脑膜炎奈瑟氏球菌的新表面蛋白

发明领域

本发明涉及新多肽，如可得自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的多肽，以及编码此多肽的核苷酸序列，及其在诊断剂， 和预防性疫苗中的应用及在设计和/或筛选药物中的应用。

发明背景

脑膜炎奈瑟氏球菌是一种革兰氏阴性菌，且是脑膜炎和败血病的 致病因素。其已知的唯一宿主是人，且其可被将近10％的人无症状 地携带(Caugant，D.et al.1994，临床微生物学杂志，32：323-30)。

脑膜炎奈瑟氏球菌可表达多糖荚膜，且其使细菌可根据表达的荚 膜的性质进行分类。有至少13个血清的脑膜炎奈瑟氏球菌：A,B,C, 29-E,H,I,K,L,W135,X,Y及Z；其中血清A，B和C导致90％的 脑膜炎疾病(Poolman，J.T.et al.，1995，传染因子及疾病4：13-28)。现 可获得抗血清A和C的疫苗，但血清B荚膜多糖是低免疫原性 的，且在人体不能诱导保护作用。

因而检测其它膜及胞外组分包含在疫苗中是否合适。实例包括1， 2，及3(膜孔蛋白)类，及4(Rmp)和5(不透明蛋白质)类外膜 蛋白质。但目前，这些候选物无一能诱导完全保护作用，尤其在儿童 中(Romero，J.D.，1994，临床微生物学综述，7：559-575；Poolman，J.T.et al，1995前述)。

为产生有效疫苗，需鉴别存在于大多数菌株中并能诱导保护性免 疫应答(杀菌抗体)的脑膜炎奈瑟氏球菌的组分。为此可参考Brodeur 等(国际公开WO96/29412)所述，其揭示了一种22kDa表面蛋白， 其在99％的全部已知脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中是高保守的。注射纯化 的重组22kDa表面蛋白，使80％的免疫小鼠抗由脑膜炎奈瑟氏球菌 导致的致死感染。尽管揭示了此蛋白质，仍需分离更多的大多数菌株 中高保守的，并具有抗脑膜炎奈瑟氏球菌免疫保护分布图，和/或可用 于与脑膜炎奈瑟氏球菌地其它组分组合以增强抗此生物体的保护效力 的脑膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白。

发明概述

本发明揭示了一种新基因，其存在于所有测试的脑膜炎奈瑟氏球 菌菌株中，且其编码推定分子量大约为62kDa的一种新多肽。基于其 序列特点及同源性，此多肽被推定是粘附素，且结合试验数据推测其 组成一表面蛋白，可用于抗脑膜炎奈瑟氏球菌的性和/或预防性疫 苗的生产。

据此，本发明的一方面提供了一分离的多肽或其片段，或其变体 或衍生物，所述多肽选自以下组成的一组：

(a)如SEQ ID NO：2的多肽；

(b)如SEQ ID NO：5的多肽；

(c)如SEQ ID NO：7的多肽；

(d)如SEQ ID NO：9的多肽；

(e)如SEQ ID NO：11的多肽；

(f)如SEQ ID NO：13的多肽；

(g)如SEQ ID NO：15的多肽；

(h)如SEQ ID NO：17的多肽；

(i)如SEQ ID NO：19的多肽；和

(j)如SEQ ID NO：21的多肽；

优选地，所述多肽、片段、变体或衍生物表现出抗一或多个选自 以下一组的成员的免疫活性：

(ⅰ)脑膜炎奈瑟氏球菌；

(ⅱ)所述多肽；

(ⅲ)所述片段；

(ⅳ)所述变体；和

(ⅴ)所述衍生物。

本发明另一方面提供了编码前述多肽或其片段，或其变体或衍生 物的分离的核酸序列。适当地，所述序列选自

(1)SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO：3的核苷酸序列；

(3)SEQ ID NO：4的核苷酸序列；

(4)SEQ ID NO：6的核苷酸序列；

(5)SEQ ID NO：8的核苷酸序列；

(6)SEQ ID NO：10的核苷酸序列；

(7)SEQ ID NO：12的核苷酸序列；

(8)SEQ ID NO：14的核苷酸序列；

(9)SEQ ID NO：16的核苷酸序列；

(10)SEQ ID NO：18的核苷酸序列；

(11)SEQ ID NO：20的核苷酸序列；

(12)SEQ ID NO：1,3,4,6,8,10,12,14,16,18及20任一种的核苷 酸片段；和

(13)任一上述序列的核苷酸序列同系物。

优选地，所述片段编码表现出抗选自以下一组的一或多个成员的 免疫活性的产物：

(ⅰ)脑膜炎奈瑟氏球菌；

(ⅱ)第一方面所述的多肽；

(ⅲ)第一方面所述的片段；

(ⅳ)第一方面所述变体；和

(ⅴ)第一方面所述衍生物。

本发明再一方面涉及一表达载体，其含有如第二方面所述的核酸 序列，其中所述序列可操作地连接于转录及翻译调节核酸。

本发明另一方面提供了一种宿主细胞，其含有如第三方面所述的 表达载体。

本发明的另一方面提供了一种生产如第一方面所述的重组多肽的 方法，所述方法包括以下步骤：

(A)培养含如第三方面所述的表达载体的宿主细胞，由此所述 重组多肽从所述核酸表达；和

(B)分离所述重组多肽。

本发明另一方面提供了一种抗体或其片段，其与选自以下一组的 一或多个成员结合：

(ⅰ)脑膜炎奈瑟氏球菌；

(ⅱ)第一方面所述多肽；

(ⅲ)第一方面所述片段；

(ⅳ)第一方面所述变体；和

(ⅴ)第一方面所述衍生物。

本发明另一方面提供了一种检测怀疑含有脑膜炎奈瑟氏球菌的生 物样品中的脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)从病人中分离生物样品；

(B)将上述抗体或片段与生物样品混合成混合物；和

(C)检测混合物中特异结合的抗体或片段，其表明脑膜炎奈瑟 氏球菌的存在。

本发明另一方面提供了一种检测怀疑含有脑膜炎奈瑟氏球菌的生 物样品中脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括以下步骤：

(Ⅰ)从病人中分离生物样品；

(Ⅱ)检测所述样品中第二方面所述的核酸序列，其表明所述细 菌的存在。

本发明还涉及诊断病人被脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，所述方 法包括以下步骤：

(1)将取自病人的生物样品与本发明的多肽、片段、变体或衍生 物相接触；并

(2)测定所述多肽、片段、变体或衍生物与所述样品中脑膜炎奈 瑟氏球菌特异性抗体之间复合物的存在与否，其中存在复合物表明有 感染。

本发明还涉及如第一方面所述的多肽，如第三方面所述的核酸或 上述抗体或抗体片段在检测生物样品中脑膜炎奈瑟氏球菌的试剂盒中 的应用。

本发明另一方面提供了一种药物组合物，其含有如第一方面所述 的分离的多肽或其片段，或其变体或衍生物。

优选地，所述药物组合物是疫苗。

本发明另一方面提供了一种预防脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法， 包括为病人施用药物有效量的上述疫苗。

本发明另一方面提供了一种鉴别如第一方面所述的多肽、变体或 衍生物的免疫反应性片段的方法，包括以下步骤：

(a)产生所述多肽、变体或衍生物的片段；

(b)给哺乳动物施用所述片段；

(c)检测所述哺乳动物中的免疫应答，所述应答包括产生与脑膜炎 奈瑟氏球菌和/或所述多肽、变体或衍生物特异结合的因子，和/或产 生抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的保护作用。

发明详述

在本说明书及权利要求书中，除非上下文要求其它含义，术语“包 括”是指包括所述的整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。

多肽序列：

本发明提供一种如SEQ ID NO：2，5，7，9，11，13，15，17， 19及21的分离多肽，或其片段，或其变体或衍生物。在一优选的实 施方案中，本发明的多肽，片段，变体及衍生物展示抗选自脑膜炎奈 瑟氏球菌，所述多肽，所述片段，所述变体及所述衍生物任一种的免 疫活性。

SEQ ID NO：2相当于得自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58的HiaNm 基因的新的大约62kDa表面多肽，在下文充分阐述。SEQ ID NO：5， 7，9，11，13，15，17，19及21分别相当于从得自脑膜炎奈瑟氏球 菌菌株BZ10，BZ198，EG327，EG329，H15，H38，H41，P20及PMC21 的核苷酸序列推导的同源多肽。

