TUBULYSIN衍生物与细胞结合分子偶联物的制剂配方

TUBULYSIN衍生物与细胞结合分子偶联物的制剂配方

技术领域

本发明申请涉及用于靶向的Tubulysin衍生物与细胞表面受体结合分子偶联形成的偶联物制剂。本发明申请还涉及包含细胞结合分子-Tubulysin衍生物偶联物的组合物在癌症、自免疫系统疾病和感染性疾病上的应用。

技术背景

通过抗体或其他细胞表面受体结合剂将高活性细胞毒物靶向递送至人体中的特定疾病位点，可显著增加细胞毒物的窗口，该疗法已被证明是一种极有前景的靶向方法(Van den Mooter，T.et al Expert Opin Biol Ther. 2015，15，749-60)。尤其是自美国FDA在2011年和2013年分别批准Adcetris (brentuximab vedotin)和Kadcyla(ado-trastuzumab emtansine)上市以来，几乎所有大型制药和生物技术公司都已经应用了抗体-药物偶联物(ADC)技术，靶向癌症(Chari，R.et al，Angew.Chem.，Int.Ed.2014，53，3796-3827； Sievers，E.L.et al.Annu Rev Med.2013，64，15-29；Mehrling，T.Future Oncol，2015，11，549)。到目前为止，临床上大多数ADC都使用强效的微观蛋白作用剂，如美登素或澳瑞他汀类药物。少数ADC使用其他强效效应分子，如拓扑异构酶1抑制剂SN-38或DNA相互作用剂，如卡奇霉素和吡咯并苯二氮卓类(Anderl，J.et al，Methods Mol Biol.2013；1045：51-70；Thomas，A.，et al，Lancet Oncol.2016Jun；17(6)：e254-e262)。

人们从自然界分离出一些具有生物活性的短链肽化合物，其中包括 Tubulysin类(结构如下图)。Tubulysin最初由Hofle和Reichenbach等(GBF Braunschweig)从Archangium gephyra的myxobacterial菌株的培养基里分离出来 (F.Sasse etal.J.Antibiot.2000，53，879-885；WO9813375)。Tubulysin是一种抗有丝分裂肽，它能够在细胞分裂过程中抑制微管蛋白的聚合，并因而诱发细胞凋亡。它们的活性突出，优于vinblastine，taxol和epothilones(Wipf， et al，Org.Lett.2004，6，4057–60；Peltier，etal，J.Am.Chem.Soc.2006， 128，16018-9；Wipf，et al，Org.Lett.，2007，9，1605–1607；Wang，et al，Chem.Biol.Drug Des.2007，70，75-86；Pando，et al，Org.Lett.2009， 11，5567-9)，因此是可用于靶向的极具潜力的先导化合物。从结构上来讲，Tubulysin由四个肽键构成，这包括N端的N-甲基酸(Mep)，第二个氨基酸异亮氨酸(Ile)，第三个独特的包含噻唑的tubuvaline氨基酸(Tuv)，以及C端的两种可能的氨基酸tubutyrisine(Tut)或tubuphenylalanine (Tup)。

Tubulysin Rⁱ Rⁱⁱ Rⁱⁱⁱ A CH₂OCOCH₂CH(CH₃)₂ OCOCH₃ OH B CH₂OCOCH₂CH₂CH₃ OCOCH₃ OH C CH₂OCOCH₂CH₃ OCOCH₃ OH D CH₂OCOCH₂CH(CH₃)₂ OCOCH₃ H E CH₂OCOCH₂CH₂CH₃ OCOCH₃ H F CH₂OCOCH₂CH₃ OCOCH₃ H G CH₂OCOCH＝CH₂ OCOCH₃ OH H CH₂OCOCH₃ OCOCH₃ H I CH₂OCOCH₃ OCOCH₃ OH U H OCOCH₃ H V H OH H Z H OH OH Pretubulysin CH₃ H H

目前，虽然已经有一些tubulysin化合物被合成出来，但在剂量达到所需要的效果时，它们都产生出了明显的毒性作用(>20％的体重减轻)(美国专利号2010/0048490)。我们一直在致力于研制细胞表面结合分子，尤其是抗体与tubulysin衍生物的偶联物，以达到所需要的效果，又能显著降低毒副作用。天然的tubulysin化合物具有极强的活性，对许多细胞系的IC50在10pM以下，是理想的ADC药物载荷。但是我们发现，天然tubulysin的偶联物在动物体内几乎不能被代谢，因此产生严重的肝脏毒性。简单一些的Tubulysin同系物，例如在天然tubulysin结构的最左端，用2-(二甲基氨基)-2-甲基丙酸取代1-甲基-2-酸后，所得化合物偶联抗体后，活性并未改变太多，但肝脏毒性明显降低。

由于抗体-药物偶联物和其他基于蛋白质的大分子和复杂分子可以被消化系统破坏，所以不宜口服，通常以肠道外给药，例如静脉或皮下注射等。因此，这些基于蛋白质的药物必须以液体形式给药。但是，ADC和许多其他复杂蛋白大分子在水相环境中的稳定性通常很差，这可能会降低药物的保质期，使其市场价值大大降低。因此，就稳定性，储存性和运输的便利性而言，将ADC组药物合物制备为固体的形式可能更为合适，可以在对患者给药前用溶剂复溶后再给药。蛋白质药物的固体形式包括粉剂、冷冻剂、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、真空干燥或超临界流体干燥的制剂。

本专利申请公开了tubulysin衍生物与细胞表面结合配体偶联物的制剂配方，具有更持久的稳定性和良好的储存性，同时也更易于运输，使用时，在给药前不久用水复溶即可。

发明概述

本专利申请适于冻干的液体，冻干制剂或者冻干粉复溶后的制剂包含如下组分：式(I)中的偶联物为主要成分，重量占比0.01％-99％，0.0％-20.0％的一种或多种多元醇；0.0％-2.0％的一种或多种表面活性剂；0.0％-5.0％的一种或多种防腐剂；0.0％-30％的一种或多种氨基酸；0.0％-5.0％的一种或多种抗氧化剂；0.0％-0.3％的一种或多种金属螯合剂；0.0％～30.0％用于调节pH值在4.5～ 7.5之间的一种或多种缓冲盐；0.0％-30.0％一种或多种等渗剂，病人给药前将药物复溶，可使渗透压保持为250至350mOsm。

在一个示例中，tubulysin偶联物具有如式(I)的结构：

或其药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶型晶体结构；或其同位素，旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；

其中T为靶向或结合配体；L是可释放的连接子；-----是连接键，L独立地连接到括号内的原子；n为1-20，m为1-10；

括号内是有效的tubulysin衍生物，其中R1、R2、R3、和R4独立地为C1-C8直链或支链烷基、烷基醇；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基、烷基醚、羧酸烷基酯、烷基胺、烷基酯、烷基酰胺；C3-C8芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基；或两个R：R1R2、R3R4、R5R6、或 R12R13独立地形成3～7元的碳环、环烷基、杂环、杂环烷基、芳基或杂芳基环；Y为N或C；另外，R1、R2、R3、和R4可以独立地缺省；

其中R5、R6、R8和R10独立地选自H，直链或支链的C1-C4烷基或C2-C4杂烷基；

其中R7选自H、R14或-R14C(＝O)X1R15；或-R14X1R15；X1选自O、S、 S-S、NH、或者NR14；

其中R9为H、-O-、-OR14、-OC(＝O)R14-、-OC(＝O)NHR14-、-OC (＝O)NR14R15-、-OC(＝O)R14SSR15-、OP(＝O)(OR14)-或OR14OP (＝O)(OR15)；

其中R11为H、R14、-R14C(＝O)R16、-R14C(＝O)X2R16、-R14X2R16、- R14C(＝O)X2、其中X2为-O-、-S-、-NH-、-NHS(O2)、-N(R14)-、-O-R14- 、-S-R14-、-S(＝O)-R14-或-NHR14-；

其中R12为H、R14、-O-、-S-、-N-、＝N-、＝NNH-、-OH、-SH、-NH2、＝NH、＝NNH2、-NH(R14)、-OR14、-C(O)O-、-C(O)OR16-、-COR16、- COOR14-、C(O)NH-、C(O)NH2、C(O)NHR14、-SR14、-S(＝O)R14、-P (＝O)(OR16)2、-OP(＝O)(OR16)2、-CH2OP(＝O)(OR16)2、- SO2R16；

其中R13为C1-C10直链或支链烷基、烷基酸、烷基酰胺、烷基胺；或C2- C10杂烷基；或C3-C10芳基；Ar是指由一个或几个环组成的芳基或杂芳基、包含4至10个碳原子、优选地包含4至6个碳原子。术语杂芳基是指具有一个或多个碳原子被杂原子取代、优选地一个，两个或三个碳原子被O、N、Si、Se、 P或S取代，更优选地被O、S、N取代的芳基。术语芳基或Ar也指其中一个或几个H原子独立地被R17、F、Cl、Br、I、OR16、SR16、NR16R17、N＝NR16、 N＝R16、NR16R17、NO2、SOR16R17、SO2R16、SO3R16、OSO3R16、PR16R17、 POR16R17、PO2R16R17、OP(O)(OR17)2、OCH2OP(O)(OR17)2、OC (O)OP(O)(OR17)2、PO(OR16)(OR17)、OP(O)(OR17)OP(O) (OR17)2、OC(O)R17或OC(O)NHR17取代的芳基；

其中R14和R15独立地为H；C1-C8直链或支链烷基；C2-C8烯基、炔基、杂烷基、杂环、碳环；C3-C8芳基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂芳烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基；

其中R14为二价时，R14进一步地与1至4个氨基酸单元或(CH2CH2O)r，r为 0至12的整数，或C4-C12糖苷，或C1-C8羧酸的官能团连接；

其中R16为H、OH、R14或1-4个氨基酸单元；

其中R17为H、C1-C8直链或支链烷基；C2-C8烯基、炔基、杂烷基、杂环；C3-C8芳基、碳环、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂烷基环烷基、杂芳烷基、烷基羟基或C4-C12糖苷，或药学上可用的盐。

在另一个实施例中，Tubulysin衍生物与结合分子的连接子L具有下式结构：--Ww-(Aa)r-Vv-；其中：--W--是延展体单元；w是0或1；每个-Aa-独立地是一个氨基酸单元；r独立地是0至12的整数；--V--是一个间隔体单元； v为0、1或2。延展体单元W独立地可包含自毁灭间隔体，肽单元，腙键，二硫键或硫醚键。

在另一个实施方案中，细胞表面结合分子T可以是任何种类目前已知或即将被知的细胞结合配体，例如肽和非肽。通常，结合分子T是抗体；单链抗体；与靶细胞结合的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、结合靶细胞的单克隆抗体片段、嵌合抗体、结合靶细胞的嵌合抗体片段、结构域抗体、结合靶细胞的结构域抗体片段、adnectin类抗体、DARPins、淋巴因子、激素、维生素、生长因子、集落刺激因子、营养转运分子(转铁蛋白)以及结合在白蛋白、聚合物、树状大分子、脂质体、纳米颗粒、囊泡或(病毒)衣壳上的细胞结合肽、蛋白质或小分子。优选地结合分子T是单克隆抗体。

在另一方面，式(I)及式(II)-(VII)中的组合物可用于人或动物的癌症，自身免疫性疾病或感染性疾病。

发明内容

定义

“烷基”是指在烷烃上除去一个或两个氢原子而产生的脂肪烃基团或单价基团。它可以是直链或是支链的，在链中具有C1-C8(1-8个碳原子)。“支链”是指直链烷基上连接有一个或多个低碳数的烷基，如甲基、乙基或丙基。示例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基、辛基、壬基、癸基、环戊基、环己基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、 2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2，3，4-三甲基戊基、3-甲基-己基、2，2-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、3，5-二甲基己基、2，4-二甲基戊基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、正庚基、异庚基、正辛基和异辛基。C1-C8烷基可以是未被取代的或被一个或多个基团取代，包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C (O)OR'、-C(O)NH2，-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、- SR'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R') 2和-CN；其中每个R'独立地选自于-C1-C8烷基和芳基。

“卤素”指氟、氯、溴或碘原子；优选氟和氯原子。

“杂烷基”指其中1至4个碳原子独立地被选自O、S和N的杂原子所取代的C2- C8烷基。

“碳环”指含有3到8个碳原子的饱和或不饱和单环，或含有7到13个碳原子的饱和或不饱和双环。单环碳环有3到6个环原子，典型的有5或6个环原子。双环碳环有7到12个环原子，构成[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]的双环系统，或有 9个或10个环原子，构成[5、6]或[6，6]的双环系统。具有代表性的C3-C8的碳环包括但不限于：-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环戊二烯基、-环己基、-环己烯基、-1，3-环己二烯基、-1，4-环己二烯基、-环庚基、-1，3-环庚二烯基、-1， 3，5-环庚三烯基、-环辛基和-环辛二烯基。

C3-C8碳环可以是未被取代的或被一个或多个基团取代，包括但不限于-C1- C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O) OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、- S(O)R'、-S(O)2R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中每个R'独立地选自-C1-C8烷基和芳基。

“烯基”指含有碳-碳双键的直链或支链脂肪烃基团，链内含有2-8个碳原子。示例性的烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基。

“炔基”指含有碳-碳三键的直链或支链脂肪烃基团，链内含有2-8个碳原子。示例性的炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、5-戊炔基、正戊炔基、己炔基、庚炔基和辛炔基。

“亚烷基”是指含1-18个碳原子的饱和的支炼或直链或环状烃基，并带有两个通过从母体烷烃的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子而产生的一价自由基。典型的亚烷基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1，2-乙基(-CH2CH2-)、 1，3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。

“亚炔基”指含2-18个碳原子的不饱和的支炼或直链或环状烃基，并带有两个通过从母体炔的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子而产生的一价自由基。典型的亚炔基包括但不限于：乙炔、炔丙基和4-戊炔基。

“炔基”指含有碳-碳三键的直链或支链脂肪烃基团，链内含有2-8个碳原子。示例性的炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、5-戊炔基、正戊炔基、己炔基、庚炔基和辛炔基。

“芳基”或“芳香基”指由一个或多个环组成的芳香或杂芳香基团，包含三至十四个碳原子，优选六至十个碳原子。术语“杂芳香基团”是指芳香基团上的一个或几个碳，最优是一个、两个、三个或四个碳原子，被氧(O)、氮(N)、硅 (Si)、硒(Se)、磷(P)或(S)所取代，优选被氧、硫和氮所取代而产生的基团。术语“芳基”或“芳香基”也指其中一个或几个氢原子独立地被-R’、卤素、-OR’，-SR’、-NR’R”、-N＝NR’、-N＝R’、-NR’R”、-NO2、-S(O)R’、-S (O)2R’、-S(O)2OR’、-OS(O)2OR’、-PR’R”、-P(O)R’R”、-P (OR’)(OR”)、-P(O)(OR’)(OR”)或-OP(O)(OR’)(OR”)所取代而产生的芳香基团。其中R’和R”独立地为氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、芳烷基、羰基或其药用盐。

“杂环”指其中一到四个环碳原子独立地被O、N、S、Se、B、Si或P等杂原子所取代而产生的的环结构。优选的杂原子是O、N和S。在《化学与物理手册》第78版的225-226页(TheHandbook of Chemistry and Physics，78th Edition， CRC Press，Inc.，1997-1998，p.225to 226)上也有杂环化合物的相关描述，在此引作参考。优选的非芳基杂环包括环氧基、氮丙啶基、硫杂丙基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、环氧乙烷基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢吡喃基、二噁烷基、二氧戊环基、呱啶基、呱嗪基、吗啉基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氢噻喃基、二噻烷基、硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、四氢嘧啶基、二氢噻喃基、氮杂环庚烷基，以及上述基团与苯基缩合得到的稠环体系。

术语“杂芳基”或“芳基杂环”是指含3到14，优选5至10个原子的芳香性杂环、包含单环、双环或多环。示例包括吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4-噻二唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯并咪唑基、异恶唑基、吡啶基-N-氧化物，以及上述基团与苯基缩合得到的稠环体系。

“烷基”、“环烷基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”、“杂芳基”、“杂环”等也指相应的去除两个氢原子而形成的“亚烷基”、“环亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”等。。

“芳烷基”指烷基上一个与碳原子(通常为末端或sp3碳原子)连接的氢原子被芳基取代而得到的一类非环烷基。典型的芳烷基包括芐基、2-苯基乙-1-基、2- 苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙-1-基、萘并芐基、2-萘基苯基-1-基等。

“杂芳烷基”指烷基上一个与碳原子(通常为末端或sp3碳原子)连接的氢原子被杂芳基取代而得到的一类非环烷基。杂芳烷基的实例有2-苯并咪唑基甲基、 2-呋喃基乙基。

“羟基保护基”的实例包括甲氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、四氢吡喃基醚、芐基醚、对甲氧基芐基醚、三甲基甲硅醚、三乙基硅醚、三异丙基硅醚、叔丁基二甲基硅醚、三苯基甲基硅醚、乙酸酯、取代乙酸酯、特戊酸酯、苯甲酸酯、甲磺酸酯和对甲苯磺酸酯。

“离去基团”指可以被另一个官能团取代的官能团。这些离去基团是本领域公知的，实例包括卤化物(如氯化物、溴化物和碘化物)、甲磺酰基、对甲苯磺酰基和三氟甲磺酰基。优选的离去基团选自硝基苯酚基、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、苯酚基、二硝基苯酚基、五氟苯酚基、四氟苯酚基、二氟苯酚基、一氟苯酚基、基、三氟甲磺酰基、咪唑基、氯酚基、四氯苯酚基、1-羟基苯并三唑基、甲苯磺酰基、甲磺酰基、2-乙基-5-苯基异恶唑-3'-磺酰基，酸酐或与其它酸酐作用形成的酸酐，例如乙酸酐、甲酸酐、或与多肽缩合试剂、Mitsunobu反应试剂作用生成的中间体。

以下缩写为本发明所采用，其定义为：Boc，叔丁氧基羰基、BroP，溴代十四烷基鏻六氟磷酸盐；CDI，1，1'-羰基二咪唑；DCC，二环己基碳二亚胺； DCE，二氯乙烷；DCM，二氯甲烷；DEAD，偶氮二甲酸二乙酯；DIAD，偶氮二甲酸二异丙基酯；DIBAL-H，二异丁基氢化铝；DIPEA或DEA，二异丙基乙胺；DEPC，二基磷酸酯；DMA，N，N-二甲基乙酰胺；DMAP，4-(N，N-二甲基氨基)吡啶；DMF，N，N-二甲基甲酰胺；DMSO，二甲基亚砜；DTPA，二亚乙基三胺五乙酸；DTT，二硫苏糖醇；EDC，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；ESI-MS，电喷雾质谱；乙酸乙酯，乙酸乙酯；Fmoc，N-(9-芴基甲氧基羰基)；HATU，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)- N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐；HOBt，1-羟基苯并三唑；HPLC，高效液相谱；NHS，N-羟基琥珀酰亚胺；MeCN，乙腈；MeOH，甲醇；MMP，4-甲基吗啉；PAB，对氨基苯甲酸；PBS，磷酸盐缓冲液(pH 7.0-7.5)；Ph，苯基；Phe，L-苯丙氨酸；PyBrop，溴-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸盐；PEG，聚乙二醇；SEC，尺寸排阻谱；TCEP，三(2-羧乙基)膦；TFA，三氟乙酸； THF，四氢呋喃；Val，缬氨酸；TLC，薄层谱；UV紫外线。

“氨基酸”可以是天然或非天然的，优选α-氨基酸。天然氨基酸由基因所编码，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、氨酸和缬氨酸。非天然氨基酸是蛋白质氨基酸的衍生物，包括羟脯氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸(神经递质)、鸟氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸(3-氨基丙酸)、γ-羧基谷氨酸、硒代半胱氨酸(存在于许多非真核以及大多数真核细胞中、但不是由DNA 直接进行编码)、吡咯赖氨酸(仅在一些古细菌和一种细菌中发现)、N-甲酰基甲硫氨酸(通常是细菌、线粒体和叶绿体中蛋白质中最初的氨基酸)、5-羟氨酸、L-二羟基苯丙氨酸、三碘甲腺原氨酸、L-3，4-二羟基苯丙氨酸 (DOPA)和O-磷酸丝氨酸。术语“氨基酸”还包括氨基酸衍生物和模拟物。衍生物是具有与天然氨基酸相同结构通式H2N(R)CHCO2H的化合物，其中R在天然氨基酸里未能发现。衍生物的实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、3-氨基丙酸、4- 氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、甲硫氨酸-亚砜和甲硫氨酸甲基锍。更优的是氨基酸模拟物，它是具有与α-氨基酸的化学结构不同、但是功能类似的化合物。天然氨基酸多为“L”立体化学构型，“非天然氨基酸”为“D”构型的氨基酸。在本专利申请中使用1至8个氨基酸时、其序列优选为蛋白水解酶可识别的序列。许多水解酶可识别序列是本领域已知的，可以参见：Matayoshi 等，Science 247：954(1990)；Dunn等，Meth.Enzymol.241：254 (1994)；Seidah等，Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth. Enzymol.244：615(1994)；Weber等，Meth.Enzymol.244：595(1994)； Smith等，Meth.Enzymol.244：412(1994)及Bouvier等，Meth.Enzymol. 248：614(1995)；此处引作参考。特别是选自以下序列：Val-Cit、Ala- Val、Ala-Ala、Val-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Cit-Cit、Val-Lys、Ala-Ala-Asn、Asp-Lys、Asp-Glu、Glu-Lys、Lys、Cit、Ser及 Glu。。

“糖苷”是糖通过糖苷键在其异头碳上与另一基团键合得到的分子。糖苷可以通过O-、N-、S-或C-糖苷键连接，分别产生O-糖苷、糖基胺、硫代糖苷和C-糖苷。其结构式为Cm(H2O)n(其中m可以不同于n，m、n<36)。本发明中的糖苷包括葡萄糖(右旋糖)、果糖(左旋糖)、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、半乳糖胺、氨基葡萄糖、唾液酸、N-乙酰氨基葡萄糖、磺基奎诺糖(6-脱氧-6-磺基-D-吡喃葡萄糖)、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、山梨糖醇、甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、麦芽糖糊精、棉子糖、葡萄糖醛酸(葡糖苷酸)和水苏糖。它可以是D或L的构型、5原子环状呋喃糖的形式、6原子环状吡喃糖的形式，或是非环形式、α-异构体(异头碳的-OH在Haworth投影碳原子平面之下)、或β-异构体(异头碳的-OH在 Haworth投影碳原子平面之上)，包括单糖、二糖、多元醇或含3-6个糖单元的低聚糖。

