.34(d，1H，J＝8.8)，5.93(m，1H)，4.85(d，2H，J＝1.6)，2.36(s，3H)，1.24(s，9H).(M+H)+：565.Mp：220-222℃。

实施例 15 1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例13的方法，将其中的4-磺酰胺基苯肼改为4-氟苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.07(s，1H，)，8.95(s，1H)，8.46(s，1H)，7.97(s，1H)，7.86(d，1H，J＝8.8)，7.53(m，3H)，7.38(m，2H)，7.17(d，1H，J＝2.4)，7.11(dd，1H，J＝2.4，8.8)，6.61(m，1H)，6.39(s，1H)，6.35(d，1H，J＝8.8)，5.92(m，1H)，4.85(d，2H，J＝1.6)，1.24(s，9H)。(M+H)+：539.Mp：233-235℃。

实施例 16 1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例13的方法，将其中的4-磺酰胺基苯肼改为苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.07(s，1H，)，8.99(s，1H)，8.51(s，1H)，7.97(s，1H)，7.86(d，1H，J＝8.8)，7.53(m，5H)，7.41(m，1H)，7.16(d，1H，J＝2.4)，7.12(dd，1H，J＝2.4，8.8)，6.61(m，1H)，6.39(s，1H)，6.36(d，1H，J＝8.8)，5.93(m，1H)，4.85(d，2H，J＝1.6)，1.24(s，9H).(M+H)+：535。Mp：202-204℃。

实施例 17 1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-(4-硝基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例13的方法，将其中的4-磺酰胺基苯肼改为4-硝基苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.03(s，1H，)，9.15(s，1H)，8.43(s，1H)，8.35(dd，1H，J＝2.0，6.8)，7.93(s，1H)，7.81(m，3H)，7.50(d，1H，J＝8.8)7.12(d，1H，J＝2.0)，7.06(dd，1H，J＝2.0，8.8)，6.58(m，1H)，6.40(s，1H)，6.34(d，1H，J＝8.8)，5.90(m，1H)，4.84(d，2H，J＝1.6) ，1.24(s，9H).(M+H)+：565.Mp：177-180℃。

实施例 18 1-{5-[(1H-吲唑-4-基)氧基]-2H-烯-8-基}-3-[3-叔丁基-1-(4-甲氧基苯基)-1H-吡唑-5-基]脲

采用实施例13的方法，将其中的4-磺酰胺基苯肼改为4-甲氧基苯肼，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

13.06(s，1H，)，8.22(s，1H)，7.96(s，1H)，7.86(t，2H，J＝2.0，8.8)，7.71(s，1H)，7.53(d，1H，J＝8.8)，7.33(d，2H，J＝8.0)，7.25(d，3H，J＝8.0)，6.58(m，1H)，6.38(d，1H，J＝8.8)，5.88(m，1H)，4.84(d，2H，J＝1.6)，2.41(s，3H)，1.24(s，9H).(M+H)+：550.Mp：224-226℃。

实施例 19 N-{5-叔丁基-2-甲氧基-3-{3-[5-(2-乙氧基吗啉)苯甲基]脲}苄基}甲基磺酰胺

取4.2g 2-吗啉乙醇溶于50ml DMF，称取3g氢化钠分批加入溶液中，待无气泡产生，将反应瓶置于低温槽，降温至-35℃以下。称取3.6g邻氟苯腈溶于5ml DMF中，逐滴加入反应瓶，控制温度。滴加完毕后，反应12h。反 应毕，反应液倒入200ml水中，以乙酸乙酯提取，提取液干燥、浓缩，柱层析分离产物。收率64％。称取1.5g四氢锂铝分批加入盛40ml四氢呋喃的150ml茄形瓶中，将茄形瓶置于冰浴中。取2-(2-吗啉乙氧基)苯腈溶于15ml四氢呋喃，逐滴加入反应瓶中，剧烈搅拌。滴加完毕后，将茄形瓶置于油浴中，加热至回流。反应1h。反应毕，将反应液倒入200ml冰水中，过滤，滤液以乙酸乙酯提取，提取液干燥、浓缩，柱层析分离产物，收率82％。在50mL三口瓶中加入20mL二甲亚砜，加入化合物0.5mmol，再加入化合物2，2，2-三氯乙基(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲磺酰胺)苯基)酰胺，2-(2-吗啉乙氧基)苯胺0.5mmol，滴加0.5mL Et₃N。加热至70℃反应3小时。冷却，倒入150mL水中，用乙酸乙酯提取3次，有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离产物。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