为本发明之目的，术语“免疫活性”指上述多肽，片段，变体或 衍生物在施用其的哺乳动物中产生应答的能力，其中应答包括产生与 脑膜炎奈瑟氏球菌和/或所述多肽，片段，变体或衍生物特异结合的因 子，和/或产生抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的保护效应。

“分离的”是指基本上不含在其原始状态正常与其相伴的组分的 物质。

“多肽”是指长链肽，包括蛋白质。

本文所用术语“片段”包括缺失变体及小肽，例如长度为至少6 个，优选至少10个，更优选至少20个氨基酸，其包括抗原决定簇或 表位。一些如此片段可连接在一起。此类肽可通过应用标准重组核酸 技术或用常规液相或固相合成技术合成而获得。例如，可参考如由 Atherton和Shephard所著《肽合成》第9章及包含于由Nicholson编 辑且由Blackwell科学出版公司出版的《合成疫苗》中的液相或固相 合成。或者，可通过将本发明的多肽用蛋白酶如endoLys-C，endoArg- C,endoGlu-C及葡萄球菌V8蛋白酶消化而产生肽。此消化的片段可通 过如HPLC技术进行纯化。

术语“变体”指一种多肽，其中一或多个氨基酸已经被不同氨基 酸置换。本领域熟知一些氨基酸可被其它具有广泛相似性的氨基酸置 换，而不改变此多肽的活性性质(保守取代)。根据下表可进行多肽 中举例性保守取代。

表1

通过选择比表1所示较低保守的取代进行功能的基本改变。其它 置换是非保守取代并相对较少的这些取代是耐受的。一般地，易于产 生多肽性质最大变化的取代是那些其中(a)亲水性残基(如Ser或Thr) 取代或被疏水性残基(如Ala，Leu，Ile，Phe或Val)取代；(b)半胱氨 酸或脯氨酸取代或被任何其它残基取代；(c)具有正电侧链的残基(如 Arg，His或Lys)取代或被负电残基(如Glu或Asp)取代；或(d) 具有庞大侧链的残基(如Phe或Trp)取代或被具有较小侧链(如 Ala,Ser)或无侧链(如Gly)的残基取代。

一般地，变体与例如SEQ ID NO：2，5，7，9，11，13，15，17， 19和21所示的基本序列应具有至少75％、更合适至少80％、优选至 少85％、最优选至少90％的同源性。同源性的定义是相同或组成如 表1所定义的保守取代的氨基酸数的百分数。同源性可用序列比较程 序如GAP(Deveraux等，1984，核酸研究12，387-395)确定，该 文献引入本文作参考。以这种方式，与本文所述序列相似长度或不同 长度的序列可通过将缺口掺入对比序列而比较，这种缺口可通过例如 GAP使用的比较算法而确定。可通过常规技术确定合适变体的组成。 例如，编码SEQ ID NO：2，5，7，9，11，13，15，17，19和21的 多肽的核酸，可用随机诱变发转座子诱变，或用位点直接诱变进行突 变。然后将所得DNA片段用常规技术克隆入适当的表达宿主如E.coli 中，并检测保持所需活性的克隆。在已用随机诱变衍生的克隆中，将 阳性克隆测序以检测突变。术语“变体”也包括天然发生的等位基因 变体。

“衍生物”是指通过修饰基本序列而衍生的多肽，如通过本领域 已知的与其它化学成分缀合或复合，或通过翻译后修饰。如此衍生物 包括如SEQ ID NO：2，5，7，9，11，13，15，17，19和21的多肽 或其变体的氨基酸缺失和/或添加，其中所述衍生物保持免疫活性。氨 基酸的“添加”可包括多肽或其变体与其它多肽或蛋白质的融合。在 这点上应意识到本发明的多肽或变体可掺入较大多肽中，且该较大多 肽也预期保持抗如脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫活性。如上所述的多肽可 融入其它蛋白质中，如非衍生于脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白质。此其它 蛋白质例如可有助于蛋白质的纯化。例如聚组氨酸标记或麦芽糖结合 蛋白可用于此方面，并如下详述。或者，其可产生有效抗脑膜炎奈瑟 氏球菌的免疫应答，或产生抗其它病原体的免疫应答。其它可能的融 合蛋白是那些产生免疫调制应答的蛋白质。该蛋白质的特例包括A蛋 白或谷胱甘肽S-转移酶(GST)。另外，此多肽可融入基于寡糖的 疫苗组分，在此其作为载体蛋白。

其它本发明期望的衍生物包括但非限于侧链修饰，在肽，多肽或 蛋白质合成期间掺入非天然氨基酸和/或其衍生物，及应用交联剂和其 它对本发明的多肽，片段及变体有构象限制影响的方法。

本发明期望的侧链修饰的实例包括氨基基团的修饰，如通过用乙 酐的酰化；用琥珀酸酐及四氢氨甲酰苯甲酸酐对氨基基团酰化；用甲 基乙酰亚胺化物的脒化；用氰酸酯对氨基基团的氨甲酰化；用吡哆- 5-磷酸酯对赖氨酸吡哆化，随后用NaBH4还原；通过与乙醛反应， 随后用NaBH4还原的还原烷化；及用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS) 对氨基基团的三硝基苯化。

羧基基团的修饰可通过经O-酰基异脲的形成碳二亚胺活化，随后 衍生为例如相应酰胺而进行。

精氨酸残基的胍基修饰可通过用如2，3-丁二酮，苯基乙二醛及 乙二醛等试剂形成杂环缩合产物而进行。

巯基基团修饰可通过如过甲酸氧化成磺基丙氨酸；用4-氯汞基 苯基磺酸，4-氯汞基苯甲酸；2-氯汞基-4-硝基苯酚，氯化苯汞及其 它汞化合物形成衍生物；用其它巯基化合物形成混合的二硫化物；与 马来酰亚胺，马来酸酐或其它取代的马来酰亚胺反应；用碘乙酸或碘 乙酰胺羧甲基化；及在碱性pH值用氰酸酯氨甲酰化。

氨酸残基修饰可通过用2-羟基-5-硝基苄基溴化物或磺酰卤对 吲哚环烷基化，或通过用N-溴琥珀酰亚胺氧化。

酪氨酸残基修饰可通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍 生物进行。

组氨酸残基的咪唑环修饰可通过用焦碳酸二乙酯N-乙酯基化， 或用碘乙酸衍生物烷基化进行。

在肽合成期间，掺入的非天然氨基酸及衍生物例如包括但非限于 使用4-氨基丁酸，6-氨基己酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸， 4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，叔丁基甘氨酸，正亮氨酸，正缬 氨酸，苯基甘氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，2-噻吩丙氨酸，和/或氨基酸 的D-异构体。本发明期望的非天然氨基酸示于表2。

表2

本发明还涉及用二硝基苯酚共价修饰本发明的多肽，片段或变体， 以使其在人体内是免疫原性的。

优选地，本发明包括选自如SEQ ID NOS：2，5，7，9，11，13， 15，17，19及21任一多肽的多肽。

本发明的多肽可通过任何本领域技术人员已知的适当方法制备。 例如，多肽可通过含以下步骤的方法制备：

(a)制备一重组核酸，该核酸含有编码如SEQ ID NOS：2，5，7， 9，11，13，15，17，19及21任一多肽，或其片段，或其变体或衍生 物的核苷酸序列，此核苷酸序列可操纵地与转录及翻译调节核酸连 接；

(b)用重组核酸转染或转化适当宿主细胞；

(c)培养宿主细胞，以从所述重组核酸表达重组多肽；

(d)分离重组多肽。

适当的所述核苷酸序列选自SEQ ID NOS：1，3，4，6，8，10， 12，14，16，18及20。

“重组多肽”意为用重组技术生产的多肽，即通过重组核酸的表 达而生产的多肽。

术语“重组核酸”是指通过将核酸处理为非天然中正常发现的形 式的在体外形成的核酸。在此方面，重组核酸优选包括表达载体，其 可以是自主复制的染体外载体如质粒，或整合入宿主基因组的载 体。通常地，该表达载体包括可操纵地与所述核苷酸序列连接的转录 及翻译调节核酸。

“可操纵地连接”是指转录及翻译调节核酸相对于编码所述多肽、 片段、变体或衍生物的核苷酸序列的位置能使转录启动。转录及翻译 调节核酸一般适于用于表达的宿主细胞。本领域已知为各种宿主细胞 所适用的各类表达载体及调节序列。