本发明申请中的“抗体”指全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，如含有抗原结合位点的分子，该结合位点免疫特异性地与靶标抗原或部分靶标抗原结合，靶标包括但不限于，癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自免疫抗体的细胞。本发明中的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白的任何类型 (例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA1和IgA2)或子类。免疫球蛋白可以来自任何物种，但优选的免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。本发明的抗体优选是单克隆抗体，包括但不限于多克隆、单克隆、双特异性、人、人源化或嵌合抗体，单链抗体，Fv、Fab片段、F (ab')片段、F(ab')2片段、由Fab表达库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体，CDR和任何能免疫特异性地结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述结构的表位结合片段。

“对映异构体”，也称为“光学异构体”，是两个立体异构体中的一个，它们是彼此的镜像，不可重迭(不等同)，就像人的左右手，除非沿着某一平面被翻转，它们是不可重迭的(仅通过改变方向不能让双手重迭)。化合物中的单个手性原子或类似的结构特征使得该化合物具有两种可能的结构，它们不可重迭，是彼此的镜像。在某一化合物中存在的多个手性特征增加了可能存在的构型的数目，其中可能会有一些互为镜像。对映体纯的化合物是指在检测方法的能力范围内，仅具有同一种手性的样品。在对称的环境中，两个对映体可以使平面偏振光(+/-)在相反的方向上等量旋转(偏振光可以被认为是不对称的介质)，除此之外，它们具有相同的化学性质和物理性质。由于这个原因，它们有时也被称为光学异构体。光学异构体及其等量的对映体的混合物被称为外消旋体，它对平面偏振光无净旋转，因为每个正旋转(+)都被负旋转(-)完全抵消。通常两个对映异构体与其他的对映异构体物质发生不同的化学反应。由于许多生物分子是对映体，因此有时两种对映体对生物有机体的影响存在显著差异。例如，在药物中，通常只有一种对映体可以发生想要的生理作用，而另一种对映体或是活性较低、或无活性，有时甚至产生不良反应。基于这样的发现，可以开发仅由一种对映体(“对映体纯”)组成的药物以增强药理学效力，有时还可以消除一些副作用。

同位素是特定化学元素的质子数相同，中子数不同的不同核素。同一元素的所有同位素具有相同数量的质子。一个原子序数指定一个特定的元素，但非同位素；特定元素原子可以有不同的中子数。核子(质子和中子)的数量是原子的质量数，特定元素的每个同位素具有不同的质量数。例如、碳-12、碳-13和碳-14是碳元素的三种同位素，质量数分别为12，13和14。碳的原子序数为 6，意味着每个碳原子都有6个质子，因此这些同位素的中子数分别为6、7和 8。氢原子有三种同位素：氕(1H)、氘(2H)和氚(3H)，氘的质量是氕的两倍，氚的质量是氕的三倍。通过动力学同位素效应，同位素替代实验可用于确定化学反应的机理。同位素替代实验还可用于研究外源化合物通过吸收和分布机制进入体内后，身体如何对它产生作用，体内物质的代谢变化(例如通过细胞素P450或葡萄糖醛酸转移酶等代谢酶的作用)，以及药物代谢产物的排泄途径，是为药代动力学(PK)研究。同位素替代实验可用于研究药物的生化和生理作用，包括在动物(包括人类)、微生物或生物组合上所显现出来的作用(例如感染)，是为药效学(PD)研究。两者(PK和PD)一起决定药物的剂量、益处及副作用。同位素可以采用一种稳定的(非放射性的)或非稳定的元素。药物的同位素取代物还可能具有与原始药物不同的功效。

“药学上可接受的溶剂化物”或“溶剂化物”是指一种或多种溶剂分子与本发明公开的化合物的结合物。形成药学上可接受的溶剂合物的溶剂的实例，包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。

“药学上可接受的辅料”包括任何载体、稀释剂、佐剂或其它介质，例如防腐剂或抗氧化剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和药剂与药物活性物质一起使用在本领域内是熟知的。任何传统介质或药剂，除非与活性成分不兼容，也可以考虑将其用于组合物中。补充活性成分也可以加入组合物中，成为合适的组合。

本发明中，“药用盐”是指此处公开化合物的衍生物，是母体化合物的酸盐或碱盐。药学上可接受的盐包括由无毒无机酸或有机酸与母体化合物形成的常规无毒盐或季铵盐。例如，所述常规无毒盐包括衍生自无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等)的盐；以及由有机酸，例如乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、马来酸及乳酸等制备的盐。另外的盐包括铵盐，如三甲胺、葡甲胺、丙三醇等的盐、金属盐、如钠、钾、钙、锌或镁盐。

本发明中的药用盐可以从包含酸性或碱性片段的母体化合物，用常规的化学方法制成。一般地说，这些盐可以通过在本发明化合物的游离酸或碱的水溶液或有机溶液或两者的混合溶液中，加入其它适当的等eq.的碱或酸而形成。非水相的反应介质一般为乙醚，乙酸乙酯，乙醇，异丙醇或者乙腈。可以适用盐的列表可参见《Remington’sPharmaceutical Sciences》，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，第1418页。

“施用”或“给药”是指以任何方式向受试者转移、递送、引入或运输药物或其他药剂。这些方式包括口服用药、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鼻内、皮下或鞘内给药。本发明还考虑使用装置或器械来施用药剂。这种装置可以使用主动或被动型传输，而且可以是缓释或快速释放递送装置。

就癌症而言，术语“”包括以下任何一项或全部：阻止肿瘤细胞或癌细胞生长、复制，减轻整体肿瘤量，以及改善与该疾病相关的一个或多个症状。

就自身免疫性疾病而言，术语“”包括以下任一项或全部：阻止与自身免疫性疾病相关的细胞的复制，包括但不限于能够产生自身免疫性抗体的细胞，减轻自身免疫性抗体量和改善自身免疫性疾病的一个或多个症状。

就传染病而言、术语“”包括以下任何一项或全部：阻止引起传染病的病原体的生长、增殖或复制、以及改善传染病的一个或多个症状。

“哺乳动物”或“动物”的实例包括但不限于人、鼠、家鼠、豚鼠、猴、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和家禽。

含有细胞结合配体与Tubulysin衍生物的偶联物的组合物

如上所述，本发明提供了适于冻干的液体，冻干制剂或者冻干粉复溶后的制剂包含如下组分：式(I)中的tubulysin衍生物偶联物为主要成分，重量占比 0.01％-99％，0.0％-20.0％的一种或多种多元醇；0.0％-2.0％的一种或多种表面活性剂；0.0％-5.0％的一种或多种防腐剂；0.0％-30％的一种或多种氨基酸；0.0％ -5.0％的一种或多种抗氧化剂；0.0％-0.3％的一种或多种金属螯合剂；0.0％～ 30.0％用于调节pH值在4.5～7.5之间的一种或多种缓冲盐；0.0％-30.0％一种或多种等渗剂，病人给药前将药物复溶，可使渗透压保持为250至350mOsm。

其中式(I)的tubulysin衍生物偶联物如下所示：

或其药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶型晶体结构；或其同位素，旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；

其中T为靶向或结合配体；L是可释放的连接子；-----是连接键，L独立地连接到括号内的原子；n为1-20，m为1-10；

括号内是有效的tubulysin衍生物，其中R1、R2、R3和R4独立地为C1-C8直链或支链烷基、烷基醇；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基、烷基醚、羧酸烷基酯、烷基胺、烷基酯、烷基酰胺；C3-C8芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基；或两个R：R1R2、R3R4、R5R6、或R12R13独立地形成3～7元的碳环、环烷基、杂环、杂环烷基、芳基或杂芳基环；Y为N或C；另外，R1、R2、R3、和R4可以独立地缺省；

其中R5、R6、R8和R10独立地选自H，直链或支链的C1-C4烷基或C2-C4杂烷基；

其中R7选自H、R14或-R14C(＝O)X1R15；或-R14X1R15；X1选自O、S、 S-S、NH、或者NR14；

其中R9为H、-O-、-OR14、-OC(＝O)R14-、-OC(＝O)NHR14-、-OC (＝O)NR14R15-、-OC(＝O)R14SSR15-、OP(＝O)(OR14)-或OR14OP (＝O)(OR15)；

其中R11为H、R14、-R14C(＝O)R16、-R14C(＝O)X2R16、-R14X2R16、- R14C(＝O)X2、其中X2为-O-、-S-、-NH-、-NHS(O2)、-N(R14)-、-O-R14- 、-S-R14-、-S(＝O)-R14-或-NHR14-；

其中R12为H、R14、-O-、-S-、-N-、＝N-、＝NNH-、-OH、-SH、-NH2、＝NH、＝NNH2、-NH(R14)、-OR14、-C(O)O-、-C(O)OR16-、-COR16、- COOR14-、C(O)NH-、C(O)NH2、C(O)NHR14、-SR14、-S(＝O)R14、-P (＝O)(OR16)2、-OP(＝O)(OR16)2、-CH2OP(＝O)(OR16)2、- SO2R16；

其中R13为C1-C10直链或支链烷基、烷基酸、烷基酰胺、烷基胺；或C2- C10杂烷基；或C3-C10芳基；Ar是指由一个或几个环组成的芳基或杂芳基、包含4至10个碳原子、优选地包含4至6个碳原子。术语杂芳基是指具有一个或多个碳原子被杂原子取代、优选地一个、两个或三个碳原子被O、N、Si、Se、 P或S取代、更优选地被O、S、N取代的芳基。术语芳基或Ar也指其中一个或几个H原子独立地被R17、F、Cl、Br、I、OR16、SR16、NR16R17、N＝NR16、 N＝R16、NR16R17、NO2、SOR16R17、SO2R16、SO3R16、OSO3R16、PR16R17、 POR16R17、PO2R16R17、OP(O)(OR17)2、OCH2OP(O)(OR17)2、OC (O)OP(O)(OR17)2、PO(OR16)(OR17)、OP(O)(OR17)OP(O) (OR17)2、OC(O)R17或OC(O)NHR17取代的芳基；

其中R14和R15独立地为H；C1-C8直链或支链烷基；C2-C8烯基、炔基、杂烷基、杂环、碳环；C3-C8芳基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂芳烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基；

其中R14为二价时，R14进一步地与1至4个氨基酸单元或(CH2CH2O)r， r为0至12的整数，或C4-C12糖苷，或C1-C8羧酸的官能团连接；

其中R16为H、OH、R14或1-4个氨基酸单元；

其中R17为H、C1-C8直链或支链烷基；C2-C8烯基、炔基、杂烷基、杂环；C3-C8芳基、碳环、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂烷基环烷基、杂芳烷基、烷基羟基或C4-C12糖苷，或药学上可用的盐；

其中当R13为下列基团时，R1R3共同形成C3-C7杂环或烷基杂环：

其中Z1为H、CH2OP(O)(OR18)2、C(O)OP(O)(OR18)2、PO (OR18)2、C(O)R18、P(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、C(O) NHR18、SO2(OR18)、C5-C12糖苷或C1-C4烷基或烷基羰基；R18为H、C1-C8烷基或烷基羰基；R19为H、OH、NH2、OSO2(OR18)、XCH2OP(O) (OR18)2、XPO(OR18)2、XC(O)OP(O)(OR18)2、XC(O)R18、XC(O)NHR18、C1-C4烷基、烷基羰基、羧酸或药学上可用的盐；X为O、S 或NH；Y1和Y2独立地为N或CH；是碳原子的连接点；

其中用于制剂的合适缓冲液包括但不限于，有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的钠、钾、铵或三羟乙基氨基盐，氨基丁三醇盐酸、硫酸或磷酸缓冲液。此外，氨基酸阳离子也可用作缓冲液。这些氨基酸包括但不限于，精氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸和组氨酸。精氨酸缓冲液包括精氨酸乙酸盐、精氨酸氯化物、精氨酸磷酸盐、精氨酸硫酸盐，精氨酸琥珀酸盐等。在一个实施例中，精氨酸缓冲液是精氨酸乙酸盐。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸氯化物-精氨酸氯化物、组氨酸乙酸盐- 精氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐-精氨酸磷酸盐、组氨酸硫酸盐-精氨酸硫酸盐、组氨酸琥珀酸盐-精氨酸琥珀酸盐等。缓冲液的pH是4.5至pH8.5，优选约4.5至约7.0，更优选约5.0至约6.2。在一些实施例中，缓冲液中有机酸盐的浓度为约 10mM至约500mM。

其中在制剂中可选地含有的“多元醇”是具有多个羟基的物质。多元醇可用作液体和冻干制剂中的稳定辅料和/或等渗剂。多元醇可以保护生物药物免受物理和化学降解。最好能被排除的共溶剂增加了蛋白质接口处溶剂的有效表面张力，能量最有利的结构构像是表面积最小的那些溶剂。多元醇包括糖(还原和非还原糖)、糖醇和糖酸。“还原糖”是指含有半缩醛基团的糖，它能够还原金属离子，或与蛋白质中的赖氨酸和其他氨基发生反应，“非还原糖”是指不具有还原糖性质的糖。还原糖的例子有果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松解糖和棉子糖。糖醇选自甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇、苏糖醇、山梨醇和甘油。糖酸包括L-葡萄糖酸盐及其金属盐。液体配方或冻干制剂中的多元醇含量，按重量计，为0.0％-20％。在配方中优选浓度约为0.1％到15％的非还原糖，蔗糖或海藻糖，其中由于海藻糖的溶液稳定性，海藻糖更优。

其中在制剂中可选的表面活性剂可选自聚山梨醇酯(聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85 等)；泊洛沙姆(如泊洛沙姆188、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)、泊洛沙姆407或聚丙二醇-丙二醇等)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基磺基甜菜碱；十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基肌氨酸；亚油酸、肉荳蔻基或十六烷基甜菜碱；月桂酰氨基丙基、椰油酰胺丙基、亚油酰胺丙基、肉荳蔻酰基丙基、棕榈酰基丙基或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉荳蔻酰胺丙基、棕榈酰丙基或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油酰基钠或甲基油基牛磺酸二钠；十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱和可可两性甘氨酸酯；MONAQUATTM系列(如异硬脂基乙基亚胺鎓乙基硫酸盐)；聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物(如Pluronic、PF68 等)。优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，如聚山梨醇酯20、 40、60或80(Tween20、40、60或80)。制剂中表面活性剂的浓度范围，按照重量计，为0.0％至约2.0％。在某些特定实施例中，表面活性剂浓度为约0.01％至约0.2％。在一个实施例中，表面活性剂浓度为约0.02％。

其中在制剂中可选的“防腐剂”是从根本上可以减小其中细菌的化合物。防腐剂的实例包括十八烷基二甲基芐基氯化铵、六甲基氯化铵、苯扎氯铵(烷基芐基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链烷基)和芐索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇如苯酚，丁基和芐基醇，对羟基苯甲酸烷基酯，如甲酯或丙酯，儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。液体配方或冻干粉末中的防腐剂含量，按照重量计，为0.0％-5.0％。在一个实施例中，所用防腐剂是苯甲醇。

其中在制剂中作为填充物质或张力剂或渗透压调节剂的，合适的游离氨基酸，选自但不限于精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸谷氨酸或天冬氨酸中的一种或多种。优选碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。如果组成中包含组氨酸，它可以充当缓冲剂和游离氨基酸，但是当使用组氨酸缓冲液时，通常还要包含一个非组氨酸的游离氨基酸，如赖氨酸。氨基酸可以以D-和/或L-型存在，但L-型比较常见。氨基酸可以任何合适的盐的形式存在，如精氨酸盐酸盐。液体配方或冻干粉末中的氨基酸含量，以重量计，为0.0％-30％。

其中制剂中的抗氧化剂可以任选自蛋氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸或抗坏血酸，其在液体制剂中的浓度最高为约5mg/ml，或者在配制的冻干粉末中的含量，以重量计，为0.0wt％至5.0wt％；

其中制剂任选自含金属螯合剂，例如EDTA，EGTA等，在液体配方中浓度为约2mM，在冻干粉末中的含量，以重量计，为0.0％-0.3％。

最终的制剂可以用缓冲调节剂(如一种酸，包括HCl、H2SO4、乙酸， H3PO4、柠檬酸等，或是碱，如NaOH、KOH、NH4OH、乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸三钠、氨基丁三醇等)调节至优选的pH 值。制剂还应当被调节至“等渗”，即目标制剂具有与人血基本相同的渗透压。等渗制剂渗透压通常为250至350mOsm。可以使用蒸气压或冰冻型渗透压计测量等渗性。等渗剂选自甘露醇、山梨糖醇、乙酸钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸三钠或NaCl。通常，缓冲盐和等渗剂在制剂中含量最多为30％(重量)。

可用在本专利申请的液体或冻干制剂中其他辅料还包括：如岩藻糖、纤维二糖、麦芽三糖、蜜二糖、辛酮糖、核糖、木糖醇、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、赖氨酸、咪唑、甘氨酰甘氨酸、甘露糖基甘油酸酯、Triton X-100、Pluoronic F-127、纤维素、环糊精、(2-羟丙基)-β-环糊精、葡聚糖(10,40和/或70kD)、聚葡萄糖、麦芽糖糊精、聚蔗糖、明胶、羟丙基甲基纤维素、磷酸钠、磷酸钾、ZnCl2、锌、氧化锌、柠檬酸钠、柠檬酸三钠、氨基丁三醇、铜、纤连蛋白、肝素、人血清白蛋白、鱼精蛋白、甘油、 EDTA、甲酚、苯甲醇、苯酚、多元醇、羰基被氢化还原成伯或仲羟基的糖。

在另一个实施例中，制剂中tubulysin衍生物的偶联物具有式(II)的结构：

或其药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶型晶体结构；或其同位素，旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；

其中T、L、n、m、Y、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R10、R13、R14、 R15、R16和R17的定义与式(I)相同；

其中R7选自H、R14或-R14C(＝O)X1R15或-R14X1R15；X1选自O、S、S- S、NH、或NR14；

其中R9为H、-OH、-OR14、-OC(＝O)R14、-OC(＝O)NHR14、-OC (＝O)NR14R15、-OC(＝O)R14SSR15、OP(＝O)(OR14)2或OR14OP(＝O) (OR15)；

其中R11为H、R14、-R14C(＝O)R16、-R14C(＝O)X2R16、-R14X2R16、- R14C(＝O)X2、其中X2为-O-、-S-、-NH-、-NHS(O2)、-N(R14)-、-O- R14-、-S-R14-、-S(＝O)-R14-或-NHR14-；

其中R12为H、R14、-O-、-S-、-N-、＝N-、＝NNH-、-OH、-SH、-NH2、＝NH、＝NNH2、-NH(R14)、-OR14、-C(O)O-、-C(O)OR16-、-COR16、- COOR14-、C(O)NH-、C(O)NH2、C(O)NHR14、-SR14、-S(＝O)R14、-P (＝O)(OR16)2、-OP(＝O)(OR16)2、-CH2OP(＝O)(OR16)2、- SO2R16。

式(II)括号内的示例化合物具有以下优选结构：

或是其药学上可接受的盐、水合物或水合盐；或多晶型结晶；或其光学异构体、外消旋物、非对映异构体或对映异构体；

其中R20为H；C1-C8直链或支链烷基、杂烷基或酰基(-C(O)R17)；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基的；碳酸酯(-C (O)OR17)，氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；或1-8个碳原子羧酸酯、酯、醚或酰胺；或1～8个氨基酸；或如式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙烯氧基单元、其中p是0至约1000的整数；或R20缺省，则相应的氧成酮，或上述组合；其中R21是H、C1-C8直链或支链烷基；

其中Z2和Z3独立地为H、OH、NH2、OR17、NHR17、COOH、 COOR17、C(O)R17、C(O)NHR17、C(O)NHNHR17、C(O) NH2、R18、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO (OR18)2、NHPO(OR18)2、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC (O)R18、OC(O)NHR18、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O) NR17R18)；R17和R18独立地为H、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、 Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯 (-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R19是H、OH、NH2、 OSO2(OR18)、XCH2OP(O)(OR18)2、XPO(OR18)2、XC(O)OP (O)(OR18)2、XC(O)R18、XC(O)NHR18、C1-C8烷基或羧酸酯； C2-C8烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基或烷基羰基；或药学上可接受的盐；X是O、S、NH、NHNH、NHR17或CH2；R7与前文中定义相同；

其中是与式(II)中连接子L连接的位点。

在另一个实施例中，制剂中的tubulysin衍生物的偶联物具有式(III)的结构：

或它们在药学上可接受的盐、水合物或水合盐，或这些化合物的多晶型结构，或其光学异构体、外消旋体、非对映异构体或对映异构体；

其中T、L、m、Y、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12、 R13和n的定义与式(I)与(II)中相同；

其中R7独立地选自-R14-，或-R14C(＝O)X1R15-或-R14X1R15-，其中R14和 R15独立地为C1-C8直链或支链烷基、杂烷基；C2-C8烯基、炔基；C3-C8芳基、杂环、碳环、环烷基、杂环烷基、杂芳烷基；杂烷基环烷基、烷基羰基； X1选自O、S、S-S、NH或NR14。

式(III)括号内化合物的例子包括以下结构：

或它们在药学上可接受的盐、水合物或水合盐，或这些化合物的多晶型结构，或其光学异构体、外消旋体、非对映异构体或对映异构体；

其中R20为H；C1-C8直链或支链烷基、杂烷基或酰基(-C(O)R17)；C2- C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链芳基、 Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯(- C(O)OR17)，氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；或1-8个碳原子羧酸酯、酯、醚或酰胺；或1～8个氨基酸；或如式(OCH2CH2)p或(OCH2CH (CH3))p的聚乙烯氧基单元、其中p是0至约1000的整数；或R20缺省，则相应的氧成酮，或上述组合；