9.06(s，1H)，8.17(s，1H)，8.11(d，J＝4.0，1H)，7.25(m，2H)，7.08(m，1H)，7.00(d，1H，J＝8.0)，6.92(m，2H)，4.27(d，2H，J＝5.6)，4.12(t，2H，J＝6.0)，3.68(s，3H)，3.55(t，4H，J＝4.8)，3.03(s，3H)，2.74(t，2H，J＝6.0)，2.49(t，4H，J＝4.8)，1.24(s，9H)。MS：534(M+H)，556(M+Na)。Mp：171-173℃。

实施例 20 1-[3-叔丁基-1-(6-甲基吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基]-3-[2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

采用实施例19的方法，将其中的2，2，2-三氯乙基(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲磺酰胺)苯基)酰胺改为2，2，2-三氯乙基-(3-叔丁基-1-(4-甲基吡啶基)-1H-吡唑-5-基)酰胺，得白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

8.50(s，1H)，8.28(s，1H)，7.71(dd，1H，J＝2.4，J＝8.0)，7.31(d，1H，J＝8.0)，7.15(t，1H，J＝8.0)，7.03(d，1H，J＝7.2)，6.91(d，1H，J＝8.0)，6.82(t，1H，J＝7.2)，6.66(t，1H，J＝5.6)，6.22(s，1H)，4.30(t，2H，J＝6.0)，3.55(t，4H，J＝4.8)，3.18(t，2H，J＝6.0)，2.49(t，4H，J＝4.8)，1.25(s，9H)。(M+H)+：525.Mp：159-161℃。

实施例 21 1-[3-叔丁基-1-(5-氯-2-羟基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-[2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

采用实施例20的方法，将其中2-甲基-5-吡啶肼改为5-氯-2-羟基苯肼，得到白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

10.39(s，1H)，7.97(s，1H)，7.35(dd，1H，J＝2.8，J＝8.8)，7.25(d，1H，J＝2.4)，7.21(m，1H)，7.13(d，1H，J＝6.0)，7.03(d，1H，J＝8.8)，6.97(d，1H，J＝8.0)，6.86(m，1H)，6.25(s，1H)，4.19(d，2H，J＝5.6)，4.10(t，2H，J＝5.6)，3.54(t，4H，J＝4.8)，2.76(t，2H，J＝6.0)，2.49(t，4H，J＝4.8)，1.23(s，9H)。(M+H)+：528.Mp：166-168℃。

实施例 22 1-[3-叔丁基-1-(2-甲氧基-4-甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3- [2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

采用实施例20的方法，将其中2-甲基-5-吡啶肼改为2-甲氧基-4-甲基苯肼，得到白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

8.22(s，1H，)，7.34(d，2H，J＝8)，7.28(d，2H，J＝8)，7.21(m，1H，)，7.11(d，1H，J＝1.6)，6.97(d，1H，J＝8)，6.89(m，1H)，6.75(m，1H)，6.26(s，1H)，4.20(d，2H，J＝5.6)，4.09(t，2H，J＝5.6)，3.55(t，4H，J＝4.8)，2.70(t，2H，J＝5.6)，2.49(t，4H，J＝5.6)2.36(s，3H)，1.26(s，12H).(M+H)+：521.Mp：76-78℃。

实施例 23 1-[3-叔丁基-1-(4-氯苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-[2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

采用实施例20的方法，将其中2-甲基-5-吡啶肼改为4-氯苯肼，得到白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

8.32(s，1H，)，7.53(m，4H)，7.21(m，1H)，7.10(dd，1H，J＝1.6，8.0)，6.98(d，1 H，J＝8.0)，6.89(m，1H)，6.73(t，1H，J＝5.6)，6.27(s，1H)，4.19(d，2H，J＝5.6)，4.09(t，2H，J＝5.6)，3.55(t，4H，J＝4.8)，2.70(t，2H，J＝5.6)，2.50(t，4H，J＝4.0)，1.25(s，12H)。(M+H)+：511.Mp：134-137℃。