典型地，该转录及翻译调节核酸可包括但非限于启动子序列，前 导或信号序列，核糖体结合位点，转录起始及终止序列，翻译起始及 终止序列，及增强子或激活子序列。

本领域已知的组成型或可诱导启动子是本发明所期望的。该启动 子可以是天然发生的启动子，或组合一个以上启动子的杂合启动子。

在一优选的实施方案中，此表达载体含有一可选择标记基因，以 选择转化的宿主细胞。本领域已熟知选择基因，可根据所用宿主细胞 而变化。

表达载体还可包括融合配偶体(典型地由表达载体提供)，以便 本发明的重组多肽被表达作具有所述融合配偶体的融合多肽。融合配 偶体的主要优点是其有助于所述融合多肽的鉴别和/或纯化。

为表达所述融合多肽，需将本发明的核苷酸序列连接于表达载体 中，以便融合配偶体的翻译读框与本发明的核苷酸序列恰好重合。

融合配偶体例如包括但非限于谷胱甘肽S转移酶(GST)，人IgG 的Fc部分，麦芽糖结合蛋白(MBP)及6组氨酸(HIS6)，其尤其 用于经亲和层析分离融合多肽。为通过亲和层析纯化融合多肽之目 的，亲和层析的相关基质分别是谷胱甘肽缀合的，直链淀粉缀合的， 镍或钴缀合的树脂。一些如此基质可以“试剂盒”形式获得，如具有 (HIS6)融合配偶体的QIAexpressTM系统(Qiagen)，及Pharmacia GST 纯化系统。

其它为本领域所熟知的融合配偶体是绿荧光蛋白(GFP)。此 融合配偶体作为荧光“标记”，其使本发明的融合多肽可经荧光显微 镜或流式细胞计量术鉴别。当确定本发明融合多肽的亚细胞定位，或 分离表达本发明融合多肽的细胞时，GFP标记是有用的。如荧光激活 细胞分选(FACS)等流式细胞计量法尤其用于后一应用中。

优选地，此融合配偶体还具有蛋白酶切割位点，如因子Xa或凝 血酶，其使相关蛋白酶部分消化本发明的融合多肽，并从而从中释放 本发明的重组多肽。然后通过随后的层析分离可将释放的多肽从融合 配偶体中分离出。

本发明的融合配偶体还包括“附加表位”，其通常是短肽序列， 由此可获得特异抗体。由其可易于获得特异单克隆抗体的公知附加表 位例如包括c-myc，流感病毒血凝素及FLAG标记。

生产本发明的重组多肽可通过培养用表达载体转化的宿主细胞进 行，该载体含有编码本发明多肽，片段，变体或衍生物的核酸序列。 适于蛋白质表达的条件将随选择的表达载体及宿主细胞而变化。这些 条件经常规试验将为本领域技术人员所易于确定。

适于表达的宿主细胞可以是原核或真核细胞。一优选的表达本发 明多肽的宿主细胞是细菌。所用细胞可以是E.coli。或者，宿主细胞 可以是昆虫细胞，如SF9细胞，其可以与杆状病毒表达系统一起利用。

本领域技术人员用标准方案可常规制备重组蛋白质，例如并入本 文参考的Sambrook等在分子克隆实验手册(冷泉港实验室出版社，1989) 中所述，尤其第16及17节；Ausubel等分子生物学当前方案(John Wiley & Sons,Inc.1994-1998)，尤其第10和16章；及Coligan等蛋白质科 学当前方案(John Wiley & Sons,Inc.1995-1997)，尤其第1，5，6 章所述。

核苷酸序列

本发明还提供一核苷酸序列，其编码上述多肽，片段，变体或衍 生物。适当的所述序列选自SEQ ID NOS：1，3，4，6，8，10，12， 14，16，18及20；SEQ ID NOS：1，3，4，6，8，10，12，14，16， 18及20任一核苷酸序列的核苷酸片段；及前述序列的核苷酸序列同 系物。优选地，这些序列编码呈现前述免疫活性的产物。

如后文更充分阐述，SEQ ID NO：1相当于得自脑膜炎奈瑟氏球 菌菌株MC58的hiaNm基因。此基因编码SEQ ID NO：2的新62kDa (大约)表面多肽。SEQ ID NO：3相当于菌株MC58的hiaNm开放 读框序列，HiaNm。SEQ ID NOS：4，6，8，10，12，14，16，18及 20相当于分别得自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株BZ10，BZ198，EG327， EG329，H15，H38，H41，P20，及PMC21的同源hiaNm开放读框 序列。

术语“核苷酸序列”指mRNA，RNA，cRNA，cDNA或DNA。

术语“核苷酸序列同系物”通常指在基本严格条件下与本发明野 生型核苷酸序列杂交的核苷酸序列。适当的杂交条件将在后文阐述。

本发明的核苷酸序列同系物可如以下步骤制备：

(ⅰ)从适当宿主中获得核酸提取物；

(ⅲ)产生任选地简并的引物，其中每种引物均含有本发明野生型核 苷酸序列的一部分；

(ⅲ)通过核酸扩增技术，用所述引物从所述核酸提取物扩增一或多 种扩增产物。

适当地，此宿主可以是细菌。优选地，此宿主是奈瑟氏球菌属， 更优选地，是脑膜炎奈瑟氏球菌。

优选地，此引物选自以下一组：

 (1)5’-TTAGATTCCACGTCCCAGATT-3’(SEQ ID NO.22)；

 (2)5’-CTTCCCTTCAAACCTTCC-3’(SEQ ID NO：23)；

 (3)5’-GGTCGCGGATCCATGAACAAAATATACCGCAT- 3’(SEQ ID NO.24)；

 (4)5’-TCACCCAAGCTTAAGCCCTTACCACTGATAAC- 3’(SEQ ID NO.25)；

 (5)5’-CCAAACCCCGATTTAACC-3’(SEQ ID NO.26)；

 (6)5’-AATCGCCACCCTTCCCTTC-3’(SEQ ID NO.27)；

 (7)5’-TTTGCAACGGTTCAGGCA-3’(SEQ ID NO.28)；

 (8)5’-TATTCAGCAGCGTATCGG-3’(SEQ ID NO.29)；

 (9)5’TGCCTGAACCGTTGCAAA-3’(SEQ ID NO.30)； 及

 (10)5’-CCGATACGCTGCTGAATA-3’(SEQ ID NO.31)。

适当的核酸扩增技术已为本领域技术人员所熟知，包括并入本文 参考的如Ausubel等(1994-1998，见前述，第15章)所述的聚合酶 链反应(PCR)；如U.S.专利No.5.422.252所述的链置换扩增(SDA)； 如Liu等(1996，J.Am.Chem.Soc.118：1587-1594及国际申请 W92/01813)及Lizardi等(国际申请WO97/19193)所述的滚环复制 (RCR)；如Sooknanan等(1994，Biotechniques 17：1077-1080)所 述的基于核酸序列的扩增(NASBA)；及如Tyagi等所述的Q-β复 制酶扩增(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：5395-5400)。

本文所用术语“扩增产物”指通过核酸扩增技术产生的核酸产物。 “杂交”指不同核苷酸序列的互补碱基配对，根据碱基配对原则 产生DNA-DNA杂交体，DNA-RNA杂交体或RNA-RNA杂交体。

在DNA中，互补碱基是：

(ⅰ)A和T；及

(ⅱ)C和G。

在RNA中，互补碱基是：

(ⅰ)A和U；及

(ⅱ)C和G。

在RNA-DNA杂交体中，互补碱基是：

(ⅰ)A和U；及

(ⅱ)A和T；及

(ⅲ)G和C。

典型地，基本互补的核苷酸序列通过印迹技术鉴别，该技术包括 将核苷酸固定在一基质(优选合成膜如硝酸纤维素)上的步骤，杂交 步骤及检测步骤。Southern印迹用于鉴别互补DNA序列；Northern 印迹用于鉴别互补RNA序列。斑点印迹及狭缝印迹可用于鉴别互补 DNA/DNA，DNA/RNA，或RNA/RNA多核苷酸序列。本领域已熟知 此类技术，并已如Ausubel等所述(1994-1998，见前述)P2.9.1～ P2.9.20。

根据如此方法，Southern印迹包括根据大小经凝胶电泳分离DNA 分子，将依大小分离的DNA转移至合成膜，并将结合DNA的膜与放 射性标记，酶标记或荧光染标记的互补核苷酸序列杂交。在斑点及 狭缝印迹中，将DNA样品在杂交前直接施加于合成膜。