其中R21和R22独立地为H，C1-C8直链或支链烷基；

其中Z2和Z3独立地为H、OH、NH2、OR17、NHR17、COOH、 COOR17、C(O)R17、C(O)NHR17、C(O)NHNHR17、C(O) NH2、R18、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO (OR18)2、NHPO(OR18)2、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC (O)R18、OC(O)NHR18、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O) NR17R18)；R17和R18独立地为H、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、 Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯 (-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R19是H、OH、 NH2、OSO2(OR18)、XCH2OP(O)(OR18)2、XPO(OR18)2、XC(O) OP(O)(OR18)2、XC(O)R18、XC(O)NHR18、C1-C8烷基或羧酸根； C2-C8烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基或烷基羰基；或药学上可接受的盐；X、X1和X2独立地是O、S、NH、NHNH或CH2。

在另一个实施方案中，制剂中的tubulysin衍生物的偶联物具有式(IV)的结构：

或它们在药学上可接受的盐、水合物或水合盐，或这些化合物的多晶型结构，或其光学异构体、外消旋体、非对映异构体或对映异构体；

其中T、L、m、Y、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12、 R13和n的定义与式(II)中相同；

其中R9独立地为H、-O-、-OR14-、-OC(＝O)R14-、-OC(＝O)NHR14-、 -OC(＝O)NR14R15-、-OC(＝O)R14SSR15-、-OP(＝O)(OR14)O-、其中 R14，R15独立地为H，C1-C8烷基，杂烷基；C3-C8芳基，杂芳基，杂环，碳环，环烷基，烷基环烷基，杂环烷基，杂烷基环烷基，杂芳烷基，烷基羰基或药学上可用的盐。

式(IV)括号内化合物的例子包括以下结构：

或它们在药学上可接受的盐、水合物或水合盐，或这些化合物的多晶型结构，或其光学异构体、外消旋体、非对映异构体或对映异构体；

其中R7、R20、R21、R22、Z2、Z3和X2定义同前文。

在另一个实施方案中，制剂中的tubulysin衍生物的偶联物具有式(V)的结构：

或它们在药学上可接受的盐、水合物或水合盐，或这些化合物的多晶型结构，或其光学异构体、外消旋体、非对映异构体或对映异构体；

其中T、L、m、Y、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R12、R13和 n的定义与式(II)中相同；

其中R11为-R14-、-R14C(＝O)R17-、-R14C(＝O)X2R17-、-R14X2R17-、- R14C(＝O)X2-，其中R17独立地为H、OH、C1-C8烷基、C2-C8烯基、炔基、杂烷基；C3-C8芳基、亚芳基、杂环、碳环、杂环烷基；或一个氨基酸、或两个氨基酸单元；X2是-O-、-S-、-NH-、-NHS(O2)-、-NHS(O)-、-N(R14)- 、-O-R14-、-S-R14-、-S(＝O)-R14-或-NHR14-；R14为H、C1-C8烷基、杂烷基；C2-C8烯基、炔基；C3-C8芳基、杂环、碳环、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂烷基环烷基、杂芳烷基、烷基羰基。

式(V)括号内的化合物的例子包括以下结构：

或它们在药学上可接受的盐、水合物或水合盐，或这些化合物的多晶型结构，或其光学异构体、外消旋体、非对映异构体或对映异构体；其中R7、 R20、R21、R22、Z2、Z3和X2与前文中定义相同。

在另一个实施方案中，制剂中的tubulysin衍生物的偶联物具有式(VI)的结构：

或它们在药学上可接受的盐、水合物或水合盐，或这些化合物的多晶型结构，或其光学异构体、外消旋体、非对映异构体或对映异构体；

其中T、L、m、Y、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R13和 n的定义与式(II)中相同；

其中R12独立地为R14、-O-、-S-、-NH-、＝N-、＝NNH-、-N(R14)-、- OR14-、C(O)O-、C(O)NH-、C(O)NR14-、-SR14-、-S(＝O)R14-、- NHR14-、-CH2OP(＝O)(OR15)-、-P(＝O)(OR15)-、-OP(＝O) (OR15)O-、-SO2R14，R14、R15独立地为C1-C8烷基、杂烷基；C2-C8烯基、炔基；C3-C8芳基、杂环、碳环、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂芳烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基。

式(VI)括号内化合物的例子包括以下结构：

或其药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶型晶体结构；或其同位素，旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；

其中R7、R17、R20、R21、Z2、Z3、和X2与前文中定义相同。

在另一个实施例中，制剂中的tubulysin衍生物的偶联物具有式(VII)的结构：

或其药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶型晶体结构；或其同位素，旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；

其中T、L、n、m、Y、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12的定义与式(II)相同；

其中R13为C1-C10烷基、杂烷基、烷基酸、烷基酰胺、烷基胺或Ar；Ar是指由一个或多个环组成的芳基或杂芳基，包含4至10个碳原子，优选4至6个碳原子。术语杂芳基是指芳基上的一个或几个碳、优选一个、两个或三个碳原子被O、N、Si、Se、P或S取代、优选为O、S、N。术语芳基或芳香基也指其中一个或几个氢原子独立地被R18、F、Cl、Br、I、OR16、SR16、NR16R18、N＝ NR16、N＝R16、NR16R18、NO2、SOR16R18、SO2R16、SO3R16、OSO3R16、 PR16R18、POR16R18、PO2R16R18、OPO3R16R18或PO3R16R18取代的芳基，其中 R16、R18独立地为氢，C1-C8烷基，C2-C8烯基、炔基、杂烷基，C3-C8芳基、杂环、碳环、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂芳烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基，C4-C12糖苷或药学上可用的盐。

式(VII)括号内化合物的示例包括以下结构：

或其药学上可接受的盐、水合物或水合盐；或多晶型结晶；或其光学异构体、外消旋物、非对映异构体或对映异构体；

其中R7、R20、Z2、Z3和X2定义同前文；X、X1和X3独立为O、S、 NH、NHNH、NHR17、CH2或缺省；P1是H、R17、P(O)(OH)2、P(O) (X1R17)2、CH2P(O)(OH)2、S(O2)(X1R17)、C6H12O5(糖苷)、(CH2CH2O)pR17、其中p选自0-100，R17定义同前文；另外X1P1可能缺省(为 H)。

在另一个实施例中，合成制备tubulysin衍生物及与它们与本发明的细胞表面受体结合分子的偶联物的线路，包括但不限于图1-22所示。

在另一个实施例中，可释放的连接子(L)是由选自C、N、O、S、Si和P 等原子构成的链状结构，共价连接细胞表面结合配体(T)与有效的tubulysin衍生物。连接子可具有多种长度，例如在约2至约100个原子的范围内。用于形成连接子的原子可以以任何化学方式组合，例如形成亚烷基，亚烯基和亚炔基，醚，聚氧化烯，酯，胺，亚胺，多胺，肼，酰胺，脲，氨基脲，卡巴脲，烷氧基胺，氨基甲酸酯，氨基酸，酰氧基胺，异羟肟酸等。另外，应当注意到的是，形成可释放的连接子(L)的原子可以是饱和的或不饱和的，或者可以是自由基，或者可以彼此成环以形成二价环状结构，包括环烷烃，环状醚，环胺，

亚芳基，杂亚芳基等。

术语“可释放的连接子”是指连接子上包含至少一个可在生理条件下被破坏的键，例如pH、酸、碱、氧化作用、代谢、生化或酶不稳定的键。应当理解，导致键断裂不一定是生物或代谢过程、而可能是一个化学反应、例如水解或取代反应，这种生理条件的例子有：pH值比细胞浆内pH低的内涵体，恶性细胞内存在的毫摩尔浓度的大量谷胱甘肽，它能够与细胞内硫醇发生二硫键交换反应；

偶联物的可释放连接子L可以具有下式的结构：--Ww-(Aa)r-Vv--；其中：--W--是延展体单元；w是0或1；每个-Aa-独立地是一个氨基酸单元；r 独立地是0至12的整数；--V--是一个间隔体单元；v为0、1或2。

当延展体—Ww—存在时，它起着连接着细胞结合分子(T)和氨基酸单元—Aa—或者间隔体—V—(当—Aa—不存在时)的作用。延展体W中可以独立地包含自毁灭间隔体，肽单元，腙键，二硫键或硫醚键。此时，细胞结合分子 (T)含有一个能够与延展体上相应功能团成键的基团。在细胞结合分子上固有或通过化学方式产生的用于连接的功能团，包括但不限于：巯基，氨基，羟基，羰基，糖的异头羟基，以及羧基等，优选的功能团为巯基，羧基和氨基。巯基可以通过还原细胞结合分子(如抗体)分子内的双硫键生成。巯基也可以通过细胞结合分子中赖氨酸的氨基与2-亚氨基硫烷(Traut试剂)或者硫内酯或者其他的巯基生成试剂反应产生，比如先用含双硫键的连接子或硫酯修饰细胞结合分子，再分别通过还原或水解生成巯基。

连接在T上的W的例子如下所示：

其中R20，R21选自–C1～C9亚烃基-，-C1～C7碳环基-，-O-(-(C1～C8烷基)-，-亚芳基-，-C1～C9亚烃基-亚芳基-，-亚芳基，- C1～C9亚烃基，-C1～C9亚烃基-(C1～C8碳环基)-，-(C3～C8碳环基)-C1～C9亚烃基-，-C3～C8杂环基-，-C1～C10亚烃基-(C3～C8杂环基)-，-(C3～C8杂环基)-C1～C9亚烃基-，-(CH2CH2O)k-，-(CH(CH3)CH2O)k-以及–(CH2CH2O)k-CH2-；k为1-20之间的整数；R’和R”分别为H或CH3。

在另一个实施例中，如上所述的W与T的共价连接可以通过各种化学反应实现。

酰胺键形成的示例：

其中延展体单元含有一个活性反应位点E，E可以与细胞结合分子上的伯胺或仲胺反应生成酰胺键。E的例子包括但不限于，羟基琥珀酰亚胺酯(NHS和 S-NHS等)，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟苯基酯(包括S-四氟苯基酯)，酸酐，酰氯，磺酰氯，异氰酸酯和异硫氰酸酯等。

用硫醚或双硫键连接的示例：

其中延展体单元含有一个能够与巯基反应的位点，可以和细胞结合分子T 之间形成硫醚或双硫键。为形成双硫键，细胞结合分子T上的巯基既可以通过还原分子内双硫键生成，也可以通过其他化学过程修饰细胞结合分子T而生成；

在本发明的另一个方面，延展体上也可以有一个能够与醛基(-CHO)或酮基(-C(＝O)R)反应的活性基团，以修饰细胞结合分子上的醛基或酮基。比如，细胞结合分子T的糖，通过用氧化剂例如高碘酸钠氧化就可以生成醛基或酮基。再比如，抗体(或蛋白质或多肽)N端氨基酸上的胺可以和5-磷酸吡哆醛(PLP)反应，而引入酮基(Scheck&Francis，ACSChem.Biol.2007，2， 247-251)。这些醛基或酮基(-C＝O)可以和延展体上的活性反应基团例如酰肼，肟，伯胺或仲胺，肼，缩氨基硫脲，肼羧酸酯或芳基肼反应，从而将二者连接在一起。

用腙，肟或亚胺连接的示例：

其中R20和R21的定义如前所述，R25指一个氨基酸的取代基。

另外本发明另一方面，延展体(可以含有一个隔离体V和/或一个氨基酸) 可以先和细胞结合分子T链接，然后再将这个细胞结合分子-延展体片段与一个 Tubulysin衍生物共轭连接，连接过程可以在缓冲水溶液里进行。下面是一些按照这种方式分两步偶联的例子(连接在R16上的药物被省略)：

其中E包括但不仅限于，羟基琥珀酰亚胺酯(NHS和S-NHS等)，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟苯基酯(包括S-四氟苯基酯)，酸酐，酰氯，磺酰氯，异氰酸酯和异硫氰酸酯等。R’和R”分别为H或CH3；R20，R16和Ar的定义同前文；R26为H，F或NO2；J为F，Cl，Br，I，甲苯磺酸酯基(TsO)或甲磺酸酯基(MsO)，其中含有至少一个Tubulysin衍生物

本发明另一方面，延展体也可以先和Tubulysin衍生物连接，然后再与细胞结合分子T在pH为3-10(优选为5.0-8.5)的缓冲水溶液(可含有上限至50％的有机溶剂)中偶联。

这种两步偶联的示例：

其中E包括但不仅限于，羟基琥珀酰亚胺酯(NHS和S-NHS等)、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯(包括S-四氟苯基酯)、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯等。R’和R”分别为H或CH3；R20、R16和Ar的定义同前文；R26为H、F或NO2；J为F、Cl、Br、I、甲苯磺酸酯基(TsO)或甲磺酸酯基(MsO)，其中含有至少一个Tubulysin衍生物。

当氨基酸单元(--Aa--)存在时，隔离体存在时，它连接延展体和隔离体，隔离体缺失时，它连接延展体和Tubulysin衍生物，如果延展体和隔离体都缺失时，它直接连接细胞结合分子T和Tubulysin衍生物。--(Aa)r—可以是天然或非天然氨基酸，可以是二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或者十二肽单元，r为0-12之间的整数。在这里，氨基酸一般地指氨基烷基羧酸，其中烷基可以是被诸如烷基，酰基，羟烷基，巯烷基，氨烷基或羧烷基等基团取代的烷基。天然及非天然氨基酸和多肽的结构在G.C.Barrett 和D.T.Elmore所著的《Amino Acid and Peptides》(Cambridge University Press，2004)书里有详细说明。另外，氨基酸也指β氨基酸，γ氨基酸和分子内含有甲基、苄基、羟甲基、巯甲基、羧基、羧甲基或胍基丙基等的长链氨基酸。优选的氨基酸为精胺酸、天冬酰胺酸、天冬氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸等。

氨基酸单元可以被一种或多种酶，包括在肿瘤相关蛋白水解酶，所酶解而释放出Tubulysin衍生物。在一实施例中，Tubulysin衍生物被释放后在体内被质子化。

当隔离体(-V-)存在时，氨基酸单元存在时，它连接氨基酸单元和Tubulysin衍生物，氨基酸单元缺失时，它连接延伸体和Tubulysin衍生物。当氨基酸单元和延伸体都缺失时，隔离体连接Tubulysin衍生物和细胞结合分子T。隔离体中可以包含一些功能团，以提高偶联物的水溶性，生物传送，获得适宜的肾清除，摄入，吸收，生物分布，以及生物利用度。隔离体有两种基本类型：自毁灭型和非自毁灭型。非自毁灭型隔离体指Tubulysin衍生物-连接子-细胞结合分子或Tubulysin衍生物-连接子的氨基酸单元断裂(特别是酶解之后)，部分或全部的隔离体仍然连接在Tubulysin衍生物上。自毁灭型包括电子结构类似对氨基苄基氨基甲酰基(PAB)的芳香族化合物，2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物，杂环PAB衍生物，β-葡糖醛酸，邻或对氨基苄基缩醛，或以下结构之一：其中用 (*)标记的原子是隔离体，可释放的连接子单元，Tubulysin衍生物或细胞结合分子T的连接点；X、Y和Z3独立地为NH，O或S；Z2独立地为H、NH、O 或S；v为0或1；Q独立地为H，OH，C1～C6烷基、(OCH2CH2)n、F、 Cl、Br、I、OR17、SR17、NR17R18、N＝NR17、N＝R17、NR17R18、NO2、 SOR17R18、SO2R17、SO3R17、OSO3R17、PR17R18、POR17R18、PO2R17R18、 OPO(OR17)(OR18)、OCH2PO(OR17)(OR18)，其中R17和R18独立地为H，C1-C8烷基，C2-C8烯烃基、炔烃基、杂烷基，C3-C8芳基、杂环基、碳环基、环烷基、杂环烷基、杂芳烷基、烷羰基或药用的正离子盐。

非自我毁灭间隔体的例子：

6-马来酰亚胺己酰基 (MC)，马来酰亚胺丙酰基(MP)，缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)，

丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)，赖氨酸-苯丙氨酸(lys-phe)，对氨基芐氧基-羰基(PAB)，4- 硫代戊酸基(SPP)，4-硫丁酰基(SPDB)，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1酰基(MCC)，马来酰亚胺乙基(ME)，4-硫-2-羟基磺酰基-丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，芳基硫醇(PySS)，(4-乙酰基)氨基苯酰基(SIAB)，氧基苄硫基，氨基苄硫基，二氧基苄硫基，二氨基苄硫基，氨基氧基苄基硫醚基，烷氧基氨基 (AOA)，亚乙基氧基(EO)，4-甲基-4-二硫代戊酸(MPDP)，三唑，二硫基，烷基磺酰基烷基磺酰胺，磺基双酰胺，膦二酰胺，烷基膦酰胺，次膦酸，N-甲基膦酰胺酸，N，N'-二甲基膦酰胺酸，N，N'-二甲基膦二酰胺，肼，乙脒；肟，二乙酰肼，氨基乙基胺，氨基乙基-氨基乙基胺，L-或D-，或含有1-20个氨基酸的天然或非天然肽；

其中“*”和是间隔体或可释放的连接子，tubulysin衍生物和/或结合分子的连接点；m为1～10；n为1～20；X2、X3、X4、X5或X6独立地选自NH、 NHNH、N(R12)、N(R12)N(R12’)、O、S、C1-C6烷基，C2-C 6杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；CH2OR12、CH2SR12、CH2NHR12或1～8个氨基酸；其中R12和R12’独立地为H、C1-C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、1-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或如式(OCH2CH2)p或(OCH 2CH(CH3))p的聚环氧乙烷单元，其中p为0至约1000的整数，或它们的组合。

可断裂连接子L中包含至少一个在生理条件下被破坏的键或pH、酸、碱、氧化作用、代谢、生化或酶不稳定的键，其具有以下结构之一：

-(CR15R16)m(Aa)r(CR17R18)n(OCH2CH2)t-，-(CR15R16)m (CR17R18)n(Aa)r(OCH2CH2)t-，-(Aa)r-(CR15R16)m(CR17R18)n (OCH2CH2)t-，-(CR15R16)m(CR17R18)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-(CR15R16)m(CR17＝CR18)(CR19R20)n(Aa)t(OCH2CH2)r-，- (CR15R16)m(NR11CO)(Aa)t(CR19R20)n-(OCH2CH2)r-，-(CR15R16)m (Aa)t(NR21CO)(CR19R20)n(OCH2CH2)r-，-(CR15R16)m(OCO) (Aa)t-(CR19R20)n(OCH2CH2)r-，-(CR15R16)m(OCNR17)(Aa)t (CR19R20)n(OCH2CH2)r-，-(CR15R16)m-(CO)(Aa)t-(CR19R20)n (OCH2CH2)r-，-(CR15R16)m(NR21CO)(Aa)t(CR19R20)n(OCH2CH2) r-，-(CR15R16)m-(OCO)(Aa)t(CR19R20)n-(OCH2CH2)r-，-(CR15R16) m(OCNR17)(Aa)t(CR19R20)n-(OCH2CH2)r-，-(CR15R16)m(CO) (Aa)t(CR19R20)n-(OCH2CH2)r-，-(CR15R16)m-苯基-CO(Aa)t-(CR17R18)n-，-(CR15R16)m-呋喃-CO(Aa)t(CR17R18)n-，-(CR15R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR17R18)n-，-(CR15R16)m-噻唑基-CO(Aa)t(CCR17R18)n- ，-(CR15R16)t-噻吩-CO(CR17R18)n-，-(CR15R16)t-咪唑-CO-(CR17R18)n- ，-(CR15R16)t-吗啉-CO(Aa)t-(CR17R18)n-，-(CR15R16)t-呱嗪-CO(Aa)t(CR17R18)n-，-(CR15R16)t-N-甲基呱嗪-CO(Aa)t(CR17R18)n-，- (CR15R16)m-(Aa)t苯基-，-(CR15R16)m-(Aa)t呋喃-，-(CR15R16)m-恶唑 (Aa)t-，-(CR15R16)m-噻唑基(Aa)t-，-(CR15R16)m-噻吩基-(Aa)t-，- (CR15R16)m-咪唑(Aa)t-，-(CR15R16)m-吗啉-(Aa)t-，-(CR15R16)m-呱嗪-(Aa)t-，-(CR15R16)m-N-甲基呱嗪-(Aa)t-,-K(CR15R16)m(Aa)r (CR17R18)n(OCH2CH2)t-，-K(CR15R16)m(CR17R18)n(Aa)r (OCH2CH2)t-，-K(Aa)r-(CR15R16)m(CR17R18)n(OCH2CH2)t-，-K(CR15R16)m(CR17R18)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-K(CR15R16)m- (CR17＝CR18)(CR19R20)n(Aa)t(OCH2CH2)r，-K(CR15R16)m (NR11CO)(Aa)t-(CR19R20)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(Aa)t (NR21CO)(CR19R20)n(OCH2CH2)r-，-K(CR15R16)m-(OCO)(Aa)t (CR19R20)n-(OCH2CH2)r-，-K(CR15R16)m(OCNR17)(Aa)t(CR19R20) n-(OCH2CH2)r-，-K(CR15R16)m(CO)(Aa)t-(CR19R20)n(OCH2CH2)r- ，-K(CR15R16)m(NR21CO)(Aa)t-(CR19R20)n-(OCH2CH2)r-，-K (CR15R16)m-(OCO)(Aa)t(CR19R20)n(OCH2CH2)r-，-K(CR15R16)m- (OCNR17)(Aa)t-(CR19R20)n(OCH2CH2)r-，-K-(CR15R16)m(CO) (Aa)t(CR19R20)n(OCH2CH2)r-，-K(CR15R16)m-苯基-CO(Aa)t (CR17R18)n-，-K-(CR15R16)m-呋喃-CO(Aa)t(CR17R18)n-，-K (CR15R16)m-恶唑-CO(Aa)t(CR17R18)n-，-K(CR15R16)m-噻唑基-CO (Aa)t-(CR17R18)n-，-K(CR15R16)t-噻吩-CO(CR17R18)n-，-K(CR15R16)t咪唑-CO-(CR17R18)n-，-K(CR5R6)t吗啉-CO(Aa)t-(CR17R18)n-，-K (CR15R16)t-呱嗪-CO(Aa)t-(CR17R18)n-，-K(CR15R16)t-N-甲基呱嗪-CO (Aa)t(CR17R18)n-，-K(CR15R16)m-(Aa)t苯基，-K-(CR15R16)m-(Aa)t呋喃-，-K(CR15R16)m-恶唑-(Aa)t-，-K(CR15R16)m-噻唑基(Aa)t-，-K (CR15R16)m-噻吩-(Aa)t-，-K(CR15R16)m-咪唑(Aa)t-，-K(CR15R16)m- 吗啉(Aa)t-，-K(CR15R16)m呱嗪(Aa)tG，-K(CR5R6)m-N-甲基呱嗪 (Aa)t-；其中Aa、m、n、R13、R14和R15在前文已有定义；t和r独立地为0– 100；R16、R17、R18、R19和R20独立地选自H，卤素，C1-C8烷基或杂烷基，C2- C8芳基、烯基、炔基、醚、酯、胺或酰胺，C3-C8芳基，这些基团均可以被以下成分所取代：一个或多个卤素、CN、NR1R2、CF3、OR1、芳基、杂环、S(O) R1、SO2R1、-CO2H、-SO3H、-OR1、-CO2R1、-CONR1、-PO2R1R2、-PO3H或P (O)R1R2R3；K是NR12、-SS-、-C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、- C＝NH-O-、-C＝N-NH-、-C(＝O)NH-NH-、O、S、Se、B、Het(具有C3-C12的杂环或杂芳环)，或含有相同或不同的1-20个氨基酸的肽。