实施例 24 1-[3-叔丁基-1-(4-甲基苯基)-1H-吡唑-5-基]-3-[2-(乙氧基吗啉)苄基]脲

采用实施例20的方法，将其中2-甲基-5-吡啶肼改为4-甲基苯肼，得到白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

8.17(s，1H，)，7.35(d，2H，J＝8.8)，7.21(m，1H)，7.11(d，1H，J＝8.0)，7.03(d，2H，J＝8.8)，6.98(d，1H，J＝8.0)，6.89(t，1HJ＝7.6)，6.74(t，1H，J＝5.6)，6.24(s，1H)，4.20(d，2H，J＝5.6)，4.09(t，2H，J＝5.6)，3.8(s，3H)，3.55(t，4H，J＝4.8)，2.71(t，2H，J＝5.6)，2.50(t，4H，J＝5.6)，1.24(s，12H).(M+H)+：491.Mp：74-77℃。

实施例 25 4-{3-叔丁基-5-{3-[2-(2-乙氧基吗啉)苄基]脲}-1H-吡唑-1-基}苯磺酰胺

采用实施例20的方法，将其中2-甲基-5-吡啶肼改为4-磺酰胺基苯肼，得到白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

8.46(s，1H，)，7.90(d，2H，J＝8.0)，7.69(d，2H，J＝8.0)，7.48(s，2H)，7.22(m，1H)，7.12(d，1H，J＝6.4)，6.98(d，1HJ＝8.0)，6.91(t，1H，J＝8.0)，6.78(m，1H，J＝5.6)，4.20(d，2H，J＝5.6)，4.10(t，2H，J＝5.6)，3.55(t，4H，J＝4.8)，2.71(t，2H，J＝5.6)，2.50(t，4H，J＝5.6)，1.26(s，9H).(M+H)+：556.Mp：198-200℃。

实施例 26 1-(3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-[2-(2-乙氧基吗啉)苄基]脲

采用实施例20的方法，将其中2-甲基-5-吡啶肼改为苯肼，得到白固体。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

8.29(s，1H，)，7.48(m，4H)，7.40(m，1H)，7.21(m，1H)，6.98(d，1H，J＝8.0)，6.89(t，1H，J＝7.6)，6.76(t，1H，J＝5.6)，6.28(s，1H)，4.20(d，2H，J＝5.6)，4.09(t，2H，J＝5.6)，3.55(t，4H，J＝4.8)，2.70(t，2H，J＝5.6)，2.50(t，4H，J＝5.6)，1.25(s，9 H).(M+H)+：491.Mp：74-77℃。

实施例 27 采用GFP-MAPKAPk2_BHK细胞模型筛选p38-MAPK抑制剂

实验材料与方法

仪器：IN Cell Analyzer 1000活细胞成像系统(美国GE公司)

细胞株：表达GFP-MAPKAPk2融合蛋白的BHK细胞株(美国GE公司)

细胞培养液：含1mg/ml G418和10％FBS的F12培养液

分析培养液：含10mM HEPES、0.2％BSA的F12培养液

固定液：12％甲醛溶液(PBS配，3×)

染液：含1μM Hoechst 33342(美国Invitrogen公司)的PBS

化合物的配制：

激动剂Anisomycin用DMSO配成10mM母液，用分析培养液配成300nM工作液。

化合物用DMSO配成30mM母液，用激动剂即300nM Anisomycin配成1×工作液，初筛选用0.3μM、3μM和10μM三个终浓度，复筛根据化合物活性按梯度分别选用终浓度0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM中的连续七个浓度做量效关系。阳性化合物MOL-p38-001选用终浓度0.3μM和3μM作为对照，在复筛时同时做量效关系。