当鉴别cDNA或基因组文库中互补核苷酸序列时用一另外的印迹 步骤，如经噬斑或菌落杂交法。此步骤的-典型实例见于Sambrook 等(1989，前述)中第8-12章所述。

典型地，下述通用程序用于确定杂交条件。如上述将核苷酸序列 印迹/转移至合成膜。如上述将本发明的野生型核苷酸序列标记，并分 析此标记的核苷酸序列与固定的核苷酸序列杂交的能力。

本领域技术人员将意识到：许多因素可影响杂交。放射标记的多 核苷酸序列的比活性典型地应高于或等于约108dpm/mg，以提供一可 检测信号。比活性108～109dpm/mg的放射标记核苷酸序列可检测大 约0.5pg的DNA。本领域熟知足够的DNA必须固定于膜上以容许检 测。一般需要有过量的固定的DNA，通常为10μg。在杂交期间加入 惰性聚合物如10％(w/v)葡聚糖硫酸酯(MW500，000)，或聚乙 二醇6000也可提高杂交的敏感性(见Ausubel前述2.10.10)。

为在固定于膜上的核苷酸序列与标记的核苷酸序列之间获得富有 意义的杂交结果，必须将足够量的标记的核苷酸序列与固定的核苷酸 序列在杂交后洗涤。洗涤可确保标记的核苷酸序列只与具有所需的与 标记核苷酸序列互补性程度的固定的核苷酸序列杂交。

本文所用的“严格性”指在杂交期间的温度，离子强度条件及一 定有机溶剂的存在与否。严格性越高，固定的核苷酸序列及标记的多 核苷酸序列之间互补性程度越高。

“严格条件”是指仅使具有高频率互补碱基的核苷酸序列杂交的 那些条件。

典型的严格条件包括如：(1)0.75M磷酸氢二钠/0.5M磷酸二氢钠 /1mM乙二胺四乙酸二钠/1％sarkosyl。在约42℃至少30分钟；或(2)6.0M 尿素/0.4％十二烷基硫酸钠/0.1×SSC在大约42℃至少30分钟；或(3)0.1 ×SSC/0.1％SDS在大约68℃至少20分钟；或(4)1×SSC/0.1％SDS在 大约55℃大约60分钟；或(5)1×SSC/0.1％SDS在大约62℃大约60 分钟；或(6)1×SSC/0.1％SDS在大约68℃大约60分钟；或(7)0.2× SSC/0.1％SDS在大约55大约60分钟；或(8)0.2×SSC/0.1％SDS在 大约55℃大约60分钟；或(7)0.2×SSC/0.1％SDS在大约55℃大约60 分钟；或(8)0.2×SSC/0.1％SDS在大约62℃大约1小时；或(9)0.2× SSC/0.1％SDS在大约68℃大约60分钟。详细论述见并入本文参考的 分子生物学当前方案(前述)P.2.10.1～2.10.16，及Sambrook等在分 子克隆实验手册(冷泉港实验室出版社，1989)在1.101～1.104节中 所述。

尽管严格洗涤典型地在42℃～68℃进行，本领域技术人员将知晓 其它温度也许适于严格条件。在形成DNA-DNA杂交体时，最大杂 交典型地发生在低于Tm大约20℃～25℃的温度。本领域熟知Tm是 解链温度，或两个互补多核苷酸序列解离的温度。估算Tm的方法已 为本领域所熟知(见分子生物学当前方案(前述)P.2.10.8)。在DNA -RNA杂交体情况下，最大杂交典型地发生在低于Tm大约10℃～15 ℃的温度。

本领域熟知其它严格条件。熟练技术人员将意识到可对各种因素 进行操纵以使杂交特异性最佳化。最终洗涤的严格性最佳化用于保证 高度杂交。

检测与固定的核苷酸序列杂交的标记的核苷酸序列的方法已为本 领域技术人员熟知。如此方法包括放射自显影，化学发光，荧光及比 检测。

抗体

本发明还涉及抗前述多肽，片段，变体及衍生物的抗体，这种抗 体可包括任何与本发明多肽、片段、变体或衍生物结合或缀合的适当 抗体。例如，抗体可包含多克隆抗体。可通过将本发明多肽、片段、 变体或衍生物注射入生产物种中，该物种可包括鼠或兔，以获得多克 隆抗血清，从而制备抗体。本领域技术人员熟知生产多克隆抗体的方 法。可应用的方案例如引入本文作参考的由Coligan等在免疫学当前 方案(John Wiley & Sons,Inc.1991)，及Ausubel等(1994-1998，前述) 尤其在第11章Ⅲ节中所述。

为代替得自生产物种的多克隆抗血清，可用如Kohler及 Milstein(1975,Nature 256,495-497)所述，或对其更新近的修改如Coligan 等(1991，前述)通过无限增殖脾或其它抗体生产细胞生产单克隆抗 体，该细胞衍生自已用一或多种本发明的多肽，片段，变体或衍生物 接种的生产物种。

在其抗体范围内本发明还包括上述多克隆或单克隆抗体的Fc或 Fab片段。或者，该抗体可包含抗本发明肽的单链Fv抗体(scFvs)。 这种scFvs可根据分别如由美国专利No.5,091,513，欧洲专利 No.239,400或上Winter及Milstein的文章(1991，Nature，349,293) 所述进行制行，以上文献并入本文参考。

本发明的抗体可用于亲和层析以分离天然或重组脑膜炎奈瑟氏球 菌多肽。例如参见Coligan等(1995-1997，前述)在9-5章中所述 的免疫亲和层析法。

抗体可用于在表达文库中筛选本发明多肽变体。如后文所述，本 发明的抗体还可用于检测脑膜炎奈瑟氏球菌感染。

检测脑膜炎奈瑟氏球菌

患者体内脑膜炎奈瑟氏球菌的存在与否可如下测定：从患者分离 生物样品，将上述抗体或抗体片段与生物样品混合形成一混合物，并 检测混合物中特异结合的抗体或结合片段，其代表样品中存在脑膜炎 奈瑟氏球菌。

本文所用术语“生物样品”是指得自患者的样品，其可以是提取 的，未处理的，处理的，稀释的或浓缩的。适当地，生物样品选自全 血，血清，血浆，唾液，尿，汗液，腹水，腹膜液，滑液，羊水，脑 脊液，皮肤活检等。

可应用任何适当的技术测定复合物的形成。例如，根据本发明的 结合标记的抗体或抗体片段可用于免疫分析中。这种免疫分析可包括 但非限于放射免疫分析(RIAS)，酶联免疫吸附测定(ELISAs)， 及免疫层析技术(ICTs)，这些已为本领域所熟知。例如可参见“免 疫学当前方案”(1994，前述)，其揭示了根据本发明可应用的各种 免疫分析。如本领域所知，免疫分析可包括竞争分析。

与抗体或抗体片段结合的标记可包括：

ⅰ．与抗体或抗体片段直接附着的标记；

ⅱ．与抗体或抗体片段非直接附着的标记；即标记与其它随后与抗 体或抗体片段结合的分析试剂附着；

ⅲ附着于抗体或抗体片段的随后反应产物的标记。

标记可选白原，催化剂，酶，荧光团，化学发光分子、镧系离 子如铕(Eu34)，放射性同位素及直接目视标记。

在直接目视标记情况中，可应用由胶体金属或非金属颗粒，染料 颗粒，酶或底物，有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体，或其它含信号产 生物质的小泡。

大量适用作标记的酶见美国专利U.S.4,366,241、U.S.4,843,000及 U.S.4,849,338中所揭示，在此全部并入本文参考。用于本发明的适当 酶标记包括碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，荧光素酶、β-半乳糖苷酶， 葡糖氧化酶，溶菌酶，苹果酸脱氢酶等。酶标记可单独应用，或与在 溶液中的第二种酶组合应用。

适当地，荧光团选自异硫氰酸荧光素(FITC)，异硫氰酸四甲基 罗丹明(TRITL)，或R-藻红蛋白(RPE)。

本发明还涉及检测被脑膜炎奈瑟氏球菌感染的患者的方法，所述 方法包括以下步骤：将取自患者的生物样品与本发明的多肽，片段， 变体或衍生物接触，并检测所述多肽，片段，变体或衍生物与所述血 清中脑膜炎奈瑟氏球菌特异抗体之间复合物的存在与否，其中若存在 所述复合物，则表明有所述感染。