结合分子T，可以是目前已知的或即将被公开的，具有意义或者可以被生物学方式修饰的，能够与细胞的部分相结合、复合或反应的任何种类的分子。结合分子单元将tubulysin衍生物递送至能与结合分子(T)反应的特定靶细胞体。

细胞结合剂T包括但不限于，大分子量蛋白质，例如全长抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)；单链抗体；抗体的片段，例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv [Parham、J.Immunol.131，2895-2902(1983)]，由Fab表达文库产生的片段、抗独特性(抗-Id)抗体、CDR's；、以及以上分子的任一表位结合片段，能免疫特异性地结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原；干扰素(如I、II、III 型)；多肽；淋巴因子如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、GM-CSF、干扰素-γ (IFN-γ)；激素、如胰岛素、TRH(促甲状腺素释放激素)、MSH(促黑素细胞激素)、类固醇激素如雄激素和雌激素；生长因子和集落刺激因子、如表皮生长因子(EGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、转化生长因子 (TGF)、如TGFα、TGFβ、胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、 G-CSF、M-CSF和GM-CSF[Burgess、Immunology Today、5、155-158 (1984)]；牛痘生长因子(VGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；小分子量蛋白质；多肽；肽和肽激素、如铃蟾肽、胃泌素、胃泌素释放肽；血小板衍生的生长因子；白细胞介素和细胞因子、例如、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素- 6(IL-6)、白血病抑制因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；维生素、如叶酸；脱辅基蛋白和糖蛋白、如转铁蛋白(O'Keefe等、J.Biol.Chem.1985 260 932-937)；糖结合蛋白或脂蛋白、如凝集素；细胞营养传递分子；小分子抑制剂、如前列腺特异性膜抗原(PSMA)抑制剂和小分子酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)、非肽或任何其它细胞结合分子或物质、如生物活性聚合物(Dhar等， Proc.Natl.Acad.Sci.2008，105，17356-61)，枝状大分子(Lee等，Nat. Biotechnol.2005，23，1517-26；Almutairi等；Proc.Natl.Acad.Sci.2009， 106，685-90)，纳米粒子(Liong等，ACS Nano，2008，19，1309-12； Medarova等，Nat.Med.2007，13，372-7；Javier等，Bioconjugate Chem. 2008，19，1309-12)，脂质体(Medinai等，Curr.Phar.Des.2004，10，2981- 9)和病毒外壳(Flenniken等，Viruses Nanotechnol.2009，327，71-93)。一般而言，如果适当的单克隆抗体是可用的，则优选单克隆抗体作为细胞表面结合剂。

优选地，T是细胞结合剂或分子，选自抗体、单链抗体、与靶细胞结合的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、结合靶细胞的单克隆抗体片段、嵌合抗体、结合靶细胞的嵌合抗体片段、结构域抗体、结合靶细胞的结构域抗体片段、adnectin类抗体、DARPin蛋白、淋巴因子、激素、维生素、生长因子、集落刺激因子、营养转运分子(转铁蛋白)和连接在白蛋白、聚合物、树状大分子、脂质体、纳米粒子、囊泡或(病毒)衣壳上的细胞结合肽、蛋白质或小分子。

更优选地，细胞结合剂/分子T能够抗以下细胞：肿瘤细胞、病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感染细胞、自身免疫细胞、活化的细胞、骨髓细胞、活化的T细胞、B细胞、或黑素细胞。更具体地、细胞结合剂可以是任何能够抗下列抗原或受体之一的试剂/分子：CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、 CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD12w、 CD13、CD14、CD15、CD16、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD32a、CD32b、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、 CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、 CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD49c、 CD49d、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、 CD58、CD59、CD60、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、 CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66、CD66a、CD66b、CD66c、 CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、 CD73、CD74、CD75、CD75s、CD76、CD77、CD78、CD79、CD79a、 CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD85a、CD85b、 CD85c、CD85d、CD85e、CD85f、CD85g、CD85g、CD85i、CD85j、CD85k、 CD85m、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、 CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、 CD104、CD105、CD106、CD107、CD107a、CD107b、CD108、CD109、 CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、 CD118、CD119、CD120、CD120a、CD120b、CD121、CD121a、CD121b、 CD122、CD123、CD123a、CD124、CD125、CD126、CD127、CD128、 CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、 CD137、CD138、CD139、CD140、CD140a、CD140b、CD141、CD142、 CD143、CD144、CD145、CDw145、CD146、CD147、CD148、CD149、 CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD156a、 CD156b、CD156c、CD156d、CD157、CD158、CD158a、CD158b1、 CD158b2、CD158c、CD158d、CD158e1、CD158e2、CD158f2、CD158g、 CD158h、CD158i、CD158j、CD158k、CD159、CD159a、CD159b、CD159c、 CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167、 CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、 CD178、CD179、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CDw186、CD187、CD188、CD189、CD190、 CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CD198、 CD199、CDw198、CDw199、CD200、CD201、CD202、CD202(a、b)、 CD203、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、 CD210、CDw210a、CDw210b、CD211、CD212、CD213、CD213a1、 CD213a2、CD214、CD215、CD216、CD217、CD218、CD218a、CD218、 CD21b9、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、 CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、 CD235、CD235a、CD235b、CD236、CD237、CD238、CD239、CD240、 CD240ce、CD240d、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、 CD247、CD248、CD249、CD250、CD251、CD252、CD253、CD254、 CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、 CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、 CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、 CD279、CD281、CD282、CD283、CD284、CD285、CD286、CD287、 CD288、CD289、CD290、CD291、CD292、CD293、CD294、CD295、 CD296、CD297、CD298、CD299、CD300、CD300a、CD300b、CD300c、 CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD307a、 CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD307f、CD308、CD309、CD310、 CD311、CD312、CD313、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、 CD319、CD320、CD321、CD322、CD323、CD324、CD325、CD326、 CD327、CD328、CD329、CD330、CD331、CD332、CD333、CD334、 CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD341、CD342、 CD343、CD344、CD345、CD346、CD347、CD348、CD349、CD350、 CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD356、CD357、CD358、 CD359、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、 CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、CD372、CD373、CD374、 CD375、CD376、CD377、CD378、CD379、CD381、CD382、CD383、CD384、CD385、CD386、CD387、CD388、CD389、CRIPTO、CRIPTO、CR、 CR1、CRGF、CRIPTO、CXCR5、LY64、TDGF1、4-1BB、APO2、 ASLG659、BMPR1B、4-1BB、5AC、5T4(Trophoblast糖蛋白，TPBG，WNT- 活化抑制因子1或WAIF1)，腺癌抗原，AGS-5，AGS-22M6，启动素受体激酶1，AFP，AKAP-4，ALK，α整合素，αvβ6，氨基肽酶N，淀粉样蛋白β，雄激素受体，促血管新生蛋白因子2，促血管新生蛋白因子3，膜联蛋白A1，毒素保护性抗原，抗转移蛋白受体，AOC3(VAP-1)，B7-H3，杆菌，BAFF (B细胞启动因子)，B淋巴瘤细胞，bcr-abl，蛙皮素，BORIS，C5，C242抗原，CA125(糖抗原125，MUC16)，CA-IX(或CAIX，碳酸酐酶9)， CALLA，CanAg，犬红斑狼疮IL31，碳酸酐酶IX，心肌肌凝蛋白，CCL11(C-C 片段趋化因子11)，CCR4(C-C趋化因子受体4，CD194)，CCR5，CD3E (ε)，CEA(癌胚抗原)，CEACAM3，CEACAM5(癌胚抗原)，CFD(因子D)，Ch4D5，胆囊收缩素2(CCK2R)，CLDN18(Claudin-18)，丛生因子 A，CRIPTO，FCSF1R(集落刺激因子1受体，CD115)，CSF2(集落刺激因子 2，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))，CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，CTAA16.88肿瘤抗原，CXCR4(CD184)，C-X-C趋化因子受体4，环状ADP核糖核酸酶，细胞周期蛋白B1，CYP1B1，巨细胞病毒，巨细胞病毒糖蛋白B，Dabigatran，DLL3(类Δ配体3)，DLL4(类Δ配体4)， DPP4(双肽-肽酶4)，DR5(死亡受体5)，大肠杆菌shiga毒素类型-1，大肠杆菌shiga毒素类型-2，ED-B，EGFL7(类EGF结构域蛋白7)，EGFR， EGFRII，EGFRvIII，内皮因子(CD105)，内皮素B受体，内毒素，EpCAM (上皮细胞粘附分子)，EphA2，Episialin，ERBB2(表皮生长因子受体2)， ERBB3，ERG(TMPRSS2ETS融合基因)，大肠杆菌，ETV6-AML，FAP(成纤维细胞活化蛋白α)，FCGR1，甲胎蛋白，纤维蛋白IIβ链，纤连蛋白额外结构域-B，FOLR(叶酸受体)，叶酸受体α，叶酸水解酶，Fos相关抗原1，呼吸道合胞病毒的F蛋白，卷曲的受体，岩藻糖GM1，GD2神经节苷脂，G-28(细胞表面抗原糖脂)，GD3独特型，GloboH，Glypican 3，N-羟乙酰神经氨酸， GM3，GMCSF受体α链，生长分化因子8，GP100，GPNMB(跨膜糖蛋白NMB)，GUCY2C(鸟苷酸环化酶2C)，鸟苷酸环化酶C(GC-C)，肠鸟苷酸环化酶，鸟苷酸环化酶C受体，热稳定肠毒素受体(hSTAR)，热休克蛋白，血凝素，乙肝表面抗原，乙型肝炎病毒，HER1(人类表皮生长因子受体1)， HER2，HER2/neu，HER3(ERBB-3)，IgG4，HGF/SF(肝细胞生长因子/分散因子)，HHGFR，HIV-1，组蛋白复合物，HLA-DR(人类白细胞抗原)，HLA- DR10，HLA-DRB，HMWMAA，人类绒毛膜促性腺激素，HNGF,人类分散因子受体激酶，HPV E6/E7，Hsp90，hTERT，ICAM-1(细胞间粘附分子1)，独特型，IGF1R(IGF–1，类胰岛素生长因子1受体)，IGHE，IFN-γ，流感血凝素，IgE，IgE Fc区，IGHE，IL–1，IL-2R(白介素2受体)，IL–4，IL-5，IL –6，IL-6R(白介素6受体)，IL-9，IL–10，IL–12，IL-13，IL-17，IL-17A，IL-20，IL-22，IL-23，IL31RA，ILGF2(类胰岛素生长因子2)，整合蛋白 (α4、αIIbβ3、αvβ3、α4β7、α5β1、α6β4、α7β7、αllβ3、α5β5、αvβ5)，干扰素γ诱导蛋白质，ITGA2，ITGB2，KIR2D，LCK，Le，Legumain，Lewis-Y抗原， LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原1，CD11a)，LHRH，LINGO-1，脂磷壁酸， LIV1A，LMP2，LTA，MAD-CT-1，MAD-CT-2，MAGE-1，MAGE-2，MAGE- 3，MAGE A1，MAGE A3，MAGE 4，MART1，MCP-1，MIF(巨噬细胞迁移抑制因子，或糖基抑制因子(GIF))，MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员 1)，MSLN(间皮素)，MUC1(粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)或多态性上皮粘蛋白(PEM))，MUC1-KLH，MUC16(CA125)，MCP1(单核细胞趋化蛋白1)，MelanA/MART1，ML-IAP，MPG，MS4A1，MYCN，髓磷脂相关糖蛋白，Myostatin，NA17，NARP-1，NCA-90(粒细胞抗原)，Nectin-4 (ASG-22ME)，NGF，神经细胞凋亡调控蛋白酶1，NOGO-A，Notch受体，核仁素，Neu致癌基因产物，NY-BR-1，NY-ESO-1，OX-40，OxLDL(氧化低密度脂蛋白)，OY-TES1，P21，p53非突变体，P97，PAP，抗(N-羟乙酰神经氨酸)抗体结合部位，PAX3，PAX5，PCSK9，PDCD1(PD-1、程序性细胞死亡蛋白1，CD279)，PDGF-Rα(α血小板源生长因子受体)，PDGFR-β，PDL-1， PLAC1，类PLAP睾丸碱性磷酸酶，血小板衍生生长因子受体β，磷酸钠联合转运体，PMEL 17，聚唾液酸，蛋白酶3(PR1)，前列腺癌，PS(磷脂酰丝氨酸)，前列腺癌细胞，铜绿假单胞菌，PSMA，PSA，PSCA，狂犬病病毒糖蛋白，RHD(Rh多肽1(RhPI)，CD240)，Rhesus因子，RANKL，RhoC，Ras 突变，RGS5，ROBO4，呼吸道合胞病毒，RON，肉瘤易位断点，SART3， Sclerostin，SLAMF7(SLAM成员7)，Selectin P，SDC1(多配体蛋白聚糖 1)，系统性红斑狼疮(a)，生长调节素C，SIP(1-磷酸鞘氨醇)，生长激素抑制素，精子蛋白17，SSX2，STEAP1(6-跨膜上皮前列腺抗原1)，STEAP2， STn，TAG-72(肿瘤相关糖蛋白)，存活素，T细胞受体，T细胞跨膜蛋白， TEM1(肿瘤血管内皮标记1)，TENB2，Tenascin C(TN-C)，TGF-α，TGF-β (转化生长因子β)，TGF-β1，TGF-β2(转化生长因子2)，Tie(CD202b)， Tie2，TIM-1(CDX-014)，Tn，TNF，TNF-α，TNFRSF8，TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B)，TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B)，TPBG(滋养细胞糖蛋白)，TRAIL-R1(TNF相关坏死诱导配体受体 1)，TRAILR2(死亡受体5(DR5))，肿瘤相关的钙信号传感子2，肿瘤特异糖基化的MUC1，TWEAK受体，TYRP1(糖蛋白75)，TRP-1(Trop1)， TRP-2(Trop2)，酪氨酸酶，VCAM-1，VEGF，VEGF-A，VEGF-2，VEGFR- 1，VEGFR-2，vimentin，WT1，XAGE 1，表达胰岛素生长因子受体的细胞，或表达表皮生长因子受体的细胞。

在另一个具体实施例中，细胞结合分子可以是选自以下的配体或受体激动剂：叶酸衍生物(与叶酸受体结合、在卵巢癌和其他恶性肿瘤中超表达的蛋白质)(Low，PS等2008，Acc.Chem.Res.41，120-9)；谷氨酸脲衍生物(与前列腺特异性膜抗原结合、前列腺癌细胞的表面标志物)(Hillier，SM等， 2009，Cancer Res.69，6932-40)；生长抑制素(也称为生长激素抑制激素 (GHIH)或生长激素释放抑制因子(SRIF)或生长激素释放抑制激素)及其同系物，如奥曲肽(Sandostatin)和兰瑞肽(Somatuline)(特别是用于神经内分泌肿瘤，产生GH的垂体腺瘤、副神经节瘤、非功能性垂体腺瘤、嗜铬细胞瘤 (Ginj，M.，等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103，16436-41)，以下瘤中生长激素抑制素受体亚型(sst1、sst2、sst3、sst4和sst5)：分泌GH的垂体腺瘤(Reubi JC，L和olt，AM1984J.Clin.Endocrinol Metab 59：1148–51；Re ubi JC，L和olt AM 1987J ClinEndocrinol Metab 65：65–73；Moyse E，等，J Clin Endocrinol Metab 61：98–103)，胃肠胰腺肿瘤(Reubi JC，等，1987J Clin Endocrinol Metab 65：1127–34；Reubi，J.C，等，1990Cancer Res 50： 5969–77)，嗜铬细胞瘤(Epel-baum J，等1995J Clin EndocrinolMetab 80： 1837–44；Reubi J C等，1992J Clin Endocrinol Metab 74：1082–9)，神经母细胞瘤(Prevost G，1996Neuroendocrinology 63：188–197；Moertel，C.L，等 1994Am J ClinPath 102：752–756)，甲状腺髓样癌(Reubi，J.C，等1991Lab Invest 64：567–573)，小细胞肺癌(Sagman U，等，1990Cancer 66：2129– 2133)，脑膜瘤、成神经管细胞瘤或胶质瘤(Reubi JC，等1986J Clin Endocrinol Metab 63：433–8；Reubi JC，等1987Cancer Res47：5758–64； Fruhwald，M.C，等1999Pediatr Res 45：697–708)，乳腺癌(Reubi JC，等1990Int J Cancer 46：416–20；Srkalovic G，等1990J Clin Endocrinol Metab 70：661–669)，淋巴瘤(Reubi JC，等1992，Int J Cancer50：895–900)，肾细胞癌(Reubi JC，等1992，Cancer Res 52：6074–6078)，间充质肿瘤 (Reubi JC，等1996Cancer Res 56：1922–31)，前列腺癌(Reubi J C，等 1995，J.Clin.Endocrinol Metab 80：2806–14；等1989，Prostate14：191–208； Halmos G，等J.Clin.Endo-crinol Metab 85：2564–71)，卵巢癌(Halmos，G，等，2000J Clin Endocrinol Metab 85：3509–12；Reubi JC，等1991Am J Pathol 138：1267–72)，胃癌(Reubi JC，等1999，Int J Cancer 81：376–86； Miller，G.V，1992Br JCancer 66：391–95)，肝癌(Kouroumalis E，等1998 Gut 42：442–7；Reubi J C，等1999Gut45：66–774)及鼻咽癌(Loh K.S，等，2002Virchows Arch 441：444–8)；芳香磺酰胺(碳酸酐酶IX特异性) (缺氧和肾细胞癌的标志物)(Neri，D.，等，Nat.Rev.Drug Discov.2011， 10，767-7)；垂体腺苷酸环化酶启动肽(PACAP)(PAC1)(用于嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)；血管活肠肽(VIP)及其受体亚型(VPAC1，VPAC2)；α- 黑素细胞刺激素(α-MSH)受体；胆囊收缩素(CCK)或胃泌素受体及其受体亚型(CCK1(以前称为CCK-A)和CCK2；血管活性肠肽(VIP)及其受体子类(VPAC1、VPAC2)；α-黑素细胞刺激素(α-MSH)受体；胆囊收缩素(CCK)或胃泌素受体及其受体亚型(CCK)；铃蟾肽(Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly- Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)或胃泌素释放肽(GRP)及其受体子类(BB1，GRP受体子类(BB2)、BB3和BB4)(Ohlsson，B.，等， 1999，Sc和.J.Gastroenterology 34(12)：1224–9；Weber，HC，2009，Cur.Opin.Endocri.Diab.Obesity 16(1)：66–71，Gonzalez N，等，2008，Cur.Opin.Endocri.Diab.Obesity 15(1)，58-64)；神经降压素受体及其受体亚型 (NTR1，NTR2，NTR3)；物质P受体及其受体亚型(例如神经胶质肿瘤的 NK1受体，Hennig I M，等1995Int.J.Cancer 61，786–792)；神经肽Y (NPY)受体及其受体亚型(Y1–Y6)；归巢肽包括RGD(Arg-Gly-Asp)、 NGR(Asn-Gly-Arg)、二聚和多聚环状RGD肽(如cRGDfV)(Laakkonen P，Vuorinen K.2010，Integr Biol(Camb).2(7–8)：326–337；Chen K， Chen X.2011，Theranostics.1：189–200；Garanger E，等，Anti-Cancer Agents Med Chem.7(5)：552–558；Kerr，JS等，Anticancer Research，19 (2A)，959-968；Thumshirn，G，等，2003Chem.Eur.J.9，2717-2725)，及TAASGVRSMH或LTLRWVGLMS(硫酸软骨素蛋白多糖NG2受体)和F3 肽(与细胞表面表达的核仁素受体结合的31个氨基酸肽)(Zitzmann，S.，2002Cancer Res.，62，18，5139–5143；Temminga，K.，2005，Drug Resistance Updates，8，381–402；P.Laakkonen和K.Vuorinen，2010Integrative Biol，2 (7-8)，326–337；M.A.Burg，1999Cancer Res.，59(12)，2869–2874；K. Porkka等2002，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99(11)，7444-9)；细胞穿透肽 (CPPs)(Nakase I，等，2012，J.Control Release.159(2),181–188)；肽激素，例如促黄体激素释放激素(LHRH)的激动剂和拮抗剂，促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂，通过靶向卵泡刺激素(FSH)和促黄体激素(LH)以及睾酮产生而作用，如布舍瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro- NHEt)、戈那瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)、戈舍瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-AzGly-NH2)、组氨瑞林 (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(N-Bn)-Leu-Arg-Pro-NHEt)、亮丙瑞林(Pyr- His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt)、那法瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr- 2Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)、曲普瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg- Pro-Gly-NH2)、纳法瑞林、地洛林、阿贝瑞林(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3- (3-pyridyl)Ala-Ser-(N-Me)Tyr-D-Asn-Leu-isopropylLys-Pro-DAla-NH2)、西曲瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloro-Phe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg- Pro-D-Ala-NH2)、地加瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala- Ser-4-aminoPhe(L-hydroorotyl)-D-4-aminoPhe(carba-moyl)-Leu-isopropylLys- Pro-D-Ala-NH2)和甘乃利(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser- Tyr-D-(N9，N10-diethyl)-homoArg-Leu-(N9，N10-diethyl)-homoArg-Pro-D-Ala-NH2)(Thundimadathil，J.，J.Amino Acids，2012，967347；Boccon- Gibod，L.；等，2011，Therapeutic Advances in Urology 3(3)：127–140； Debruyne，F.，2006，FutureOncology，2(6)，677–696；Schally A.V； Nagy，A.1999Eur J Endocrinol 141：1–14；Koppan M，等1999Prostate 38： 151–158)；模式识别受体(PRRs)，如Toll样受体(TLRs)、C型凝集素和结节状的受体(NLRs)(Fukata，M.等，2009，Semin.Immunol.21，242– 253；Maisonneuve，C.等，2014，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111，1–6；Botos， I.等，2011，Structure 19，447–459；Means，T K等，2000，Life Sci.68，241– 258)，其分子量范围从小分子(咪喹莫特、鸟嘌和腺苷同系物)到大型和复杂的生物大分子，如脂多糖(LPS)、核酸(CpG DNA，polyI：C)和脂肽 (Pam3CSK4)(Kasturi，S P等，2011，Nature 470，543–547；Lane，T.， 2001，JR Soc.Med.94，316；Hotz，C.，和Bourquin，C.，2012， Oncoimmunology 1，227-228；Dudek，A Z等，2007，Clin.Cancer Res.13， 7119–25)；降钙素受体，它是一种32-氨基酸神经肽，主要通过其对破骨细胞和肾脏的作用参与钙水平的调节(Zaidi M，等，1990Crit Rev Clin Lab Sci 28， 109–174；Gorn，A H，等1995J Clin Invest 95：2680–91)；整合素受体及其受体子类(如αVβ1，αVβ3，αVβ5，αVβ6，α6β4，α7β1，αLβ2，αIIbβ3等)，通常在血管生成中起重要作用，在多种细胞，特别是破骨细胞、内皮细胞和肿瘤细胞的表面表达(Ruoslahti，E.等，1994Cell 77，477-8；Albelda，SM等， 1990Cancer Res.，50，6757-64)。短肽，GRGDSPK和环状RGD五肽，如环(RGDfV)(L1)及其衍生物(环(-N(Me)R-GDfV)、环(R-Sar-DfV)、环-(RG-N(Me)D-fV)、环(RGD-N(Me)fV)、环(RGDf-N(Me)V- )(西仑吉肽))具有对整合素受体高亲和力(Dechantsreiter，MA等，1999J. Med.Chem.42，3033-40，Goodman，SL，等，2002J.Med.Chem.45，1045- 51)。