以含终浓度0.3‰DMSO的分析培养液作为Control对照，以含终浓度0.3‰DMSO的300nM Anisomycin作为激动剂对照。

实验步骤：

将稳定表达GFP-MAPKAPk2融合蛋白的BHK细胞，37℃5％CO2培养于含1mg/ml G418和10％FBS的F12培养液中。按照细胞2.0×104个/100μl/孔种于96孔黑底透细胞培养板中，37℃5％CO2培养18-24h。配制激动剂和化合物工作液。细胞用100μl/孔分析培养液洗一次，加入100μl/孔化合物工作液，实验设Control对照和激动剂对照，化合物每个浓度平行重复3孔。细胞37℃5％ CO2孵育90min，加入室温预暖的3×固定液50μl/孔混匀，室温孵育20min。细胞用染液200μl/孔洗三次，并留在200μl/孔染液中室温染1hr。细胞在IN Cell Analyzer 1000活细胞成像系统上进行测定。测定条件为：20倍物镜，激发波长Ex＝460nm，发射波长Em＝535nm，曝光300ms检测细胞核通道蓝荧光；激发波长Ex＝475nm，发射波长Em＝535nm，曝光1000ms检测细胞质通道绿荧光GFP，每孔5个视野连续拍照。使用GE公司IN Cell Analyzer 1000Nuclear Trafficking Analysis Module软件分析细胞核转位，计算化合物抑制核转位的活性。

化合物抑制率(％)＝(化合物处理细胞核转位-激动剂处理细胞核转位)/(Control对照处理细胞核转位-激动剂处理细胞核转位)×100％

数据统计与分析：

在每个浓度点平行测定的3孔中，每孔取5个视野，共15个视野数据的平均值计算抑制率。

实施例 28 测定小分子化合物与靶蛋白P38α的亲和力

一、实验目的：

采用表面等离子技术(SPR)测定小分子化合物P38α抑制剂与靶蛋白P38α的亲和力，从而发现与靶蛋白亲和力高的小分子化合物。

二、材料与方法：

1.仪器：BIACORE T100生物分子相互作用分析仪(美国GE公司)

2.试剂：50mM Tris-HCl Buffer(pH7.5)，150mM NaCl，10mM MgCl，1mM MnCl2，P20，CM5芯片(美国GE公司)，DMSO(ACROS公司)，P38αprotein(国内纯化)，His Capture Kit(美国GE公司)。

3.化合物配制：

化合物用DMSO配成30mM母液，使用前用DMSO稀释成60μM的应用液，取5μl加95μl 1.05X Tris Buffer稀释至3μM，用含5％DMSO的Tris Buffer以次稀 释为3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003μM，1μM作重复。以含5％DMSO的Tris Buffer为溶剂对照。

三.操作流程：

1.Anti-Histidine-antibody和CM5芯片的偶联

Anti-Histidine-antibody用10mmol/L的醋酸钠缓冲溶液(pH5.0)稀释到50μg/ml，在25℃，流速10μl/min的条件下，EDC/NHS活化M5芯片7min，Anti-Histidine-antibody通过伯胺偶合反应直接偶联在亲水的羧甲基右旋糖苷基质感应芯片上(7min)，Ethanolamine封闭7min。

2.P38α蛋白的捕获

在25℃，流速20μl/min的条件下，P38α蛋白(50μg/ml)与偶联在芯片上的Anti-Histidine-antibody结合，直至饱和或所期望的水平。EDC/NHS活化2.5min，Ethanolamine交联2.5min。

3.小分子化合物与P38a蛋白的结合与解离

按照30μl/ml的流速，以含5％DMSO的Tris Buffer作为流动相，在25℃条件下，化合物按照0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、和3μM的顺序进样，结合时间90秒，解离时间180秒。

4.结果分析：

根据化合物与蛋白的结合特性选用Steady state model，计算药物和蛋白质的结合常数(平衡解离常数KD)，计算公式为：Response＝Conc*Rmax/[conc+KD]+offset。

四、实验结果

1、化合物与P38a蛋白亲和力测定结果(KD值)

按照30μl/ml的流速，以含5％DMSO的PBS作为流动相，在25℃条件下， 化合物按照0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、和10μM的顺序进样，结合时间90秒，解离时间180秒。化合物的KD值见表。

表.p38α抑制剂与p38α蛋白亲和力的测定结果