在一优选的实施方案中，通过用本领域熟知的适当标记可检测地 修饰所述多肽、片段、变体或衍生物，并如上述在适当的免疫分析中 应用此修饰的化合物以检测上述复合物。

另一方面，本发明提供了一种在怀疑含有脑膜炎奈瑟氏球菌的生 物样品中检测脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括以下步骤：从 患者分离生物样品，检测所述样品中是否存在如本发明的核酸序列， 其代表存在所述细菌。

所述核酸序列的检测可用任何适当技术测定。例如，如本发明的 标记的核酸序列可在得自患者的核酸提取物的Southern印迹中用作探 针。这已为本领域所熟知，或者，如本发明的标记的核酸序列可在患 者RNA提取物的Northern印迹中用作探针。优选地，患者核酸提取 物在核酸扩增反应如PCR，或LCR(如并入本文参考的国际申请 WO89/09385中所述)中，与相应于本发明核酸序列的有义及反义序 列，或其侧翼序列的寡核苷酸引物一起应用。各种自动固相检测技术 也是合适的。例如，非常大规模的固定化引物组(VLSIPSTM)用于核 酸的检测，例如由Fodor等(1991，Science 251：767-777)及Kazal等 (1996，Nature Medicine 2：753-759)所述。以上通用技术为本领域技 术人员所熟知。

药物组合物

本发明另一特点是用本发明的多肽，片段，变体或衍生物(“免 疫原性制剂”)作为药物组合物中的活性成分，以保护患者抗脑膜炎 奈瑟氏球菌感染。适当地，药物组合物含有药物可接受载体。

“药物可接受载体”意为一固体或液体充填剂，稀释剂或胶囊化 物质，其可安全地用于系统施用。依于施用的特殊途径，可应用各种 本领域熟知药物可接受载体。这些载体可选自糖，淀粉，纤维素及其 衍生物、麦芽、明胶、滑石，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，藻 酸，磷酸盐缓冲液，乳化剂，等渗盐水及无热原水。

可应用任何适当途径以为患者提供本发明的组合物。例如，可应 用口服，直肠、非肠道、舌下、口腔、静脉内，动脉内，肌内，皮内， 皮下，吸入，眼内，腹膜内，脑室内，经皮等途径，肌内及皮下注射 适用于例如施用免疫药物组合物，疫苗及DNA疫苗。

剂型包括片剂、散剂、悬浮剂、注射剂，溶液，糖浆、锭剂，胶 囊、栓剂、烟雾剂、经皮膏药等。这些剂型还可包括注射或植入为此 目的特别设计的控制释放装置，或其它修改的以此方式额外发挥作用 的植入形式。剂的控制释放可通过用例如包括丙烯酸树脂、蜡、 高级脂族醇、聚乳酸及聚乙醇酸和某些纤维素衍生物如羟丙甲基纤维 素等疏水聚合物包被而得。另外，可用其它聚合物基质，脂质体和/或 微球体进行控释。

适于口服或非肠道施用的本发明药物组合物可以是分立的单位如 含预定量一或多种本发明剂的胶囊剂、囊剂(sachets)或片剂， 如粉末或颗粒，或如在水性液体，非水液体，水包油乳剂或油包水液 态乳剂中的溶液或悬浮液。该组合物可通过任何制药方法制备，但所 有方法均包括将如上所述一或多种免疫原性制剂与组成一或多种必需 成分的载体结合。总之，组合物通过将本发明的免疫原性制剂与液体 载体或细碎的固体载体或二种载体均匀并充分混合，然后如果需要， 将产物塑成所要求形式。

上述组合物可以与剂量配方相容的方式，并以预防患者感染脑膜 炎奈瑟氏球菌的免疫学有效量施用。根据本发明，施用于患者的剂量 应在一定时间内足以在病人中实现有益应答，如降低脑膜炎奈瑟氏球 菌水平，或抑制脑膜炎奈瑟氏球菌感染。施用的免疫原性制剂的量可 依于受试者的年龄、性别、体重及其一般健康状态而定。为此，需被 施用的免疫原性制剂的精确量将依于从业者的判断而定。在确定 或预防抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染中施用的免疫原性制剂的有效量中， 医者可估计循环血浆水平，疾病进程、及抗脑膜炎奈瑟氏球菌抗体的 产生。在任何情况中，本发明免疫原性制剂的适当剂量可为本领域技 术人员容易地确定。该剂量可以是钠克至毫克级的本发明免疫原性制 剂。

上述组合物可用作或预防疫苗。由此，本发明涉及含本发明 一或多种免疫原性制剂作为活性成分的疫苗的生产。任何生产这种疫 苗的适当方法均是期望的。例如包括并入本文参考的《新一代疫苗》 (1997，Levine et al．，Marcel Dakker,Inc.纽约，巴塞尔，香港)中所 述方法。

本发明的免疫原性制剂可与其它抗原包括其它抗原的B或T细胞 表位混合、缀合或融合。另外，其可与如下述载体缀合。

当使用本发明的半抗原肽时(即与关联抗体反应，但不能自身激 发免疫应答的肽)，其可与免疫原性载体缀合。本领域熟知实用的载 体，包括如甲状腺球蛋白；白蛋白如人血清白蛋白；来自破伤风、白 喉，白日咳，假单胞菌，大肠杆菌，葡萄球菌及链球菌的毒素，类毒 素或任何毒素交叉反应物(CRM)的变体；聚氨基酸如聚(赖氨酸： 谷氨酸)；流感病毒；轮状病毒VP6，细小病毒VPl和VP2；乙型肝 炎病毒核心蛋白；乙型肝炎病毒重组疫苗等。或者，可使用载体蛋白 或其它免疫原性蛋白的片段或表位。例如，本发明的半抗原肽可与细 菌毒素、类毒素或CRM的T细胞表位偶联。为此可参考并入本文参 考的U．S.专利No.5,785,973。

另外，本发明的多肽、片段，变体或衍生物可在抗奈瑟氏球菌， 或抗其它细菌或病毒的疫苗组合物中作为载体蛋白。

本发明的免疫原性制剂可作为与脑膜炎奈瑟氏球菌的抗原，或其 它生物体包括病原性细菌H.influenzae,M.catarrhalis,N.gonorrhoeae， E.coli,S.pneumoniae等的抗原组合的多价亚单位疫苗而施用。

疫苗还可含有生理学可接受稀释剂或赋形剂，如水，磷酸缓冲盐 水及盐水。

疫苗及免疫原性组合物可包括一佐剂，这已为本领域所熟知。适 当的佐剂包括但非限于表面活性剂如十六胺，十八胺，二甲基双十 八烷基溴化铵，N,N-双十八烷基-N’,N’-双(2-羟乙基丙二胺)，甲氧 基十六烷基甘油，及pluronic多元醇；多元胺如吡喃，葡聚糖硫酸酯， 聚IC carbopol；肽如胞壁酰二肽及衍生物，二甲甘氨酸，吞噬作用激 素；油乳剂；及无机凝胶如磷酸铝，氢氧化铝或矾；淋巴因子，QuilA 及免疫刺激复合物(ISCOMS)。

本发明的免疫原性制剂可由减毒的病毒宿主表达。“减毒的病毒 宿主”意为天然或已经基本无毒的病毒载体。通过任何适当的物理(如 热处理)或化学方式(如甲醛处理)可将病毒变为基本无毒的。“基 本无毒的”指其感染性已被破坏的病毒。理想地，病毒的感染性被破 坏，而不影响携带病毒免疫原性的蛋白质。由前所述，应意识到减毒 的病毒宿主可包括活的病毒或灭活的病毒。

可用于本发明疫苗的减毒的病毒宿主可包含病毒载体，包括腺病 毒、巨细胞病毒并优选痘病毒如痘苗(见如Paoletti和Panicali，U.S.专 利4,603,112，并入本文参考)及减毒的沙门氏菌菌株(见如并入本文 参考的Stocker，U.S.专利4,550,081)。活病毒特别有利，因为它们导 致能赋予非常长期免疫性的延长刺激。

多价疫苗可制备自一或多种表达脑膜炎奈瑟氏球菌不同表位(如， 脑膜炎奈瑟氏球菌的其它表面蛋白或表位)的微生物。另外，其它病 原性微生物的表位可掺入疫苗中。

在一优选的实施方案中，包括构建一重组痘苗病毒，以表达本发 明核酸序列。在导入宿主时，此重组痘苗病毒表达免疫原性制剂，并 从而激发宿主CTL应答。例如，可参考U.S.专利No.4,722,848，其阐 述了痘苗载体，及用于免疫方案的方法。