细胞结合分子或配体或细胞受体激动剂可以是基于Ig和非基于Ig的蛋白质支架分子。基于Ig的支架可以选自但不限于，纳米抗体(VHH的衍生物(骆驼科动物Ig))(Muyldermans S.，2013Annu Rev Biochem.82，775–97)；结构域抗体(dAb，VH或VL结构域的衍生物)(Holt，L.J，等，2003，Trends Biotechnol.21，484–90)；双特异性T细胞接头(BiTE、双特异性双抗体) (Baeuerle，P.A等，2009，Curr.Opin.Mol.Ther.11，22–30)；双重亲和力复位向剂(DART，双特异性双抗体)(Moore PA P等.2011，Blood 117 (17)，4542–51)；四价串联抗体(TandAb，二聚双特异性双抗体) (Cochlovius，B等.2000，Cancer Res.60(16)：4336–4341)。非Ig支架可以选自但不限于，Anticalin(Lipocalins的衍生物)(SkerraA.2008，FEBS J.， 275(11)：2677–83；Beste G等，1999Proc.Nat.Acad.USA.96(5)：1898–903；Skerra，A.2000Biochim Biophys Acta，1482(1-2)：337–50；Skerra， A.2007，CurrOpin Biotechnol.18(4)：295–304；Skerra，A.2008，FEBS J. 275(11)：2677–83)；Adnectin(第10个FN3(纤连蛋白))(Koide，A 等，1998J.Mol.Biol.，284(4)：1141–51；Batori V，2002，Protein Eng.15 (12)：1015–20；Tolcher，A.W，2011，Clin.Cancer Res.17(2)：363–71；Hackel，B.J，2010，Protein Eng.Des.Sel.23(4)：211–19)；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)(锚蛋白重复(AR)蛋白的衍生物)(Boersma， Y L等，2011Curr OpinBiotechnol.22(6)：849–57)，例如DARPin C9、 DARPin Ec4及DARPin E69_LZ3_E01(Winkler J等，2009Mol Cancer Ther.8 (9)，2674–83；Patricia MK.M.等，Clin CancerRes.2011；17(1)：100– 10；Boersma Y.L等，2011J.Biol.Chem.286(48)，41273–85)；Avimer(域 A/低密度脂蛋白(LDL)受体)(Boersma Y.L，2011J.Biol.Chem.286 (48)：41273–41285；Silverman J等，2005Nat.Biotechnol.，23(12)： 1556–61)。

小分子本身或包被于或共价连接于蛋白质、纳米颗粒、聚合物、胶束或脂质的小分子(与本发明的细胞毒性剂偶联)，可用于本发明的细胞结合剂。示例的小分子包括LB01(叶酸)、LB02(PMSA配体)、LB03(PMSA配体)、LB04(PMSA配体)、LB05(生长抑制素)、LB06(生长抑制素)、LB07 (奥曲肽、生长抑制素同系物)、LB08(兰瑞肽、生长抑制素同系物)、LB09 (伐普肽(Sanvar)、生长抑制素同系物)、LB10(CAIX配体)、LB11 (CAIX配体)、LB12(胃泌素释放肽受体(GRPr)、MBA)、LB13(促黄体激素释放激素(LH-RH)和GnRH配体)、LB14(促黄体激素释放激素(LH- RH)和GnRH配体)、LB15(GnRH拮抗剂、Abarelix)、LB16(钴胺素、维生素B12同系物)、LB17(钴胺素、维生素B12同系物)、LB18(用于αvβ3整联蛋白受体、环状RGD五肽)、LB19(VEGF受体的异二价肽配体)、LB20 (神经髓质素B)、LB21(蛙皮素，作用于G蛋白偶联受体)、LB22(TLR2，作用于类Toll受体)、LB23(作用于雄性激素受体)、LB24(西仑吉肽或环(-RGDfV-)结合物，作用于αv整合素受体)LB25(利福布汀同系物)、LB26 (利福布汀同系物)、LB27(利福布汀同系物)、LB28(氟氢可的松)、LB29 (地塞米松)、LB30(丙酸氟替卡松)、LB31(丙酸倍氯米松)、LB32(醋酸曲安奈德)、LB33(泼尼松龙)、LB35(甲基强的松龙)、LB36(倍他米松)、LB37(伊立替康同系物)、LB38(克唑替尼同系物)、LB39(硼替佐米同系物)、LB40(卡菲佐米同系物)、LB41(卡非佐米同系物)、LB42(亮丙瑞林同系物)、LB43(曲普瑞林同系物)、LB44(克林霉素)、LB45(利拉鲁肽同系物)、LB46(半长春新碱同系物)、LB47(瑞他帕林同系物)、 LB48(丁布尔同系物)、LB49(长春碱同系物)、LB50(利西森肽同系物)、 LB51(奥西丁尼同系物)、LB52(核苷同系物)、LB53(厄洛替尼同系物)和 LB5 4(拉帕替尼同系物)，其结构如下所示：

LB01(叶酸偶联物),

LB02(PMSA配体偶联物),

LB03(PMSA配体偶联物),

LB04(PMSA配体),

LB05(生长激素抑制素),

LB06(生长激素抑制素),

LB07(奥曲肽、生长抑制素同系物),

LB08(兰肽、生长抑制素同系物),

LB09(氨肽(Sanvar)、生长抑制素同系物),

LB10 (CAIX配体),

LB11(CAIX配体),

LB12 (胃泌素释放肽受体(GRPr)，MBA),

LB13(促黄体激素释放激素(LH-RH)和促性腺激素释放激素GnRH配体),

LB14(促黄体激素释放激素(LH-RH)和促性腺激素释放激素GnRH配体),

LB15(GnRH拮抗物、阿巴瑞克),

LB16(钴胺素，维生素B12同系物),

LB17(钴胺素，维生素B12 同系物),

LB18(环RGD五肽，作用于αvβ3整联蛋白受体),

LB19(异源二价肽配体偶联物，作用于血管内皮生长因子VEGF受体),

LB20(神经髓质素B),

LB21(蛙皮素偶联物，作用于G蛋白偶联受体)，

LB22(TLR2偶联物，作用于类Toll受体)，

LB23(雄激素受体)，

LB24(西伦吉肽/环(- RGDfV-)偶联物，作用于αv整合素受体)

LB25(利福布汀同系物)，

LB26(利福布汀同系物)，

LB27(利福布汀同系物)，

LB28(氟氢可的松)，

LB29(地塞米松)，

LB30(丙酸氟替卡松),

LB31(倍氯米松丙酸酯),

LB32(曲安奈德),

LB33(泼尼松),

LB34(泼尼松龙),

LB35(甲基强的松龙),

LB36(倍氟美松),

LB37(伊立替康同系物),

LB38(克唑替尼同系物),LB39(硼替佐米同系物)，其中Y5是N、CH、C(Cl)、C(CH3)或C(COOR1)；R1是H、C1-C6烷基、 C3-C8芳基；

LB40(卡菲佐米同系物),LB41(卡菲佐米同系物),

LB42(亮丙瑞利同系物),

LB43(曲普瑞林同系物),

LB44(克林霉素),

LB45(利拉鲁肽同系物),

LB46(索马鲁肽同系物),

LB47(瑞他帕林同系物),

LB48(丁布尔同系物),LB49(长春碱同系物),

LB50(利西森肽同系物),LB51(奥西丁尼同系物),

LB52(核苷同系物),

LB53(埃罗替尼同系物),

LB54(拉帕替尼同系物)，

其中是连接子的连接位置；X4和Y1独立地是O、NH、NHNH、 NR1、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O) NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、C (O)NHNHC(O)和C(O)NR1；X1是H、CH2、OH、O、C(O)、C (O)NH、C(O)N(R1)、R1、NHR1、NR1、C(O)R1或C(O)O；X5是H、CH3、F或Cl；M1和M2分别是H、Na、K、Ca、Mg、NH4、N (R1R1’R2R3)；R1、R1’、R2和R3定义同式(I)。

在与Tubulysin衍生物偶联之前，通过使用含双功能团的连接子修饰，细胞结合分子可以被修饰，连接更具特异性的多肽，蛋白，药物分子或其他功能性分子。这些含双功能团的连接子包括胺-非选择性功能团的连接子(琥珀酰亚胺 (NHS)-二氮环丙烯(SDA)，琥珀酰亚胺酯-叠氮化物)，胺-巯基的连接子 (NHS酯-马来酰亚胺，NHS酯-吡啶二巯基，NHS酯-卤代乙酰基)，巯基-糖的连接子(马来酰亚胺-酰肼，吡啶二巯基-酰肼)，羟基-巯基的连接子(异氰酸酯-马来酰亚胺)，胺-DNA的连接子(NHS酯/补骨脂素)和胺-羧基的连接子 (碳二亚胺)等。

在使用琥珀酰亚胺(NHS)-二氮环丙烯(SDA)连接子的修饰方法中，连接子上的NHS酯可以首先和细胞结合分子骨架上的胺反应(在pH为6-9的缓冲溶液里)，形成一个稳定的酰胺键。然后，通过用波长为330-370nm的长波照射，二氮环丙烯被活化并产生卡宾活性中间体，该中间体和特异性多肽、蛋白或者其他功能性分子上的胺反应后即可完成连接。这两步反应的次序也可以改变为：先让功能性分子上的胺和连接子上的NHS酯反应，然后再在光(330-370 nm)的照射下与细胞结合分子进行化学反应。琥珀酰亚胺(NHS)-二氮环丙烯(SDA)连接子也可以是可断裂的(就像SDAD连接子一样，内部包含双硫键)。

在使用NHS酯/叠氮化物连接子的修饰方法中，NHS酯可以首先和细胞结合分子骨架上的胺在pH6-9的缓冲溶液里反应，形成一个稳定的酰胺键。然后，通过Huisgen叠氮-炔环加成反应，特定的多肽、蛋白质或其他功能性分子上的炔基和交联剂另一端的叠氮进行反应，并形成1,2,3-三唑(点击化学)。另外，NHS 酯也可以先与功能性分子上的胺在pH为6-9的缓冲溶液里反应，形成稳定的酰胺键，然后再用结合体上的炔基与连接子另一端的叠氮基团进行Huisgen叠氮-炔环加成反应，并形成1,2,3-三唑连接子。

在使用胺-巯基连接子的修饰方法中，NHS酯可以首先和细胞结合分子骨架上的胺在pH＝6～9的缓冲溶液里反应，形成一个稳定的酰胺键。然后，在pH为 4.5～8.5的条件下，更具特异性的多肽、蛋白质或其他功能性分子上的巯基和连接子另一端的马来酰亚胺，吡啶二巯基或卤代乙酰基反应，并形成硫醚或双硫键。偶联反应的次序也可以根据情况改变。例如，功能性分子上的氨基也可以首先和连接子反应生成酰胺键，然后再与细胞结合分子上的巯基进行反应。在 pH为4.5～7.0的条件下，功能性分子上的巯基可以先与连接子反应形成硫醚或者双硫键，然后再在pH为6～9的条件下与细胞结合分子上的氨基反应形成酰胺键。

在使用巯基-糖连接子的修饰方法中，在pH为4.5～8的条件下，细胞结合分子上的巯基可以首先与马来酰亚胺或吡啶二巯基反应形成硫醚或双硫键。然后，功能性分子上的羰基(醛/酮)再与酰肼反应生成腙键。除此以外，在pH为 4.5～8的条件下，功能分子上的巯基也可以首先和连接子反应形成硫醚或者双硫键，然后再与细胞结合分子上的糖、氧化糖或者羰基(醛/酮)反应生成腙键。

在使用羟基-巯基连接子的修饰方法中，在pH为6～8的条件下，细胞结合分子上的巯基可以首先和马来酰亚胺或者吡啶二巯基反应生成硫醚或双硫键。然后，在pH为8～9的条件下，再让功能性分子上的羟基与异氰酸酯反应生成氨基甲酸酯。另外，功能性分子上的巯基也可以先和连接子在pH为6～8的条件下反应生成硫醚或双硫键。然后，再与细胞结合分子上的羟基在pH为8～9的条件反应生成氨基甲酸酯。

在本发明的另一个方面，用于本发明中的抗体的生产包括体内或体外方法或其组合。生产多克隆抗受体肽抗体的方法在本领域是公知的，例如美国专利 4,493,795中所述。通常是通过将骨髓瘤细胞，与已经用所需抗原免疫的小鼠的脾细胞融合，来制备单克隆抗体(G.；Milstein，C.Nature 1975，256： 495-497)。详细的过程在“Antibodies--ALaboratory Manual，Harlow and Lane， eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1988)”中有描述，此处引作参考。具体地，可以用目标抗原，如从靶细胞、完整的病毒、灭活的全病毒和病毒蛋白质分离的抗原，来免疫小鼠，大鼠，仓鼠或任何其它哺乳动物而制备。通常使用聚乙二醇(PEG)6000将脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过对HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶)的敏感性来筛选融合细胞。通过它们免疫反应特异性受体的能力或抑制靶细胞上的受体活性的能力，可以确定实施本发明的单克隆抗体的杂交瘤。

用于本发明中的单克隆抗体的生产在单克隆杂交瘤培养物里进行，其中包含营养培养基和能分泌具有合适抗原特异性的抗体分子的杂交瘤。培养物在合适的条件下保持足够长的一段时间，以使杂交瘤将抗体分子分泌到培养基。然后收集含有抗体的培养基。使用通过公知的技术进一步分离抗体分子，如蛋白质A亲和层析，阴离子、阳离子、疏水或体积排阻谱法(特别是通过蛋白质A亲和层析和体积排阻谱法)，离心，差异溶解度或任何其他纯化蛋白质的标准技术。

可用于制备这些组合物的培养基在本领域中是公知的，并且可商业获得，也包括合成培养基。一个合成的培养基的例子是Dulbecco最少必需培养基 (DMEM；Dulbecco etal.，Virol.1959,8，396)补充有4.5g/ml葡萄糖，0-20mM 谷氨酰胺，0-20％胎牛血清，几个ppm的Cu，Mn，Fe或Zn等重金属或/和重金属盐，以及消泡剂如聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。

另外，生产抗体的细胞系也可以通过融合以外的技术来获得，例如将成瘤 DNA移植至B淋巴细胞，或成瘤病毒转染，如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV，也称为人类疱疹病毒4(HHV-4))或卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)，见于美国专利4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,451,570；4,466,917； 4,472,500；4,491,632；4,493,890。单克隆抗体也可以通过含末端羧基的抗受体肽或肽制备，这些都为如本领域所公知，可参考文献Niman etal.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，1983，80：4949-4953；Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 1985，82：178-182；Lei et al.Biochemistry 1995，34(20)：6675-6688。通常，作为产生抗受体肽单克隆抗体免疫原，抗受体肽或肽同系物可以单独使用或连接至免疫原性载体。

用作本发明中结合分子的单克隆抗体也可以通过其他本领域已知的技术获得。特别有用的是制造完整人源抗体的方法。一种方法是噬菌体显示技术，它使用亲和富集的方式，可用于选择能与抗原特异性结合的人源抗体。噬菌体展示技术在文献中也有详细描述，噬菌体展示库的构建和筛选在本领域也是众所周知的，可参考文献Dente et al，Gene.1994,148(1)：7-13；Little et al，Biotechnol Adv.1994,12(3)：539-55；Clacksonet al.，Nature 1991,352：264-628；Huse et al.，Science 1989,246：1275-1281。

通过与非人如小鼠细胞融合的杂交瘤产生的单克隆抗体，可以被人源化以避免产生人类抗小鼠抗体。常见的抗体人源化方法是互补决定区移植技术，这些方法也已被详细地描述，如美国专利5,859,205和6,797,492；Liu et al，Immunol Rev.2008，222：9-27；Almagro et al，Front Biosci.2008,13：1619-33；Lazar et al，MolImmunol.2007,44(8)：1986-98；Li et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A. 2006,103(10)：3557-62，此处引为参考。完整人抗体也可以通过用免疫原免疫携带大部分的人类球蛋白重轻链的转基因小鼠、兔子、猴子或其他哺乳动物来制备。这些老鼠的例子有：Xenomouse(Abgenix/Amgen)，HuMAb-Mouse (Medarex/BMS)和VelociMouse(Regeneron)，参考美国专利6,596,541， 6,207,418，6,150,584，6,111,166，6,075,181，5,922,545，5,661,016，5,545,806， 5,436,149和5,569,825。用于人类时，小鼠的可变区域和人的恒定区域也可以被融合，成为“嵌合抗体”，它在人类身上的免疫原性显著低于小鼠单抗 (Kipriyanov et al，MolBiotechnol.2004,26：39-60；Houdebine，CurrOpinBiotechnol.2002,13：625-9)。另外，在抗体可变区域的定点诱变能导致抗体具有较高的亲和性和特异性(Brannigan et al，Nat Rev Mol Cell Biol.2002,3： 964-70；Adams et al，J Immunol Methods.1999，231：249-60)，抗体恒定区域的改变可以提高其介导结合和细胞毒性的效应功能。

恶性肿瘤细胞抗原的免疫特异性抗体也可以从商业途径获得或通过任何已知方法生产，例如化学合成或重组表达技术。对恶性肿瘤细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列编码可以商业获得，例如从GenBank数据库或类似数据库，文献出版物获得，或从常规克隆和测序得到。

除了抗体之外，与目标细胞上的表位或相应的受体相互作用(结合、阻断、靶向或其他类型作用)的一种肽或蛋白质也可以作为结合分子。这些肽或蛋白质可能是任何随机的肽或蛋白质，它们对表位或相应的受体有亲和力，不一定非得是免疫球蛋白家族成员。这些肽可以通过类似噬菌体显示抗体的技术分离出来 (Szardenings，J Recept SignalTransduct Res.2003；23(4)：307-49)。从随机肽库中获得的肽可以同抗体和抗体片段类似地被使用。肽或蛋白质结合分子可以偶联或连接至大分子或其他物质，包括但不限于白蛋白、聚合物、脂质体、纳米粒子、树形分子，只要这样的连接能保留肽或蛋白质的抗原结合特异性。