通过本发明揭示，各种其它与本发明免疫原性制剂用于性施 用或免疫接种的载体对本领域技术人员是显而易见的。

在另一实施方案中，核苷酸序列可以本领域已知的“裸DNA”形 式用作疫苗。例如，本发明的表达载体可导入哺乳动物中，由此在体 内导致一多肽的产生，宿主产生对此多肽的免疫应答，如Barry，M.et a1.，(1995,Nature,377：632-635)所述，该文献引入本文作参考。

检测试剂盒

本发明还提供了在生物样品中检测脑膜炎奈瑟氏球菌的3剂盒。 这些试剂盒根据所用测试方法的性质含有一或多个上述特定制剂。由 此，该试剂盒可包括一或多个本发明多肽，片段，变体，衍生物，抗 体，抗体片段或核酸。该试剂盒还可选择地包括适当标记检测试剂， 阳性或阴性对照，洗涤溶液，稀释缓冲液等。例如，基于核酸的检测 试剂盒可包括(ⅰ)本发明的核酸(其可用作阳性对照)，(ⅱ)本发明的寡 核苷酸引物，及根据所用核酸扩增技术，任选地包括DNA聚合酶， DNA连接酶等。

制备免疫反应性片段

本发明还涉及鉴别本发明多肽、变体或衍生物的免疫反应性片段 的方法。该方法主要包括产生多肽、变体或衍生物的片段，将片段施 用于哺乳动物；并检测哺乳动物中的免疫应答。这种应答包括特异结 合脑膜炎奈瑟氏球菌和/或所述多肽、变体或衍生物的因子的产生，和 /或抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的防护效应的产生。

在上述方法中测试特异免疫反应性片段之前，可应用各种预测方 法推断一特定片段能否用于获得与天然抗原交叉反应的抗体，这些预 测方法可基于氨基末端或羧基末端序列，例如如Ausubel等(1994- 1998，前述)第11.14章所述。或者，这些预测方法可基于并入本文 参考的如Kyte和Doolittle(1982，J.Mol.Biol.157：105-132)，及 Hopp和Woods(1983，Mol.Immunol.20：483-489)所述亲水性的 预测，或基于如Choo和Fasman(1978，Ann.Rev.Biochem.47：25l -276)所述二级结构的预测。

一般地，由10～15个残基组成的肽片段提供最佳结果。小如6个 或大如20个残基组成的肽作用也令人满意。然后可将这种肽片段化 学偶联于载体分子如KLH或BSA，如Ausubel等(1994-1998前述) 在11.14和11.15节所述。

肽可用于如上所述免疫接种动物。抗天然或亲代多肽(由其选择 所述的肽)的抗体效价可通过如放射免疫分析或ELISA测定，如 Ausubel等(1994-1998，前述)在11.16和114节所述。

然后通过本领域熟知的硫酸铵分级分离，或通过层析将抗体从动 物的适当的生物学液体中纯化出。抗体纯化的方案例如由Ausubel等 (1994-1998，前述)在10.11及11.13节中所述。

通过任何适当方法如Western印迹可测定抗天然或亲代多肽的抗 体的免疫反应性。

功能阻断剂

如SEQ ID NOS：2，5，7，9，11，13，15，17，19和21的多肽 被认为具有粘附素性质，事实上它们与是表面抗原的流感嗜血杆菌粘 附素具有相似性。具体地，它们与流感嗜血杆菌的Hia蛋白大约67％ 同源(Barenkamp,S.和St.GemeⅢ,J.1996 Molecular Microbiology 19： 1215-1233)，并与流感嗜血杆菌的Hsf蛋白74％同源(St.GemeⅢ， J.Et al.，1996 Journal of Bacteriology 178：6281-6287；美国专利5,646, 259)。为这些对比，所用GAP程序中缺口重为3，长度重为0.01 (Deveraux，1984，前述)。这些蛋白质的对比序列见于图6。这样， 这些多肽功能的中断对是明显有益的，由于它们防止脑膜炎奈瑟 氏球菌粘附并侵入细胞。可以一些方式阻断功能。

例如，可以施用阻断与如SEQ ID NOS：2，5，7，9，11，13，15， 17，19和21的多肽相互作用的细胞表面受体的组分，如化学试剂或 多肽，这些组分与感染性微生物竞争受体位点。这种组分可包括如本 发明的多肽，尤其是其片段，或功能等价物以及模拟物。

术语“模拟物”指设计为模拟蛋白质或肽的特异功能区的化学物 质。也可应用阻断细菌与细胞表面结合的抗上述抗体的抗独特型抗 体。或者，与如SEQ ID NOS：2，5，7，9，11，13，15，17，19和 21的多肽中的受体结合位点相互作用的组分，可有效地防止脑膜炎奈 瑟氏球菌感染细胞，该组分可包括阻断抗体，肽或其它化学试剂。

所有这种组分，它们与药物可接受载体组合的药物组合物，及经 施用该组分或组合物使患者免于脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，构成 了本发明的另一方面。

本发明的多肽可用于筛选在上述方法中应用的化合物。例如，本 发明的多肽可与一标记组合，并在所测试剂存在下暴露于细胞培养 物，然后观测该试剂抑制标记的多肽与细胞表面结合的能力。在此筛 选中，标记的多肽可直接用于生物体如E.coli上。或者，可将脑膜炎 奈瑟氏球菌自身工程化，以表达修饰的及可检测形式的多肽，此方法 中工程化的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的应用是优选的，因为似乎蛋白质 的三级结构更近于代表在野生型细菌中表达的蛋白质。

附图简述：

图1描绘了质粒图谱及克隆策略。引物A3A和A3B(分别为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29)用于从MC58中扩增在TIGR数据库 中鉴定为与AIDI-I同源的区域。将PCR产物克隆以提供 pNMAIDA3。引物A3C(SEQ ID NO：30)及A3D(SEQ ID NO：31) 用于反向PCR中扩增包括hiaNm的3kbp EagI片段。将此产物克隆以 提供piEAGA3。将piEAGA3亚克隆以提供piEaga3.8及piEagA3.9。 引物HiaNm：M和HiaNm：P(分别为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO： 23)用于从MC58扩增邻接区域并亚克隆产物产生pHiaNm。引物 Hia-MBPA(SEQ ID NO：24)和Hia-MBPB(SEQ ID NO：25)用于扩增 hiaNm的开放读框，并将此产物克隆入pMALC2以产生pMBP- HiaNm。

图2是一些脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的基因组DNA的Southern印 迹。2A：血清B菌株，1道PMC28，2道PMC27，3道PMC25，4 道PMC24，5道PMC16，6道PMC13，7道PMC12，8道MWt标准 物，9道2970，10道1000，11道528，12道SWZ107，13道H41，14 道H38，15道NGH36，16道H15，17道NGG40，18道NGF26，19 道NGE30，20道NGE28。2B：除B之外其它血清菌株。1道PMC3， 2道PMC17，3道PMC20，4道PMC23，5道PMC8，6道PMC9，7 道PMC11，8道PMC14，9道PMC18，10道PMC21，11道PMC29， 12道MWt标准物，13道PMC19，14道PMC1，15道PMC6，16道 PMC10，17道PMC22，18道PMC26，19道PMC2。分子量标记以 千碱基对(kb)表示。基因组DNA与相应于SEQID NO：1的276～2054 位的探针杂交。

图3示出MBP-HiaNm的Coomassie染凝胶。示出用IPIG诱 导后的含pMALC2(2道)或pMBP-HiaNm(3道)的细胞。1道为分子 量标准(KDa)。箭头代表MBP和MBP-HiaNm。

图4是用兔免疫血清培养的MC58及MC58△HiaNm蛋白质的 Western印迹。1道为分子量标准(KDa)，2道为MC58的总细胞蛋 白，3道为MC58△HiaNm的总细胞蛋白，4道为MC58的OMC制 各物，5道为MC58△HiaNm的OMC制备物，每道含有A280=3.75 的50μL的蛋白质悬浮液。

图5示出平行于图4的Western印迹的凝胶的Coomassie染凝 胶。泳道与图4一致。

图6示出用PILEUP序列对比程序对HiaNm，Hia，Hsf多肽的序 列对比。

图7示出用PILEUP程序对来自脑膜炎奈瑟氏球菌10个菌株中 HiaNm的多肽序列对比。

为更易于理解本发明并实施本发明，通过以下非限制性实施例阐 述特别优选的实施方案。

实施例1分子克隆及亚克隆及hiaNm突变体构建

用标准方法以PCR扩增初始分离hiaNm基因，概而言之，由于 我们预先对E.coli的AIDA-I蛋白同源性的研究(Jennings，M.et a1.， 1995，Microbial Pathogenesis，19：391-407，Peak，I.et al.，Microbial Pathogenesis，出版中)，我们进行了同源性搜索，从来自对MC58￠3 基因组测序计划的初步数据(The Institute for Genomic Research， (ftp：//ftp.tigr.org/pub/date/n meningitidis/)中鉴别相应的序列，并用寡 核苷酸A3A(5’-TTTGCAACGGTTCAGGCA-3’，SEQ ID NO.28) 及A3B(5’-TATTCAGCAGCGTATCGG-3’，SEQID NO.29)经PCR 扩增同源性区域。将所得449碱基对(bp)产物克隆入pT7 Blue中， 以产生质粒pNMAIDA3。为克隆全长基因，设计另外的寡核苷酸并用 于反向PCR反应。这些寡核苷酸是A3C(SEQID NO.30)和A3D(SEQ ID NO.31)，并分别相应于A3A(SEQ ID NO.28)和A3B(SEQ ID NO.31)的互补序列。此反应的模板是MC58的染体DNA，其已用 EagI限制性消化后自身连接。将所得3kbp PCR产物克隆入载体pCRⅡ (Invitrogen)中，产生质粒piEagA3。将其用EagI和EcoRI消化， 并将含克隆的DNA的所得1.4kbp和1.6kbp片段克隆入pBluescript SKII， M13minus(Stratagene)，得到piEagA3.8和piEagA3.9。用分别相应 于SEQ ID NO：1的113～133和2102～2085核苷酸位置(ntp)的寡 核苷酸引物HiaNm：P(5’-TrAGATTCCACGTCCCAGATT- 3’SEQ ID NO：22)和HiaNm：M(5’-CTTCCCTTCAAACCTTCC -3’，SEQ ID NO：23)，经PCR扩增hiaNm和其5’和3’序列 并将产物克隆进pT7Blue产生质粒pHiaNm。通过将一卡那霉素抗性 盒插入相应于SEQ ID NO：1的680 ntp的pHiaNm的单一BglⅡ位点 中，产生质粒pHiaNm△Kan。此卡那霉素抗性盒是用BamHI从 pUC4Kan(Pharmacia)切下的。通过在补加10％加热马血的脑心浸 渍琼脂(Acumedia Manufacturer’s Inc)(“BHI平板”)上，在37 ℃在5％CO2中将质粒DNA与细菌保温3小时，以将pHiaNm△Kan 转化入脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58中。将单个菌落挑到新鲜选择性 培养基上，培养，并用于进一步研究，此突变体菌株被命名为MC58 △HiaNm。此菌株中hiaNm基因的破坏用相应于SEQ ID NO.1的276～ 2054 ntp的探针，经Southern印迹确定。

实施例2：核苷酸序列分析

用PRISM染料终止子测序试剂盒与Ampli Taq DNA聚合酶FS， 或BigDye终止子测序试剂盒，如厂商(Perkin Elmer)的指导，结合 373a型自动测序仪(Applied Biosystems)，进行核苷酸序列分析，对 每种菌株而言，在三种引物HiaNm5′A2：5’-CCAAACCCGATTTA ACC-3’(SEQID NO：26)和HiaNm3′A：5’-AATCGCCACCCTT CCCTTC-3’(SEQ ID NO：27)的三个独立PCR反应中，hiaNm被 扩增，此二种引物如图1所示，并相当于SEQ ID NO.1的230～247 及2144～2097ntp，将所得产物纯化并集合。以此用作模板以在双链 上直接测序，用GCG程序(Deveraux et al.，(1984)Nucleic Acids Reseatch 12，387-395)及AssemblyLIGN(Oxford Molecular)分析数据。为 完整序列的需要，产生一些寡核苷酸。10个菌株的hiaNm序列如SEQ ID NOS：1，3，4，6，8，10，12，14，16，18及20所示，且那些 基因推导的氨基酸序列如SEQ ID NOS：2，5，7，9，11，13，15，17， 19及21所示。

这些菌株的hiaNm对比表明：它们与MC58的hiaNm呈90-99 ％的相同性，另外，MC58的hiaNm与流感嗜血杆菌的hia和hsf具 有62％及68％的同源性。但在试验的菌株中，hiaNm是1770～1800bp 长。这明显不同于分别是3294和7059bp长的hia和hsf。HiaNm的 预测的多肽，HiaNm，也与一些其它细菌蛋白呈同源性包括AIDA-I， 参与致腹泻E.coli菌株2787(O126：H27)的扩散粘附中的粘附素， HMW1，另一种嗜血杆菌的粘附素，UspAl，Moraxella catarrthalis的 高分子量蛋白质，及参与弗氏志贺氏菌(Shigella flexnerir)组织侵染 中的SepA(Benz，I和Schmidt，MA.，1992，分子微生物学6：1539～ 1546，Barenkamp，S.J.和Leininger，E.1992，感染和免疫性60：1302- 1313，Aebi，C.et al.，1997，感染个免疫性65：4367-4377，Benielloun- Touimi，Z.et al.，1995,分子微生物学17：123-135)。与这些(及一些其 它蛋白质)的同源性发生在HiaNm的头50个氨基酸。该序列的分析 揭示了在所有测试HiaNm序列的第50位氨基酸具有切割位点的推测 的信号序列的存在。该长信号序列在位于革兰氏阴性菌外膜内的蛋白 质中是共有的(Henderson I et al.，1998，Trends in Microbiology 6：370- 8)。与HiaNm头50个氨基酸同源的上述蛋白质均是“自身转运蛋 白”外膜蛋白家族的成员(Henderson，I,前述)。这强有力地提示HiaNm 位于脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜中。

实施例3：Southern印迹分析

用标准技术进行Southern印迹分析(Sambrook et al.，前述，Ausubel et al.，前述)。概而言之，从几个血清脑膜炎奈瑟氏球菌的70个菌 株中制备基因组DNA，在毛细管转移至尼龙膜之前，限制性消化并 在琼脂糖凝胶上经电泳分离。将这些膜与标记的探针杂交。所用探针 相应于SEQ ID NO：1的276～2054ntp，包含MC58菌株的hiaNm 的全部开放读框，根据厂商(Boehringer Mannheim)的指导，将其用 DIG(双氧蛋白)标记。进行严格洗涤(在22℃用2×SSC/0.1％SDS 洗涤2次，每次5分钟，随后在68℃，用0.2×SSC/0.1％SDS洗涤2 次，每次30分钟)。如厂商的推荐，用氮蓝四唑/溴氯吲哚磷酸 (NBT/BCIP)比检测杂交。在所有测试菌株中，均检测到信号(如 图2)。除原型菌株MC58之外，研究了以下菌株：

表3

A世界卫生组织脑膜炎球菌参比及研究协作中心，挪威奥斯陆

B公共卫生实验室服务脑膜炎球菌参比实验室，英国曼彻斯特

C布里斯班医院，现由M.P.Jennings保存，澳大利亚布里斯班的昆士 兰大学微生物学系

实施例4：MBP-HiaNm的表达及部分纯化

构建容许由麦芽糖结合蛋白与HiaNm融合体(MBP-HiaNm)组 成的蛋白质表达的质粒载体，用引物HiaNm-MBPA5’-GGTCGC GGATCCATGAACAAAATATACCGCAT-3’(SEQ ID NO.24)和 HiaNm-MBPB5’-TCACCCAAGCTTAAGCCCTTACCACTGATA AC-3’(SEQ ID NO.25)从MC58中扩增HiaNm以产生质粒 pHiaMBP。这些引物包含脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58的hiaNm的起 始和终止密码子以及便于克隆的工程化限制位点。质粒限制图谱及寡 核苷酸位置示于图1。将所得PCR产物与Bam HI/HindⅢ限制消化的 质粒pMALC2(New England Biolabs)连接，并将所得质粒pHiaMBP (见图1)再导入E.coli菌株DH5α。诱导含有pHiaMBP的E.coli菌 株，以在厂商(New England Biolabs)推荐的条件下表达HiaNm-MBP 融合蛋白。将提取自含pHiaMBP的培养物的细胞提取物经10％SDS -PAGE分离，并根据厂商的指导用微凝胶电洗脱仪(BioRad)经洗 脱部分纯化融合蛋白。用兔抗MBP血清经Western印迹检测含HiaNm -MBP融合蛋白的部分，经SDS-PAGE随后Coomassie染确定 HiaNm-MBP融合蛋白的纯度，并通过BCA分折(Sigma)或在280nm 波长吸收判断回收的蛋白质数量。