在癌症、自身免疫性疾病和/或传染性疾病的偶联物上，和药物分子通过本发明的连接体连接的抗体的例子包括，但不限于3F8(抗GD2)，阿巴单抗 (抗CA-125)，阿昔单抗(抗CD41(整联蛋白α-IIb)，阿达木单抗(抗TNF- α)，Adecatumumab(抗EpCAM，CD326)，阿非莫单抗(抗TNF-α)， Afutuzumab(抗CD20)，Alacizumab单抗(抗VEGFR2)，ALD518(抗IL-6)， Alemtuzumab(Campath，MabCampath，抗CD52)，Altumomab(抗CEA)， Anatumomab(抗TAG-72)，Anrukinzumab(IMA-638，抗-IL-13)，，阿奇单抗 (抗-CEA)，阿塞珠单抗(抗-L-选择蛋白CD62L)，Atlizumab(tocilizumab， Actemra，RoActemra，抗-IL-6受体)，Atorolimumab(抗-Rhesus因子)， Bapineuzumab(抗-β淀粉样蛋白)，Basiliximab(Simulect，抗CD25(IL-2受体的α链))，Bavituximab(抗磷脂酰丝氨酸)，Bectumomab(LymphoScan，抗- CD22)，贝利单抗(Benlysta，LymphoStat-B，抗BAFF)，Benralizumab(抗CD125)，Bertilimumab(抗CCL11(eotaxin-1))，Besilesomab(Scintimun，抗 CEA相关抗原)，贝伐单抗(Avastin，抗VEGF-A)，Biciromab(FibriScint，抗纤维蛋白IIβ链)，Bivatuzumab(抗-CD44v6)，Blinatumomab(BiTE，抗 CD19)，Brentuximab(cAC10，抗-CD30TNRSF8)，Briakinumab(抗IL-12， IL-23)，Canakinumab(Ilaris，抗IL-1)，Cantuzumab(C242，抗CanAg)， Capromab，Catumaxomab(Removab，抗EpCAM，抗CD3)，CC49(抗TAG- 72)，Cedelizumab(抗CD4)，Certolizumab单抗(Cimzia抗TNF-α)，西妥昔单抗(爱必妥，IMC-C225，抗EGFR)，Citatuzumab bogatox(抗EpCAM)， Cixutumumab(抗IGF-1)，Clenoliximab(抗CD4)，Clivatuzu-mab(抗 MUC1)，Conatumumab(抗TRAIL-R2)，CR6261(抗流感A血凝素)，Dacetuzumab(抗CD40)，Daclizumab(Zenapax，抗CD25(IL-2受体α链))， Daratumumab(抗CD38(环ADP核糖水解酶)，Denosumab(Prolia，抗 RANKL)，Detumomab(抗B淋巴瘤细胞)，Dorlimomab，Dorlixizumab， Ecromeximab(抗GD3神经节苷脂)，Eculizumab(Soliris，抗-C5)， Edobacomab(抗内毒素)，Edrecolomab(Panorex，MAb17-1A，抗-EpCAM)， Efalizumab(Raptiva，抗LFA-1(CD11a))，Efungumab(Mycograb，抗 Hsp90)，Elotuzumab(抗SLAMF7)，Elsilimomab(抗IL-6)，Enlimomab单抗 (抗ICAM-1(CD54))，Epitumomab(抗episialin)，依他珠单抗(抗- CD22)，Erlizumab(抗-ITGB2(CD18))，Ertumaxomab(Rexomun，抗 HER2/neu，CD3)，依他拉单抗(Abegrin，抗整联蛋白αvβ3)，Exbivirumab (抗乙肝表面抗原)，Fanolesomab(NeutroSpec，抗CD15)，Faralimomab(抗干扰素受体)，Farletuzumab(抗叶酸受体1)，Felvizumab(抗呼吸道合胞病毒)，Fezakinumab(抗-IL-22)，Figitumumab(抗-IGF-1受体)，Fontolizumab (抗-IFN-γ)，Foravirumab(抗狂犬病病毒糖蛋白)，Fresolimumab(抗TGF- β)，Galiximab(抗CD80)，Gantenerumab(抗β淀粉样蛋白)，Gavilimomab (抗CD147(basigin))，Gemtuzumab(抗CD33)，Girentuximab(抗碳酸酐酶 9)，Glembatumumab(CR011，抗GPNMB)，Golimumab(Simponi，抗-TNF- α)，Gomiliximab(抗-CD23(IgE受体))，Ibalizumab(抗-CD4)，Ibritumomab(抗CD20)，Igovomab(Indimacis-125，抗CA-125)，Imciromab (Myoscint，抗心肌肌凝蛋白)，Infliximab(Remicade，抗TNF-α)， Intetumumab(抗CD51)，Inolimomab(抗CD25(IL-2受体α链)，伊珠单抗(抗 -CD22)，Ipilimumab(抗CD152)，Iratumumab(抗CD30(TNFRSF8))， Keliximab(抗-CD4)，Labetuzumab(CEA-Cide，抗CEA)，Lebrikizumab(抗 IL-13)，Lemalesomab(抗NCA-90(粒细胞抗原))，Lerdelimumab(抗TGFβ2)，Lexatumumab(抗TRAIL-R2)，Libivirumab(抗乙肝表面抗原)， Lintuzumab(抗CD33)，鲁米木单抗(抗CD40)，鲁米单抗(抗CD23(IgE受体)，Mapatumumab(抗TRAIL-R1)，马西莫单抗(抗T-细胞受体)，马妥珠单抗(抗EGFR)，Mepolizumab(Bosatria，抗IL-5)，Metelimumab(抗 TGFβ1)，Milatuzumab(抗CD74)，Minretumomab(抗TAG-72)，Mitumomab(BEC-2，抗GD3神经节苷脂)，Morolimumab(抗恒河猴因子)，Motavizumab (Numax，抗呼吸道合胞病毒)，Muromonab-CD3(Orthoclone OKT3，抗 CD3)，Nacolomab(抗C242)，Naptumomab(抗5T4)，那他珠单抗 (Tysabri，抗整联蛋白α4)，奈巴单抗(抗内毒素)，Necitumumab(抗EGFR)，Nerelimomab(抗-TNF-α)，Nimotuzumab(Theracim，Theraloc，抗- EGFR)，Nofetumomab，Ocrelizumab(抗CD20)，奥利木单抗(Afolimomab，抗LFA-1(CD11a))，Ofatumumab(Arzerra，抗CD20)，Olaratumab(抗 PDGF-Rα)，Omalizumab(Xolair，抗IgE Fc区)Oportuzumab(抗EpCAM)， Oregovomab(OvaRex，抗CA-125)，Otelixizumab(抗CD3)，Pagibaximab(抗脂磷壁酸)，Palivizumab(Synagis，Abbosynagis，抗呼吸道合胞病毒)，帕尼单抗(Vectibix，ABX-EGF，抗EGFR)，Panobacumab(抗铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa))，帕考珠单抗(抗IL-4)，Pemtumomab (Theragyn，抗MUC1)，Pertuzumab(Omnitarg，2C4，抗HER2/neu)， Pexelizumab(抗C5)，Pintumomab(抗腺癌抗原)，Priliximab(抗-D4)， Pritumumab(抗波形蛋白)，PRO140(抗-CCR5)Racotumomab(1E10，抗-N- 羟乙酰神经氨酸(NeuGc，NGNA)-神经节苷脂GM3))，Rafivirumab(抗狂犬病病毒糖蛋白)，Ramucirumab(抗VEGFR2)，Ranibizumab(Lucentis，抗VEGF-A)，Raxibacumab(抗毒素，保护性抗原)，Regavirumab(抗巨细胞病毒糖蛋白B)，Reslizumab(抗-IL-5)，Rilotumumab(抗-HGF)，Rituximab (MabThera，Rituxanmab，抗-CD20)，Robatumumab(抗-IGF-1受体)， Rontalizumab(抗IFN-α)，Rovelizumab(LeukAr-rest，抗CD11，CD18)，Ruplizumab(Antova，抗CD154(CD40L))，Satumomab(抗TAG-72)， Sevirumab(抗巨细胞病毒)，Sibrotuzumab(抗FAP)，西法木单抗(抗IFN- α)，Siltuximab(抗IL-6)，Siplizumab(抗CD2)，Smart MI95(抗CD33)， Solanezumab(抗β淀粉状蛋白)，Sonepcizumab(抗鞘氨醇-1-磷酸)， Sontuzumab(抗-episialin)，Stamulumab(抗-myostatin)，Sulesomab(LeukoScan，抗NCA-90(粒细胞抗原))，Tacatuzumab(抗α甲胎蛋白)， Tadocizumab(抗整联蛋白αIIbβ3)，Talizumab(抗IgE)，Tanezumab(anti- NGF)，Taplitumomab(抗CD19)，Tefibazumab(Aurexis，(抗凝聚因子 A))，Telimomab，Tenatumomab(抗腱生蛋白C)，Teneliximab(抗CD40)， Teplizumab(抗CD3)，TGN1412(抗CD28)，Ticilimumab(Tremelimumab，抗 -CTLA-4)，Tigatuzumab(抗TRAIL-R2)，TNX-650(抗IL-13)，Tocilizumab (Atlizumab，Actemra，RoActemra，IL-6受体)，Toralizumab(抗CD154(CD40L))，Tositumomab(抗CD20)，曲妥珠单抗(赫赛汀，抗 HER2/neu)，Tremelimumab(抗CTLA-4)，Tucotuzumab celmoleukin(抗 EpCAM)，Tuvirumab(抗乙型肝炎病毒)，Urtoxazumab(抗大肠杆菌)， Ustekinumab(Stelara，抗-IL-12，IL-23)，Vapaliximab(抗-AOC3(VAP- 1))，维多珠单抗(抗整联蛋白α4β7)，维妥珠单抗(抗CD20)， Vepalimomab(抗AOC3(VAP-1))，Visilizumab(Nuvion，抗CD3)，Vitaxin (抗血管整合素avb3)，Volociximab(抗整联蛋白α5β1)，Votumumab (HumaSPECT，抗肿瘤抗原CTAA16.88)，Zalutumumab(HuMax-EGFR， Zanolimumab(HuMax-CD4，抗-CD4)，Ziralimumab(抗-CD147(basigin))， Zolimomab(抗-CD5)，依那西普Alefacept AbataceptRilonacept(Arcalyst)，14F7(抗IRP-2(铁调节蛋白 2))，14G2a(抗GD2神经节苷脂，源于Nat.Cancer Inst.，黑素瘤和实体瘤)，J591(抗-PSMA，源于Weill Cornell医学院，前列腺癌)，225.28S (抗HMW-MAA(高分子量黑素瘤相关抗原)，Sorin Radiofarmaci SRL(源于意大利米兰，黑素瘤)，COL-1(抗CEACAM3，CGM1，源于Nat Cancer Inst.结肠直肠癌和胃癌)，CYT-356(前列腺癌)，HNK20 (OraVax Inc.呼吸道合胞病毒感染)，ImmuRAIT(源于Immunomedics，NHL)，Lym-1(抗HLA-DR10，PeregrinePharm)，MAK-195F(抗TNF(肿瘤坏死因子，TNFA，TNF-α，TNFSF2，源于Abbott/Knoll，脓毒症中毒性休克)，MEDI-500(T10B9，抗CD3，TRαβ(T细胞受体α/β)，源于MedImmune Inc，用于移植物抗宿主疾病病)，RING SCAN(抗TAG 72(肿瘤相关糖蛋白 72)，源于NeoprobeCorp.，用于乳腺癌，结肠癌和直肠癌)，Avicidin(抗 EPCAM(上皮细胞粘附分子))，抗-TACSTD1(肿瘤相关钙信号转导1)，抗 GA733-2(胃肠肿瘤相关蛋白2)，抗EGP-2(上皮糖蛋白2)，抗KSA，KS1/4抗原，M4S，肿瘤抗原17-1A，CD326(源于NeoRx公司，结肠癌，卵巢癌，前列腺癌和NHL)，LymphoCide(源于Immunomedics)，Smart ID10(源于Protein DesignLabs)，Oncolym(源于Techniclone Inc)，Allomune(源于 BioTransplant)，抗VEGF(源于Genentech)，CEAcide(源于Immunomedics)， IMC-1C11(源于ImClone Systems)和Cetuximab(源于ImClone)。

其他可作为细胞结合分子/配体的抗体，包括但不限于，以下抗原的抗体：氨肽酶N(CD13)，膜联蛋白A1，B7-H3(CD276，各种癌症)，CA125(卵巢癌)，CA15-3(各种癌症)，CA19-9(各种癌症)，L6(各种癌症)，路易斯Y (各种癌症)，路易斯X(各种癌症)，甲胎蛋白(各种癌症)，CA242(结直肠癌)，胎盘碱性磷酸酶(各种癌症)，前列腺特异抗原(前列腺癌)，前列腺酸磷酸酶(前列腺癌)，表皮生长因子(各种癌症)，CD2(霍奇金症，NHL淋巴瘤，多发性骨髓瘤)，CD3ε(T细胞淋巴瘤，肺癌，乳腺癌，胃癌，卵巢癌，自身免疫性疾病，恶性腹水)，CD19(B细胞恶性肿瘤)，CD20(非霍奇金淋巴瘤)，CD22(白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，SLE)，CD30(霍奇金淋巴瘤)，CD33(白血病，自身免疫性疾病)，CD38(多发性骨髓瘤)，CD40 (淋巴瘤，多发性骨髓瘤，白血病(CLL))，CD51(转移性黑素瘤，肉瘤)，CD52(白血病)，CD56(小细胞肺癌，卵巢癌，梅克细胞癌，以及液体肿瘤，多发性骨髓瘤)，CD66e(各种癌症)，CD70(转移性肾细胞癌和非霍奇金淋巴瘤)，CD74(多发性骨髓瘤)，CD80(淋巴瘤)，CD98(各种癌症)，粘液素(各种癌症)，CD221(实体肿瘤)、CD227(乳腺癌、卵巢癌)、 CD262(非小细胞肺癌及其他癌症)、CD309(卵巢癌)、CD326(实体肿瘤)、CEACAM3(结肠直肠癌、胃癌)、CEACAM5(癌胚抗原，CEA， CD66e)(乳腺，结直肠癌和肺癌)，DLL4，EGFR(表皮生长因子受体，各种癌症)，CTLA4(黑素瘤)，CXCR4(CD184，血液肿瘤，实体肿瘤)， Endoglin(CD105，实体瘤)，EPCAM(上皮细胞粘附分子，膀胱癌，头颈癌，结肠癌，NHL前列腺癌，卵巢癌)，ERBB2(表皮生长因子受体2，肺癌，乳腺癌，前列腺癌)，FCGR1(自身免疫性疾病)，FOLR(叶酸受体，卵巢癌)， GD2神经节苷(各种癌症)，G-28(细胞表面抗原糖脂质，黑素瘤)，GD3独特型(各自癌症)，热休克蛋白(各种癌症)，HER1(肺癌，胃癌)，HER2 (乳腺癌，肺癌和卵巢癌)，HLA-DR10(NHL)，HLA-DRB(NHL，B细胞白血病)，人绒毛膜促性腺激素(各种癌症)，IGF1R(类胰岛素生长因子1受体，实体瘤，血癌)，IL-2受体(白介素2受体，T细胞白血病和淋巴瘤)，IL-6R (白介素6受体，多发性骨髓瘤，风湿性关节炎，Castleman病，白细胞介素6依赖肿瘤)，整合蛋白(αvβ3、α5β1、α6β4、αllβ3、α5β5、αvβ5，各种癌症)， MAGE-1(各种癌症)，MAGE-2(各种癌症)，MAGE-3(各种癌症)，MAGE 4(各种癌症)，抗转铁蛋白受体(各种癌症)，p97(黑素瘤)，MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员1，非霍奇金B细胞淋巴瘤，白血病)，MUC1或MUC1- KLH(乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、支气管癌和α胃肠道癌)，MUC16 (CA125)(卵巢癌)，CEA(结直肠癌)，gp100(黑素瘤)，MART1(黑素瘤)，MPG(黑素瘤)，MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员1，小细胞肺癌，NHL)，Nucleolin，Neu癌基因产物(各自癌症)，P21(各种癌)，抗(N- 羟乙酰神经氨酸)抗体结合部位(乳腺癌，黑素瘤)，类PLAP睾丸碱性磷酸酶(卵巢癌、睾丸癌)，PSMA(前列腺瘤)，PSA(前列腺癌)，ROBO4， TAG 72(肿瘤相关糖蛋白72，AML，胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌)，T细胞跨膜蛋白(各种癌症)，Tie(CD202b)，TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B，各种癌症)，TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B，多发性骨髓瘤，NHL，其他癌症，RA和SLE)，TPBG(滋养细胞糖蛋白，肾细胞癌)，TRAIL-R1(TNF相关坏死诱导配体受体1，淋巴瘤，NHL，结直肠癌，肺癌)，VCAM-1(CD106，黑素瘤)，VEGF，VEGF-a，VEGF-2(CD309) (各种癌症)。其它可被抗体识别的，肿瘤相关抗原已被总结和评述(Gerber， et al，mAbs 2009，1：3，247-253；Novellino et al，Cancer ImmunolImmunother. 2005，54(3)，187-207；Franke，etal，Cancer BiotherRadiopharm.2000，15， 459-76)。

这些抗原的例子包括：许多其他分化簇(CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、 CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD14、CD15、CD16、 CDw17、CD18、CD21、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、 CD31、CD32、CD34、CD35、CD36、CD37、CD41、CD42、CD43、CD44、 CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD53、CD54、CD55、CD58、 CD59、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD68、CD69、CD71、 CD72、CD79、CD81、CD82、CD83、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、 CD91、CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD106、CD109、CD117、 CD120、CD127、CD133、CD134、CD135、CD138、CD141、CD142、 CD143、CD144、CD147、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、 CD163、CD166、.CD168、CD184、CDw186、CD195、CD202(a、b)、 CD209、CD235a、CD271、CD303、CD304)、膜联蛋白A1、核仁素、内皮糖蛋白(CD105)、ROBO4、氨基肽酶N、Δ-样4(DLL4)、VEGFR-2(CD309)、CXCR49、CD184)、Tie2、B7-H3、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6E7、EGFRvIII、EGFR、HER-2/neu、独特型、MAGE A3、P53nonmutant、 NY-ESO-1、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras突变、gp100、p53突变体、 Proteinase3(PR1)、BCR-abl、Tyrosinase、Survivin、hTERT、Sarcomatranslocation breakpoints、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG (TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、Androgen受体、细胞周期素B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、Fucosyl GM1、间皮素、 PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、 GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、 PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、 MAD-CT-2、Fos蛋白相关抗原1。

在另一个实施例中，本发明的用于冻干的液体配方或配制的冻干粉具有以下具体组成：主要成分为如式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、 (VI))或(VII)的偶联物，重量百分比1％-95％；0.0％-15.0％多元醇； 0.0％-0.5％的一种或多种表面活性剂；0.0％-10％的一种或多种氨基酸，0.0％- 5％的防腐剂和0.0％-10％的缓冲盐，以调节pH至4.5-8.5。

在另一个具体的实施例中，本发明的用于冻干的液体配方或配制的冻干粉具有以下具体组成：主要成分为如式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、 (VI)或(VII)偶联物，重量百分比10％-85％；0.0％-10.0％多元醇，选自蔗糖或海藻糖二水合物；0.1％-0.25％的一种或多种表面活性剂，选自聚山梨酯20 或聚山梨酯80；0.0％-10％的一种或多种氨基酸，选自胱氨酸，甘氨酸，赖氨酸，组氨酸，鸟氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，丙氨酸，甘氨酸，谷氨酸或天冬氨酸；0.5％-5％的防腐剂，选自如苯甲醇，1％-10％缓冲盐，选自柠檬酸钠或柠檬酸水合物，以调节pH至5-7。

在另一个具体的实施方案中，本发明的用于冻干的液体配方或配制的冻干粉具有以下具体组成：主要成分为如式(I)、(II)、(III)、(IV)、 (V)、(VI)或(VII)偶联物，重量百分比15％-85％；3％-8％的多元醇，选自蔗糖或海藻糖二水合物；0.1％-0.25％的一种或多种表面活性剂，选自聚山梨酯20或聚山梨酯80；0.0％-8.0％的一种或多种氨基酸，选自精氨酸，甘氨酸，组氨酸，鸟氨酸或丙氨酸；以及2.0％-10.0％缓冲盐，选自柠檬酸钠或柠檬酸水合物，以调节pH至5-6。

在另一具体的实施例中，本专利申请的tubulysin衍生物与细胞结合分子偶联物用于癌症的组合物和方法。目标癌症包括但不限于，肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、大脑肿瘤(脑干神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、类癌肿瘤、胃肠道癌症、未知小细胞癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、尤因家族肿瘤(PNET)、颅内生殖细胞肿瘤、眼癌、眼内黑素瘤、胆囊癌、胃癌(胃癌)、性腺外生殖细胞瘤、孕周滋养细胞瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病(急性淋巴细胞，急性髓系，慢性淋巴细胞，慢性粒细胞，毛细胞)、嘴唇和口腔癌症、肝癌、肺癌(非小细胞，小细胞)、淋巴瘤 (艾滋病相关，中枢神经系统的，皮肤T细胞的，霍奇金病，非霍奇金病)、恶性间皮瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、转移性鳞状颈癌与隐匿性原发性癌、多发性骨髓瘤和其他浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌(上皮、生殖细胞瘤、低恶性肿瘤)、胰腺癌(外分泌，胰岛细胞癌)、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞肿瘤、前列腺癌横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管(移行细胞)、唾腺癌、赛塞里综合症、皮肤癌(皮肤T细胞淋巴瘤，卡波西氏肉瘤，黑素瘤)、小肠肿瘤、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、胸腺瘤(恶性)、甲状腺癌、尿道癌症、子宫癌、不寻常的少年的癌症、阴道肿瘤、外阴肿瘤和维尔姆斯瘤。

在另一个具体的实施例中，本专利申请的tubulysin衍生物-细胞结合分子偶联物用于或预防自身免疫疾病的组合物和方法。自身免疫性疾病包括但不限于，Achlorhydra自身免疫性活动性慢性肝炎、急性播散性脑脊髓炎、急性出血性脑白质炎、艾迪生病、无精症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗GBM/TBM肾炎、抗磷脂综合征、抗异常酶综合征、关节炎、特应性过敏、特应性皮炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴组织增生综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌综合征I、II和III型、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性葡萄膜炎、Balo病/Balo同心硬化症、Bechets综合征、Berger 氏病、Bickerstaff脑炎、Blau综合征、大疱性类天疱疮、Castleman病、Chagas 病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、慢性莱姆病、慢性阻塞性肺病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、乳糜泄、Cogan综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏症、颅骨动脉炎、CREST综合征、Crohns病(特发性炎症性肠病)、库欣综合征、皮肤白细胞增多性血管炎、德戈氏病、Dercum氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、Dressler综合征、盘状红斑狼疮、湿疹、子宫内膜异位症、附着点炎相关的关节炎、Eosinophilic筋膜炎、大疱性表皮松解症、结节性红斑、特发性混合性冷球蛋白血症、伊文氏综合征、纤维发育不良性骨化症、纤维肌痛、纤维化性肌炎、纤维性肺泡炎、胃炎、胃肠类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘尔综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠性肝炎、化脓性汗腺炎、休斯综合征(抗磷脂综合征)、低丙球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘疾病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(自身免疫性血小板减少性紫癜)、IgA肾病(伯杰氏病)、包涵体肌炎、炎性脱髓鞘性多神经炎、间质性膀胱炎、过敏性肠综合征、少年特发性关节炎、青少年类风湿性关节炎、川崎氏病、朗伯-伊顿重症肌无力综合征、白细胞碎屑性血管炎、扁平苔癣、硬化性硬化症、线状IgA疾病(LAD)、Lou Gehrig病(也称肌萎缩侧索硬化症)、狼疮性肝炎、红斑狼疮、Majeed综合征、美尼尔氏病、显微镜下多动脉炎、米勒-费希尔综合征、混合性结缔组织病、硬斑病、穆罕默德-哈贝曼病、麦考利综合征、多发性骨髓瘤、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、嗜睡症、视神经脊髓炎(Devic病)、神经性肌强直、眼睑瘢痕性类天疱疮、Opsoclonus myoclonus综合征、Ord甲状腺炎、回文风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神病)、Paraneoplastic小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、ParryRomberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、睫状体平部炎、天疱疮、寻常型天疱疮、贫血、周围脑脊髓炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎症性神经病变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、坏疽性皮肤炎、纯红细胞再生障碍、Rasmussen脑炎、雷诺现象、复发性多软骨炎、赖特综合征、不宁腿综合症、后神经纤维化、类风湿性关节炎、类风湿热、结节病、精神分裂症、施密特综合征、Schnitzler综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、粘稠血症、Still病、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克综合征、Sweet综合征、小舞蹈病、交感神经性贫血、Takayasu动脉炎、颞动脉炎(巨细胞动脉炎)、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎 (特发性炎性肠病)、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、血管炎、白癜风、韦格纳肉芽肿病、威尔逊氏综合征、威斯科特-奥尔德里奇综合征。

在另一个具体的实施例中，本专利申请中用于或预防自身免疫疾病的偶联物上的细胞结合分子，包括但不限于，抗弹性蛋白抗体、Abys抗上皮细胞抗体、抗地下室膜IV型胶原蛋白抗体、抗核抗体、抗ds DNA、抗ss DNA、抗心磷脂抗体IgM、IgG、抗乳糜泻抗体、抗磷脂抗体IgK、IgG、抗SM抗体、抗线粒体抗体、甲状腺抗体、微粒体抗体、T细胞抗体、甲状腺球蛋白抗体、抗 SCL-70、抗Jo、抗U.sub.1RNP、抗La/SSB、抗SSA、抗SSB、抗壁细胞抗体、抗组蛋白、抗RNP、C-ANCA、P-ANCA、抗着丝粒、抗纤维蛋白原、抗 GBM抗体、抗神经节苷脂抗体、抗Desmogein 3抗体、抗p62抗体、抗sp100 抗体、抗线粒体(M2)抗体、类风湿因子抗体、抗MCV抗体、抗拓扑异构酶抗体、抗中性粒细胞胞质(cANCA)抗体。

在某些优选的实施例中，本专利申请中偶联物上的细胞结合分子，可以与自身免疫性疾病相关的激活淋巴细胞上表达的受体或受体复合物相结合。受体或受体复合物包含，免疫球蛋白基因超家族成员(例如CD2、CD3、CD4、 CD8、CD19、CD22、CD28、CD70、CD79、CD90、CD152/CTLA-4、PD-1或 ICOS)、TNF受体超家族成员(例如CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/OX40、CD137/4-1BB、INF-R1、TNFR-2、RANK、TACI、BCMA、骨保护素、Apo2/TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4和APO-3)、整合蛋白、细胞因子受体、趋化因子受体、主要组织相容性蛋白、凝集素(C型、 S型或I型)或补体控制蛋白。

在另一个具体实施例中，可用的对病毒或微生物抗原具有免疫特异性的细胞结合配体是人源化或人单克隆抗体。“病毒抗原”包括但不限于，任何能够引发免疫应答的病毒肽，多肽蛋白(例如HIV gp120、HIV nef、RSV F糖蛋白、流感病毒神经氨酸苷酶、流感病毒血凝素、HTLV Tax、疱疹单纯疱疹病毒糖蛋白(例如gB、gC、gD和gE)和乙型肝炎表面抗原)。“微生物抗原”包括但不限于，任何能够引发免疫应答的微生物肽、多肽、蛋白质、糖、多糖或脂质分子(例如细菌、真菌、致病原生动物或酵母多肽、包括如LPS和荚膜多糖 5/8)。可用于病毒或微生物感染的抗体的实例，包括但不限于：帕利珠单抗，它是用于RSV感染的，人源化抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体； PRO542，是一种CD4融合抗体，用于HIV感染；奥斯他韦，是一种用于乙型肝炎病毒的人抗体；PROTVIR，是一种人源化IgG1抗体，用于巨细胞病毒，和抗LPS抗体。

本专利申请的tubulysin衍生物-细胞结合分子可用于感染性疾病。这些感染性疾病包括但不限于，不动杆菌属感染、放线菌病、非洲昏睡病(非洲锥虫病)、艾滋病(获得性免疫缺陷综合症)、阿米巴病、无形体病、、溶血性耶尔森菌感染、阿根廷出血热、蛔虫病、曲霉病、星状病毒感染、巴贝斯虫病、蜡状芽孢杆菌感染、细菌性肺炎、细菌性阴道炎、类杆菌感染、小袋虫病、蛔虫感染、BK病毒感染、黑发结节病、人芽囊原虫感染、芽生菌病、玻利维亚出血热、疏螺旋体感染、肉毒中毒(和婴儿肉毒中毒)、巴西出血热、布鲁氏杆菌病、伯克霍尔德氏菌感染、布鲁里溃疡、杯状病毒感染(诺如病毒和沙波病毒)、弯曲杆菌病、念珠菌病(念珠菌病、鹅口疮)、猫抓病、蜂窝组织炎、Chagas病(美洲锥虫病)、子囊、水痘、衣原体、肺炎衣原体感染、、素母细胞瘤、华支睾吸虫、艰难梭状芽孢杆菌感染、球孢子菌病、科罗拉多蜱热病、普通感冒(急性病毒性鼻咽炎、急性鼻炎)、克雅氏病、克里米亚-刚果出血热、隐球菌病、隐孢子虫病、皮肤幼虫迁徙、环孢子虫病、肠杆菌感染、肠道病毒感染、流行性斑疹伤寒、传染性红斑(第五种疾病)、急疹、姜片虫病、肝片吸虫病、致命性家族性失眠、丝虫病、产气荚膜梭菌食物中毒、自由活体阿米巴感染、梭杆菌感染、气性坏疽(梭菌性肌坏死)、地丝菌病、格斯特曼-斯特拉斯勒-谢克尔病综合征、贾第鞭毛虫病、马鼻疽、淋病、肉芽肿性腹泻(第五性病)、A链球菌感染、B链球菌感染、流感嗜血杆菌感染、手足口病(HFMD)、汉坦病毒肺综合征、幽门螺杆菌感染、溶血性尿毒综合征、肾综合征出血热、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、单纯性疱疹、组织胞浆菌病、钩虫感染、人类博卡病毒感染、人类 ewingii埃里希体病、人类粒细胞无形体病、人类偏肺病毒感染、人类单核细胞埃里希体病、人乳头瘤病毒感染、人副流感病毒感染、膜壳绦虫病、艾巴氏病毒传染性单核细胞增多症(单)、流行性感冒、等孢子虫病、川崎病、角膜炎、金格杆菌感染、库鲁病、拉沙热、军团病(退伍军人症)、军团病(庞蒂亚克热)、利什曼病、莱姆病、淋巴丝虫病(象皮病)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、疟疾、马尔堡出血热、麻疹、类鼻疽病(惠氏病)、脑膜炎、脑膜炎球菌病、后殖吸虫病、微孢子虫病、传染性软疣、腮腺炎、小鼠斑疹伤寒(地方性斑疹伤寒)、支原体肺炎、足菌肿、蝇蛆病、新生儿结膜炎(新生儿眼病)、变异型克雅氏病(vCJD、nvCJD)、诺卡氏菌病、盘尾丝虫病(河盲症)、副球孢子菌病(南美芽生菌病)、肺吸虫病、巴斯德氏菌病、头虱、体虱、阴虱、盆腔炎、百日咳、鼠疫、肺炎球菌感染、肺孢子虫肺炎、肺炎、脊髓灰质炎、普氏菌感染、原发性阿米巴脑膜脑炎、进行性多灶性白质脑病、鹦鹉热、Q热、狂犬病、鼠咬热、呼吸道合胞病毒感染、鼻孢子虫病、鼻病毒感染、立克次体感染、立克次体痘、裂谷热、落基山斑疹热、轮状病毒感染、风疹、沙门氏菌病、SARS(严重急性呼吸综合征)、疥疮、血吸虫病、败血症、志贺氏菌病(Bacillary痢疾)、带状疱疹(带状疱疹)、天花(天花)、孢子丝菌、葡萄球菌食物中毒、感染金黄葡萄球菌、粪类圆线虫病、梅毒、绦虫病、破伤风、须癣(Barber痒)、头皮癣、体癣、股癣、手癣、掌黑癣、足 癣、甲癣(灰指甲)、花斑癣、弓蛔虫病(眼幼虫移行症)、弓蛔虫病(内脏幼虫移行症)、弓形体病、旋毛虫病、滴虫病、鞭虫病(鞭虫感染)、、兔热病、解脲脲原体感染、委内瑞拉马脑炎、委内瑞拉出血热、病毒性肺炎、西尼罗河热、白毛结节病(白癣)、假结核耶尔森氏菌、耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病、黄热病、接合菌病。

本发明的细胞结合剂，优选为抗体，对抗的病原菌株包括但不限于，鲍氏不动杆菌、以列放线菌、放线菌和丙酸杆菌、布氏锥虫、HIV(人免疫缺陷病毒病毒)、溶组织内阿米巴、无形体属、芽孢杆菌、溶血弧菌、胡宁病毒、蛔虫属、曲霉属、星状病毒科、巴贝虫属、蜡状芽孢杆菌、多种细菌、拟杆菌属、大肠杆菌、蛔虫属、BK病毒、结节菌、人芽囊原虫、皮炎芽生菌、马丘波病毒、疏螺旋体属、肉毒梭菌、清风藤属、布鲁氏菌属、通常为洋葱伯克霍尔德菌和其他伯克霍尔德氏菌种、溃疡分枝杆菌、杯状病毒科、弯曲杆菌属、通常为白假丝酵母和其他假丝酵母属、汉赛巴尔通体、A链球菌和葡萄球菌、克氏锥虫、杜克雷嗜血杆菌、VZV、沙眼衣原体、科罗拉多蜱热病毒、鼻病毒、冠状病毒、CJD朊病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、新型隐球菌、隐孢子虫属、巴西钩虫、多种寄生虫、环孢子虫、带状绦虫、巨细胞病毒、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)-黄病毒、脆弱双歧杆菌、白喉棒状杆菌、裂头绦虫、麦地那龙线虫、埃博拉病毒、棘球绦虫属、埃立克体肠球菌属、肠道病毒属、普氏立克次体、细小病毒B19、人疱疹病毒6和人疱疹病毒7、布氏姜片虫、肝片吸虫和巨大片吸虫、FFI朊病毒、丝虫目超家族、产气荚膜梭菌、梭杆菌属、其他梭状芽孢杆菌、白地霉、GSS朊病毒、肠道贾第虫、伯克霍尔德氏菌、刺孢小芽孢杆菌和革兰氏假丝酵母、淋球菌、肉芽肿克雷伯氏菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、流感嗜血杆菌、肠道病毒、主要是柯萨奇A病毒和肠道病毒71、无名病毒、幽门螺旋杆菌、大肠杆菌O157： H7、布尼亚病毒科、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、荚膜组织胞浆菌、十二指肠腺瘤和壶腹癌流感嗜血杆菌、人博卡病毒、埃里希体、嗜吞噬细胞无嗜血杆菌、人偏肺病毒、查菲埃里希体、人乳头瘤病毒、人副流感病毒、微小膜壳绦虫和缩小膜壳绦虫、艾巴氏病毒、正粘病毒科家族、贝氏等孢球虫、金格杆菌、肺炎克雷伯菌、克雷伯氏菌、嗜肺军团菌、嗜肺军团菌、嗜肺军团菌、利什曼原虫属、麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌、钩端螺旋体属、单核细胞增多性李斯特氏菌、伯氏疏螺旋体和其他疏螺旋体属物种、班氏旋毛虫和马来丝虫、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)疟原虫属、马尔堡病毒、麻疹病毒、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、横川后殖吸虫、小孢子虫目门、传染性软疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、伤寒立克次氏体、肺炎支原体、多种细菌和真菌寄生双翅蝇幼虫、沙眼衣原体和淋病奈瑟菌、vCJD朊病毒、诺卡氏菌和其他诺卡氏菌属、盘尾丝虫属、盘鲍拟亚科、副龙属西马尼和其他副属、巴斯德氏菌属、头虱、人体虱、百日咳博德特氏菌鼠疫耶尔森氏菌、肺炎链球菌、肺炎球菌、脊髓灰质炎病毒、普雷沃氏菌属、奈氏格氏杆菌、JC病毒、鹦鹉热衣原体、伯氏考克斯体、狂犬病病毒、单链球菌和螺旋菌、呼吸道合胞病毒、鼻孢子菌、鼻病毒、立克次体属、由小株立克次体、裂谷热病毒、立克次体立克次体、轮状病毒、风疹、沙门氏菌属、SARS冠状病毒、人疥螨、血吸虫属、体细胞属、志贺菌属、水痘带状疱疹病毒、天花少校或天花小、申克孢子丝菌、金黄葡萄球菌属、金黄葡萄球菌、链球菌化脓、圆线虫、梅毒螺旋体、绦虫属、破伤风、癣属癣音铀、癣属、絮状表皮癣菌、红毛癣菌、须毛癣菌、红毛癣菌、威尼克外瓶黴、毛癣菌属属、细胞死亡属、弓箭毒或弓箭毒、刚地弓形虫、旋毛虫、阴道毛滴虫、三丘里三种、结核分枝杆菌、弗朗西拉图拉菌、尿素和马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、弧菌、瓜纳里托病毒、西尼罗河病毒、beigelii丝孢、假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、黄热病病毒、毛霉菌目阶(毛霉菌病)和虫霉目阶(虫霉属真菌病)、毛霉菌目绿脓杆菌、弯曲杆菌(弧菌)、气单胞菌、艾氏菌、耶尔森氏菌、志贺痢疾杆菌、志贺氏杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、雅司螺旋体、奋森氏螺旋体、伯氏疏螺旋体、细螺旋体、卡氏肺孢子虫、流产布鲁氏菌、布鲁杆菌、布鲁氏菌、支原体属、普氏立克次体、恙虫病立克次氏体、衣原体属、致病性真菌(烟曲霉、白念珠菌、荚膜组织胞浆菌)、原生动物(溶组织内阿米巴、Tenas毛滴虫、Hominis毛滴虫、冈比亚锥虫、罗得西亚锥虫、罗氏利什曼原虫、热带利什曼原虫、巴西利什曼原虫、肺孢子虫肺炎、间日疟原虫、恶性疟原虫、疟原虫疟疾)或Helminiths(日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫和钩虫)。

用作本专利申请中的细胞结合剂，病毒性疾病的其他抗体，包括但不限于，抗下列致病性病毒抗原的抗体：痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、小黄病毒、肠病毒、小核糖核酸病毒、细小病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、流感病毒、副流感病毒、腮腺炎、麻疹、呼吸道合胞病毒、风疹、虫媒病毒、弹状病毒、沙门氏菌、非a/非b型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、罗托病毒、致癌病毒、如HBV(肝细胞癌)、人乳头状瘤病毒(宫颈癌、肛门癌)、卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒(卡波济氏肉瘤肉瘤)、人类疱疹病毒第四型(鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤)、瘤病毒(默克尔细胞癌)、SV40 (猿猴病毒40)、HCV(肝细胞癌)、HTLV-1(成人T细胞白血病/淋巴瘤)；免疫紊乱导致病毒，如人类免疫缺陷病毒(艾滋病)、中枢神经系统病毒，如JCV(进行性多灶性脑白质病)、丙型肝炎病毒(亚急性硬化性全脑炎)、LCV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎)、亚博病毒脑炎、正粘病毒(脑炎性脑炎)、RV(狂犬病)、长鼻病毒、疱疹病毒脑膜炎、拉姆齐亨特综合征II 型、脊髓灰质炎病毒(脊髓灰质炎病毒、后脊髓灰质炎综合征)、HTLV-1(热带麻痹性麻痹))、巨细胞病毒(巨细胞病毒视网膜炎、HSV(疱疹性角膜炎)、心血管病毒，如CBV(心包炎、心肌炎)、呼吸系统/急性病毒性鼻内炎/ 病毒性肺炎，如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV感染/传染性单核病)、巨细胞病毒、非典冠状病毒(严重急性呼吸综合征)或正黏液病毒、流感病毒a/b/c(流感/禽流感)、副粘病毒、人类副流感病毒、RSV(人类呼吸道合胞病毒)、hMPV、消化系统病毒(腮腺炎病毒、巨细胞病毒(巨细胞病毒食管炎)、腺病毒(腺病毒感染)、轮状病毒、诺瓦克病毒、星状病毒、冠状病毒、乙型肝炎病毒、CBV、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、 HGV)、泌尿生殖病毒，如BK病毒、MuV(腮腺炎)。

更进一步，本发明也包括本发明中偶联物和可接受的载体，以癌症和自身免疫性疾病。癌症和自身免疫性疾病的方法可以在体外，体内或离体实施。体外用途的实例包括用它处理细胞培养物，以杀死除了不表达靶抗原的变体以外的所有细胞；或者杀死表达不需要的抗原的变体。离体使用的例子包括在进行移植(HSCT)之前对造血干细胞(HSC)进行处理，以杀死患病或恶性肿瘤细胞。例如，在癌症中的自体移植之前或在自身免疫性疾病的中从骨髓中去除肿瘤细胞或淋巴细胞，或在移植之前为了防止移植物抗宿主疾病从同种异体骨髓或组织中除去T细胞和其他淋巴细胞。这样的临床离体可以按如下步骤进行：从患者或其他个体收获骨髓，然后在含有血清的培养基中约37℃下孵育约15分钟至约48小时，在该培养基中加入本发明的偶联物，浓度范围从约1pM至0.1mM。具体的药物浓度和孵育时间应当由专业临床医师决定。孵育后，用含血清的培养基洗涤骨髓细胞，并按照已知的方法通过静脉注射给患者。若患者在骨髓采集和再输注细胞之间，还接受其它(例如消融化疗或全身辐射疗程)的情况下，应使用标准医疗设备将处理后的骨髓细胞在液氮中冷冻储存。

配方的制备和应用

本发明的冻干制剂可以通过本领域技术人员已知的、常规的、从组分中去除水的方法来制备。例如，可以通过将样品在适当的时间内加热至适当的温度来使组分脱水。组分还可以在减压环境下在适当的温度下脱水。减压环境可以是小于大气压的任何气压。在减压环境下，可以加热至高于室温的温度，保持在大约室温，或冷却至低于室温的温度。例如，可以在减压气氛下将组分冷却至低于室温的温度。适当的温度包括但不限于，低于室温或低于20、15、10、 5、0、-5、-10、-15、-20、-25、-30、-40、-50、-60或低于-65℃。若在减压环境下进行，压力可以低于大气压，或小于100torr(mm Hg)、50、25、10、 5、4.58(水的三相点)、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05或低于0.01torr。在低于 4.58torr(611Pascal或0.006大气压)的减压环境下，组分可以被冷却至低于 0.01℃。

本发明的制剂组分可以通过本领域技术人员已知的、常规的方法来制备。例如，可以通过将辅料溶解在tubulysin衍生物偶联物的纯化液中，调节混合物 pH至适当值，例如pH 5.0、5.5或6.0，如需要可以加入水，以保证偶联物和辅料浓度适当，然后倒入冻干小瓶中，冷却至低于0℃，然后冻干。

通常，给患者施用，无高水平抗体聚集的冻干前的液体制剂中偶联物活性组分浓度为0.1g/L～300g/L，可以包含一种或多种多元醇(例如糖)，缓冲剂 (将pH调节至4.5至7.5)，表面活性剂(例如聚山梨酯20或80)，抗氧化剂 (例如抗坏血酸和/或蛋氨酸)，等渗剂(例如甘露醇，山梨醇或NaCl)，螯合剂(例如EDTA)；金属复合物(例如锌蛋白复合物)；可生物降解的聚合物 (例如聚酯)；防腐剂(例如苯甲醇)和/或游离氨基酸。

用于制剂的合适缓冲液包括但不限于，有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的钠、钾、铵或三羟乙基氨基盐，氨基丁三醇盐酸、硫酸或磷酸缓冲液。此外，氨基酸阳离子也可用作缓冲液。这些氨基酸包括但不限于，精氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸和组氨酸。精氨酸缓冲液包括精氨酸乙酸盐、精氨酸氯化物、精氨酸磷酸盐、精氨酸硫酸盐，精氨酸琥珀酸盐等。在一个实施例中，精氨酸缓冲液是精氨酸乙酸盐。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸氯化物-精氨酸氯化物、组氨酸乙酸盐-精氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐-精氨酸磷酸盐、组氨酸硫酸盐-精氨酸硫酸盐、组氨酸琥珀酸盐-精氨酸琥珀酸盐等。缓冲液的pH是4.5至pH7.5，优选约4.5至约 6.5，更优选约5.0至约6.2。在一些实施例中，缓冲液中有机酸盐的浓度为约 10mM至约500mM。

在制剂中可选地含有的“多元醇”是具有多个羟基的物质。多元醇可用作液体和冻干制剂中的稳定辅料和/或等渗剂。多元醇可以保护生物药物免受物理和化学降解。最好能被排除的共溶剂增加了蛋白质接口处溶剂的有效表面张力，能量最有利的结构构像是表面积最小的那些溶剂。多元醇包括糖(还原和非还原糖)、糖醇和糖酸。“还原糖”是指含有半缩醛基团的糖，它能够还原金属离子，或与蛋白质中的赖氨酸和其他氨基发生反应，“非还原糖”是指不具有还原糖性质的糖。还原糖的例子有果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松解糖和棉子糖。糖醇选自甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇、苏糖醇、山梨醇和甘油。糖酸包括L-葡萄糖酸盐及其金属盐。液体配方或冻干制剂中的多元醇含量，按重量计，为0.0％-20％。在配方中优选浓度约为 0.1％到15％的非还原糖，蔗糖或海藻糖，其中由于海藻糖的溶液稳定性，海藻糖更优。