实施例5：多克隆血清的产生

将在实施例4中获得的部分纯化的HiaNm-MBP融合蛋白用于 在兔体内产生多克隆血清，将洗脱的HiaNm-MBP融合蛋白的样品 用无菌磷酸盐缓冲的盐水pH7.4(PBS)(Sigma)透析。然后将其与 佐剂(MPL+TDM+CWS，Sigma)以50-150μg/ml浓度混合，并 以两周间隔接种二只新西兰白兔，从这些兔体取血，经在室温下凝血 1小时，在4℃培养过夜随后以4000×rpm在4℃离心以提取血清。除 去上清液并再离心，将血清等分贮存在-80℃。所得血清用于杀菌分 析及Western印迹(如下所示)。

为测试所得血清特异性，进行Western印迹分析，概而言之，将 脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58及MC58△Hianm的蛋白质，在用 Semi-Dry Blotter(BioRad)经电泳转移至硝酸纤维素膜之前，在SDS -PAGE上电泳分离。然后将这些蛋白质在用NBT/BCIP(Sigma)比 检测之前，依次与血清及碱性磷酸酶缀合的抗兔IgG(Sigma)培养。 这些试验表明抗体由HiaNm-MBP融合蛋白激发，其特异于MC58而 非MC58AHiaNm并检测到一条带(见图4)。推导的HiaNm多肽的 推断分子量是62.3KDa。由血清检测的条带以超过150KDa的表观MW 迁移。文献中报导的至少三种同源“自身转运蛋白”的蛋白质也呈现 如此异常迁移：Moraxella catarrhalis的高分子量外膜蛋白UspAl和 UspA2分别具有推定分子量62.5KDa和88.3KDa，但分别以85KDa 和120KDa迁移，以作为UspA复合物以350KDa～720KDa迁移。 (Aebi,C.et al.,1997,Infection and Immunity,65：4367-4377；Klingman,k． L.and Murphy,T.F.,1994,Infiction and Immunity,62：1150-1155)。相 似地，流感嗜血杆菌的Hia具有116KDa的预测分子量，但当在噬菌 体中表达时，Hia以大于200KDa迁移(Barenkamp,S.and St.GemaⅢ, J.1996 Molecular Microbiology 19：1215-1233)。

为证实HiaNm与脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜相关，基本如前述(van der Ley,P.et al.,1991,Infection and Immunity,59：2963-71)制备外膜 复合物(omc)。简而言之，在补加10％加热的马血BHI平板的脑心 浸液琼脂(Acumedia Manufacturer’s Inc)上将细菌生长过夜，在超 声破坏膜之前，将其重悬浮于10mM Tris pH8.0中并热灭活。通过在 10,000×g(rcf，相对离心力)离心除去细胞碎片，并将上清液在50,000 ×g再离心。将粒状沉淀重悬浮于1％ Sarkosyl/10mM Tris pH8.4中。 将含有外膜蛋白的Sarkosyl可溶组分的等份(50μl A280=3.75)如上 所述进行SDS-PAGE及Western印迹，示于图4的结果表明：观测 到抗HiaNm MBP抗血清与野生型MC58而非其中hiaNm已灭活的 MC58△HiaNm的反应性。在MC58培养物中全细胞样品，和含同量 总蛋白的omc样品之间观测到的与抗Hia MBP血清反应性的提高， 与HiaNm的膜结合性一致。

实施例6：杀菌分析

为测定抗HiaMBP抗血清是否含有特异于HiaNm的杀菌抗体，用 野生型MC58和MC58△HiaNm进行杀菌分析。该分析通过由 Hoogerhout等(1995，Infection and Immunity，63：3473～3478)所述分 析加以修改而进行。简而言之，将MC58和MC58HiaNm在37℃在5 ％CO2中在BHI平板上生长过夜。取自此过夜培养物的细菌在悬浮于 1ml PBS中之前，在相同条件下传代培养4-6小时。根据在0.2N NaOH/1％SDS中样品的裂解，以及在波长260nm处的吸收，其中A260 =109cfu/ml计算细菌数。将此细菌悬浮液在PBS中调正至近于 105cfu/ml。将待测试的兔血清在56℃热灭活45分钟，将取自4周龄 新西兰白兔的血清集合，并用作补体来源(Central Animal Breeding House，University of Queensland)。在无菌聚苯乙烯平底96孔微量滴 定板中进行分析，每孔总体积是24μl：12μl在PBS中二倍连续稀释 的血清，及6μl细菌悬浮液(含300～900个细菌)。在加入6μl80 ％的在PBS中的补体(终浓度为20％vol／vol)之前，将血清和细菌 在室温培养10分钟。对照是a)PBS，细菌及补体，b)PBS、细菌和 血清，在加入所有组分并混合之后，将每个对照孔的7μl等份涂布在 BHI平板上，然后将此微量滴定平板在37℃，在5％CO2中培养60分 钟，在培养后，将每孔7μl等份涂布在BHI平板上，然后将所有BHI 平板在37℃在5％CO2中培养14-18小时，并计数细菌菌落。其中至 少90％细菌被杀灭时的最高稀释度倒数被报道为血清杀菌。所用的血 清取自如实施例5所述Western印迹试验的相同兔及相同测试血液。 这些试验平行示出，与野生型菌株MC58相比，抗MC58△HiaNm的 杀伤滴定度降低(约3倍，表4)，这表明抗HiaMBP抗血清含有特 异于HiaNm的杀菌抗体。 表4

                          讨论

在一些病原菌中，重复DNA与毒力决定簇相关。用此重复DNA 基序的Southern印迹揭示在脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58中含此基序 的至少3种基因座的存在(Peak,I.et ak.,1996,FEMS Microbiology Letters，137：109-114)。将这些基因克隆，并对两个这种重复相关的 基因座(nmrep 2和nmrep 3)进行序列分析，揭示有近于670个氨基 酸的开放读框(Jennings,M.et al.,1995,Microbial Pathogenesis,19：391- 407.Peak,I.et al.,Microbial Pathogenesis，出版中)。它们呈彼此同源， 并同源于E.coli粘附素AIDA-I羧基末端。AIDA-I为1286个氨基 酸，其羧基末端区组成了推定的外膜转运结构域，成熟代表的氨基末 端结构域组成了粘附素结构域。氨基末端结构域通过推定的转运结构 域穿过膜并被称为过客结构域。

由于Nmep2和Nmep3与AIDA-I的转运蛋白结构域序列同源， 其被认为形成膜孔，Nmrep2和Nmrep3大约是AIDA-I大小的一半， 并同源于AIDA-I跨膜区。我们假定脑膜炎奈瑟氏球菌中存在与AIDA -I氨基末端同源的基因座，我们在对脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58￠3 测序计划所得数据(TIGR前述)中搜索这种同系物，并发现一与流 感嗜血杆菌菌株Rd(H11732)称为AIDA-I的基因同源的区域，因 为它同源于E.coli的AIDA-I(Fleischmann et al.,1995 Science 269：496-512)。鉴于以上提及的同源性，本申请人决定进一步研究。

通过将相应于来自脑膜炎奈瑟氏球菌MC58 3的名为gnmaa84r 的47l碱基对片段的DNA进行PCR扩增而初步分离基因，并确定序 列。进一步的PCR试验使较大片段被扩增。将这些产物克隆，并如 图1所示进行序列分析，该基因呈与E.coli的AIDA-I的氨基末端区 域的同源性，我们称其为aida3，因此其代表脑膜炎奈瑟氏球菌(具 有nmrep2和nmrep3)中第三个AIDA-I同系物。由此，发现自流 感嗜血杆菌的两个另外基因hia和hsf已被公布(Barenkamp,S.and St. Geme Ⅲ,J.et al.,1996，分子微生物学19：1215-1233,St.Geme Ⅲ,J. 等，1996，细菌学杂志178：6281-6287)，aida 3与其更相似。我们 因而将之重命名为hiaNm(根据Barenkamp及St.Geme Ⅲ之报道，HI 1732，第一个被鉴别为AIDA-I同系物的流感嗜血杆菌基因，也被重 命名为hia)。

通过本发明说明书阐述了本发明优选实施方案，而非限制本发明 至任一实施方案或特征的具体组合。本领域技术人员应知：根据本发 明揭示，在不偏离本发明范围之内，对例举的实施方案可作各种修改 和变动，所有改动均在本发明权利要求范围内。