在制剂中可选的表面活性剂可选自聚山梨醇酯(聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85等)；泊洛沙姆(如泊洛沙姆188、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)、泊洛沙姆407 或聚丙二醇-丙二醇等)；脂多糖、聚乙二醇(例如PEG 400和PEG 3000)、泊洛沙姆(普兰尼克)、环氧乙烷和聚环氧乙烷(例如Triton X-100)、Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基磺基甜菜碱；十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基肌氨酸；亚油酸、肉荳蔻基或十六烷基甜菜碱；月桂酰氨基丙基、椰油酰胺丙基、亚油酰胺丙基、肉荳蔻酰基丙基、棕榈酰基丙基或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉荳蔻酰胺丙基、棕榈酰丙基或异硬脂酰氨基丙基- 二甲胺；甲基椰油酰基钠或甲基油基牛磺酸二钠；十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱和可可两性甘氨酸酯；MONAQUATTM系列(如异硬脂基乙基亚胺鎓乙基硫酸盐)；聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物(如Pluronic、PF68等)。优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，如聚山梨醇酯20、40、60或80(Tween20、40、60或80)。制剂中表面活性剂的浓度范围，按照重量计，为0.0％至约2.0％。在某些特定实施例中，表面活性剂浓度为约0.01％至约0.2％。在一个实施例中，表面活性剂浓度为约0.02％。

在制剂中可选的“防腐剂”是从根本上可以减小其中细菌的化合物。防腐剂的实例包括十八烷基二甲基芐基氯化铵、六甲基氯化铵、苯扎氯铵(烷基芐基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链烷基)和芐索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇如苯酚，丁基和芐基醇，对羟基苯甲酸烷基酯，如甲酯或丙酯，儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。液体配方或冻干粉末中的防腐剂含量，按照重量计，为0.0％-5.0％。在一个实施例中，所用防腐剂是苯甲醇。

在制剂中作为填充物质或张力剂或渗透压调节剂的，合适的游离氨基酸，选自但不限于精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸谷氨酸或天冬氨酸中的一种或多种。优选碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。如果组成中包含组氨酸，它可以充当缓冲剂和游离氨基酸，但是当使用组氨酸缓冲液时，通常还要包含一个非组氨酸的游离氨基酸，如赖氨酸。氨基酸可以以D-和/或L-型存在，但L-型比较常见。氨基酸可以任何合适的盐的形式存在，如精氨酸盐酸盐。液体配方或冻干粉末中的氨基酸含量，以重量计，为0.0％-30％。

可选地，制剂还包含甲硫氨酸，谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸或抗坏血酸作为抗氧化剂，在液体配方中浓度最多为约5毫克/毫升，在冻干粉末中的含量，以重量计，为0.0％-5.0％；可选地，制剂包含金属螯合剂，例如EDTA， EGTA等，在液体配方中浓度为约2mM，在冻干粉末中的含量，以重量计，为 0.0％-0.3％。

可以用缓冲调节剂(如一种酸，包括HCl、H2SO4、乙酸，H3PO4、柠檬酸等，或是碱，如NaOH、KOH、NH4OH、乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸三钠、氨基丁三醇等)调节至优选的pH值。制剂还应当被调节至“等渗”，即目标制剂具有与人血基本相同的渗透压。等渗制剂渗透压通常为250至350mOsm。可以使用蒸气压或冰冻型渗透压计测量等渗性。等渗剂选自甘露醇、山梨糖醇、乙酸钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸三钠或 NaCl。通常，缓冲盐和等渗剂在制剂中含量最多为30％(重量)。本发明的制剂复溶液和可注射组分的pH，能够让制剂或组分具备合适性能。期望的性能可能包括，如tubulysin衍生物偶联物的稳定性，和改善的过滤效率。在一些实施例中，本发明的制剂复溶液和可注射组分的pH为约3.5至约9.0，例如约5.0至约7.0。在具体的实施例中，pH可以是5.0±0.1、5.1±0.1、5.2±0.1、5.3±0.1、 5.4±0.1、5.5±0.1、5.6±0.1、5.7±0.1，5.8±0.1、5.9±0.1、6.0±0.1、6.1±0.1、 6.2±0.1、6.3±0.1、6.4±0.1或6.5±0.1。

在一些实施例中，通过在组分中加入一种或多种缓冲剂来调节pH可能是有益的。在一些实施例中，缓冲液的pKa为约5.5，约6.0或约6.5的pKa。本领域熟练的技术人员应当理解，所选的用于本发明组分的适当的缓冲剂是基于其 pKa和其他性质。缓冲剂在本领域众所周知的。因此，本文描述的缓冲剂并不旨在提供详尽列表，而仅仅是作为示例性缓冲剂，可以用于本发明的制剂或组分中。在某些实施例中，缓冲剂包括但不限于Tris，TrisHCl，磷酸钾，磷酸钠，柠檬酸钠，抗坏血酸钠，磷酸钠和磷酸钾的组合，Tris/Tris HCl，碳酸氢钠，磷酸精氨酸，精氨酸盐酸盐，组氨酸盐酸盐，草酸盐，琥珀酸盐，2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，马来酸盐，bis-tris，磷酸盐，碳酸盐和任何药学上可接受的盐和/或其组合。

在液体或冻干制剂中可能有用的其他辅料包括，例如，岩藻糖、纤维二糖、麦芽三糖、褪黑糖、辛酮糖、核糖、木糖醇、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、赖氨酸、咪唑、甘氨酸、甘露糖基甘油酯、Triton X- 100、Puloronic F-127、纤维素、环糊精、(2-羟丙基)-β-环糊精、右旋糖酐 (10、40和/或70kD)、聚葡萄糖、麦芽糊精、无花果胶、明胶、羟丙基甲基、磷酸钠、磷酸钾、氯化锌、锌、氧化锌、柠檬酸钠、柠檬酸三钠、氨丁三胺、铜、纤维粘连蛋白、肝素、人血清白蛋白、鱼精蛋白、甘油、EDTA、间甲酚、苯甲醇、苯酚、多元醇、被还原的糖、其中一羰基被还原为一级或二级醇。

其它可以在本专利申请的液体制剂中使用的辅料还包括：例如调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质如磷脂或脂肪酸脂、类固醇如胆固醇、蛋白质辅料如血清白蛋白(人血清白蛋白)、重组人白蛋白、明胶、酪蛋白、成盐反离子如钠等。这些和另外的适用于本发明制剂的，已知的药物辅料和/或添加剂为本领域公知，如在由美国医药协会罗威(Rowe)等人编著的第四版《药用辅料手册》(The Handbook of PharmaceuticalExcipients)中所列；以及由威尔金斯出版公司出版(2005)，热纳罗(Gennaro)等人编著的第 21版《雷明顿：药学科学与实践》(Remington：the Science and Practice ofPharmacy)中所列。本领域的熟练技术人员应当理解，选择一种辅料会可能影响另一种辅料的选择。例如，选择特定的辅料可能会排除使用一种或多种其他辅料是因为辅料的组合会产生不良的影响，本领域技术人员将能够凭经验确定在本发明的制剂或组分中，如果使用辅料，应该使用何种。

容纳本专利申请中的偶联物制剂的药物容器或器具有：小瓶，瓶，预填充注射器，预填充或自动注射器。液体配方可以在硼硅酸盐或钠钙玻璃小瓶中冷冻干燥，或滚筒干燥，成饼或粉末形式。固体粉末也可以通过有效的喷雾干燥制备，然后用小瓶或药物容器包装，用于储存和配送。

在更进一步的实施例中，本发明提供了制剂的制备方法，包括以下步骤： (a)将包含偶联物，辅料和缓冲体系的制剂冻干；(b)在介质中复溶步骤 (a)中的冻干混合物，以使得复溶的制剂稳定。步骤(a)中的液体可进一步包含稳定剂和选自前述填充剂、盐、表面活性剂和防腐剂的一种或多种辅料。稀释的有机酸，缓冲液或水，例如无菌水、注射用抑菌水(BWFI)可以用作复溶介质。复溶介质可选用水，如无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、乙酸、丙酸、琥珀酸、氯化钠、氯化镁溶液、氯化钠的酸性溶液、氯化镁的酸性溶液或精氨酸的酸性溶液，其浓度为约10至约250mM。

本专利申请的偶联物的液体制剂应具有各种设定的特征。需要考虑的主要问题之一是其稳定性，因为蛋白质/抗体在制造和储存期间，常会形成可溶及不溶的聚集体。此外，溶液中会发生各种化学反应(脱酰胺、氧化、剪切、异构化等)，导致降解产物水平增加和/或生物活性丧失。液体或冻干制剂中的偶联物最好应在25℃下，具有超过6个月的货架期。更优的液体或冻干制剂中的偶联物应在25℃下具有超过12个月的货架期。最为优选的液体制剂应该在2- 8℃下具有约24至36个月的货架期，冻干粉末在2-8℃下，应该具有长达约 60个月的货架期。液体制剂和冻干制剂应该具有在-20℃或-70℃下至少两年货架期。

在一些实施例中，该制剂在冷冻(例如-20℃或-70℃)和融化之后是稳定的，例如在1、2或3个冷冻和融化循环之后是稳定的。可以用不同的方式定性和/或定量地评估稳定性，包括评估药物/抗体(蛋白质)的比例和聚集体的形成 (例如，使用UV、尺寸排阻谱法、通过测量浊度和/或通过目测)；通过使用阳离子交换谱、图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；进行氨基末端或羧基末端序列分析、质谱分析或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)或HPLC-MS/MS SDS-PAGE分析以比较还原抗体和完整抗体；进行肽图分析(例如胰蛋白酶或LYS-C)；评估抗体的生物学活性或抗原结合功能。不稳定可能涉及以下一种或多种：聚集、脱酰胺作用(例如Asn脱酰胺作用)、氧化作用(例如Met氧化作用)、异构化作用(例如Asp异构化作用)、剪切/水解/断裂作用(例如铰链区断裂)、生成琥珀酰亚胺、未成对半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工、糖基化差异等。

稳定的偶联物应当在药物制剂中“保持其生物学活性”，例如，如果偶联物的生物活性在给定时间内，例如12个月，按照抗原结合测定和/或体外细胞毒性测定的方法，生物活性可以保持在相差20％以内，优选10％(在测定误差内)。

用于临床体内使用时，偶联物的制剂将是溶液或冻干固体的形式，冻干固体可被重新溶解于无菌注射用水中。在一般情况下，最常规的复溶固体形式的偶联物的方法通常需要以下步骤：从第一个容器中取出溶剂(例如水)，并将其注入包含固体偶联物组分的第二个容器中，将第二容器中的液体均质化，使其不含泡沫和/或干的聚集物，然后从第二容器中取出复溶的偶联物组分进行给药，或将其注入到装有生理缓冲液/盐溶液和氯化钠注射液的输液袋中，用于给药。上述每个步骤本身都可能需要几步操作，包括使用针或粉针，以及完成标准流程。为了确保正确的复溶并减少使用者间的偏差，药厂应向使用者提供“使用说明”，以指导操作。

根据进行的操作步骤和偶联物组分的不同，复溶的过程可能较长，或者出现不能被溶剂溶解的团块或凝胶区，或者在液态内部或者气液环状界面出现无法排出的气泡或泡沫，或者复溶时间差异较大，这些问题在制剂复溶过程中都是不能接受的。在大多数情况下，复溶过程包括溶剂转移，在最终用药之前进行均质化，需要若干次搅拌/涡旋和静置步骤来润湿固体，再水合，直到完全溶解。可能会有“要做”或“不要做”的操作建议。此外，建议药物生产商对使用者进行培训，无论他/她是专业人员还是患者或亲属，或者将复溶交给专业人员操作。对于某些冻干药物制剂，完全复溶的时间可能长达30分钟。

在一些实施例中，在转移至含有生理缓冲液或盐溶液的输液袋之前，复溶制剂中tubulysin衍生物偶联物的浓度约为1mg/ml至约30mg/ml，例如约5 mg/ml至约25mg/ml。在某些实施例中，在转移到含有生理缓冲液或盐溶液的输液袋之前，复溶制剂中tubulysin衍生物的偶联物的浓度为约15-25mg/ml。

对于临床体内使用，适当的偶联物给药方案如下：每天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每次四周一次或每月一次、共8-54周，静脉给药。注射的剂量是在50至1000mL生理盐水中，可任选地向其中加入人血清白蛋白 (例如0.5至1mL人血清白蛋白浓缩溶液，100mg/mL)。每周的剂量约为50 μg至20mg/kg体重，静脉注射(每次注射10μg至200mg/kg的范围)。后4-54周，患者可能会接受第二个疗程。关于给药方式，辅料，稀释剂，剂量，时间等的具体临床方案可以由熟练的临床医生确定。

用体内或者离体杀死特定细胞的方法，可以的疾病的实例包括任何类型的恶性肿瘤、自身免疫疾病、移植排异和感染疾病(病毒、细菌或寄生虫)。

获得满意的生物学效应所需的偶联物的量将取决于许多因素，包括偶联物的化学特性，效力和生物利用度，疾病类型，患者的种族，患者的疾病状态，给药途径，这些决定了所需剂量，给药方式和给药方案。

一般而言，可以通过包含本发明的药物为含0.1至10％w/v偶联物的生理缓冲水溶液，用于肠胃外施用。典型剂量范围为1μg/kg至0.1g/kg体重，每天、每周、每两周、每三周或每月一次，优选的剂量范围是人体等效剂量0.01 mg/kg至20mg/kg体重，每周，每两周，每三周或每月一次。待给药物的优选剂量可能取决于下列变量，如疾病的类型或病症的进展，患者的总体健康状况，所选化合物的相对生物学功效，药物的制剂，给药方式(静脉内，肌肉内或其他)，药物在确定的给药途径的药代动力学特性，给药速度(推注或连续输注)和给药方案(在给定时间内重复次数)。

本发明的偶联物还能够以单位剂量形式给药，其中术语“单位剂量”是指能够给予患者的单次剂量，并且可以很容易地处置和包装，同时活性偶联物本身或如下文所述的药学上可接受的组合物，保持物理和化学上稳定的单位剂量。典型的每天/每周/每两周/每月总剂量范围是从0.01至100mg/kg体重。作为一般指导原则，人类的单位剂量范围为1mg到3000mg每天/每周/每两周/每三周/每月。单位剂量优选1至500mg，一月一次至四次，更优选为1mg至100mg，每周/每两周/每三周一次。本文提供的偶联物可以通过与一种或多种药学上可接受的辅料混合而配制成药物组合物。这样的单位剂量组合物可以通过口服给药，如片剂，简单胶囊或软凝胶胶囊的形式的药物；或鼻内给药，如粉剂，滴鼻剂或气雾剂的药物；或皮肤给药，如使用局部用软膏，乳膏，乳液，凝胶或喷雾剂或通过透皮贴剂给药。所述组合物可以方便地以单位剂型给药，并且可以通过药学领域公知的一般方法制备，例如在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21th ed.；Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia，PA，2005.中所述的方法。

包含本发明的化合物的药物剂型，首选口服或非肠道给药的药物组合物。对于口服给药剂型，如片剂、粉剂、胶囊剂、片剂(锭剂)等可以包含一种或多种以下组分或有类似性质的其它化合物：粘合剂、比如微晶纤维素或黄耆胶；稀释剂，比如淀粉或乳糖；分散剂，比如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂，比如硬脂酸镁；助流剂，比如二氧化硅胶体；甜味剂，比如蔗糖或糖精；增味剂，比如薄荷或水杨酸甲酯。胶囊可以是硬胶囊或软胶囊的形式，一般由明胶混合物，或与塑化剂混合制得，淀粉胶囊也是如此。另外，单位剂形可以包含各种其他原料，改变其物理形式，例如包覆糖衣，虫胶或肠溶剂。其它的口服剂型如糖浆或酏剂可以含有甜味剂，防腐剂，颜料，着剂和调味剂。另外，活性化合物可以通过不同的处理和配方，使其成为可快速溶解的剂型，控释剂型或缓释剂，其中的缓释剂是较好的剂型。片剂首选包含乳糖、玉米淀粉、硅酸镁、交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯酮、硬脂酸镁、滑石等组合的剂型中。

非肠道给药的液体药剂包括无菌的水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。液体药剂也可以含有粘合剂、缓冲液、防腐剂、螯合剂、甜味剂、调味剂和着剂等等。非水溶剂包括醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油比如橄榄油和有机脂类，比如油酸乙酯。水性溶剂包括了水、醇、缓冲试剂和盐的混合物，特别是，生物相容性的、可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯聚合物或者聚乙二醇/聚丙三醇共聚物可作为控制活物释放的辅料。静脉注射中的辅料可以包括液体和营养补充物、电解质补充物、以及基于林格氏葡萄糖的辅料，以及类似的辅料。本发明的活物其它可行的非肠道给药系统，包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物微粒，植入式渗透泵和脂质体。

其它可行的给药方式包括吸入剂，包括干粉剂、气雾剂和水滴剂。吸入剂可以是含有如聚乙二醇-9-月桂醚、甘胆酸盐、脱氧胆酸盐或油质的溶液，可以通过滴鼻剂，鼻内胶体的形式给药。口含药剂包括如锭剂、糖果锭剂等，可含有调味剂如蔗糖、阿拉伯胶以及其它辅料如甘胆酸盐等。栓剂适合于单位剂量的形式，以固体如可可油为载体，也可以加入水杨酸。皮肤局部用药剂型、以膏药、乳剂、洗液、贴片、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油剂为首选。凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇类以及它们的混合物可以作为药物载剂。皮肤给药的剂型可以是贴片、乳剂、缓冲溶液、溶解或分散在聚合物或粘合剂中。。

其它可行的给药方式包括吸入剂，包括干粉剂、气雾剂和水滴剂。吸入剂可以是含有如聚乙二醇-9-月桂醚、甘胆酸盐、脱氧胆酸盐或油质的溶液，可以通过滴鼻剂，鼻内胶体的形式给药。口含药剂包括如锭剂、糖果锭剂等，可含有调味剂如蔗糖、阿拉伯胶以及其它辅料如甘胆酸盐等。栓剂适合于单位剂量的形式，以固体如可可油为载体，也可以加入水杨酸。皮肤局部用药剂型、以膏药、乳剂、洗液、贴片、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油剂为首选。凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇类以及它们的混合物可以作为药物载剂。皮肤给药的剂型可以是贴片、乳剂、缓冲溶液、溶解或分散在聚合物或粘合剂中。。

特别地，本发明申请的偶联物可以与其它的已知或即将已知的药物，如化疗药物、放射疗法、免疫疗法药物、自身免疫疾病药物、抗感染药物或其它抗体药物偶联物共同作用，达到协同效果。在另一个具体实施例中，协同药物或放射可以在本发明的共轭药物给药之前或之后给药或施行。可以是在本发明的偶联药物给药之前或之后1小时、12小时、一天、一星期、二星期、三星期、一个月、也可以是几个月进行。

在其他实施例中，协同药物包括但不限于：

1)化疗药物：a)烷基化剂，如氮芥：氯苯那普，氯普那嗪，环磷酰胺，达喀尔巴嗪，雌二醇氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸二甲氧胺，氧化二氮芥，盐酸氨氯地平，麦考酚酸，卫矛醇，呱泊溴烷，新氮芥，苯芥胆甾醇，松龙苯芥，噻替呱，曲磷胺对，尿嘧啶；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新、比折来新及其合成同系物)；多卡霉素(包括KW-2189和CBI-TMI、及其合成同系物)；苯并二氮卓二聚体(例如吡咯苯并二氮卓(PBD)或托美霉素，吲哚苯并二氮卓，咪唑苯并噻二氮卓或恶唑烷苯并二氮卓的二聚体)；亚(卡莫司汀，洛莫司汀，氯化梭菌素，福莫司汀，尼莫司汀，拉莫司汀)；烷基磺酸盐(白苏芬、树苏芬、磺胺异丙磺胺和皮苏芬)；三氮烯(达喀尔巴嗪)；含铂化合物(卡铂，顺铂，奥沙利铂)；吖丙啶类，如苯并二氢吡喃酮，卡洛酮，美妥替派和乌雷多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺，三亚乙基三胺，三乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基甲基胺；b)植物生物碱：如长春花生物碱(长春新碱，长春碱，长春地辛，长春瑞滨，去甲长春碱)；紫杉醇类(紫杉醇，多西紫杉醇及其同系物)；美登素类(DM1、 DM2、DM3、DM4、美登素、安沙霉素及其同系物)；cryptophycin(特别是 cryptophycin 1和cryptophycin 8)；埃博霉素，软珊瑚醇，迪莫利德，草苔虫内酯，海兔毒素，澳瑞他汀，cephalostatin；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑制素；c)DNA拓扑异构酶抑制剂，例如依托泊苷替尼(9-氨基喜树碱，喜树碱，克立那托，多拉霉素，依托泊苷，磷酸依托泊苷，伊立替康，米托蒽醌，诺消灵，视黄酸(视黄醇)，替尼泊苷，拓扑替康，9-硝基喜树碱(RFS 2000))；丝裂霉素(丝裂霉素C)；d)抗代谢物，例如抗叶酸剂，DHFR抑制剂(甲氨蝶呤，曲麦克特，二甲叶酸，蝶罗呤，氨喋呤(4-氨基苯甲酸)或其他叶酸同系物)；IMP脱氢酶抑制剂(麦考酚酸，噻唑呋林，利巴韦林，EICAR)；核糖核苷酸还原酶抑制剂(羟基脲，去铁胺)；嘧啶同系物，尿嘧啶同系物(安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿嘧啶，卡培他滨(希罗达)，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，脱氧氟尿苷，依诺他滨，5-氟尿嘧啶，氟尿苷，ratitrexed (Tomudex)；胞嘧啶同系物(阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷，氟达拉滨)；嘌呤同系物(硫唑嘌呤，氟达拉滨，巯嘌呤，硫胺素，硫鸟嘌呤)；叶酸补充剂，如弗洛林酸；e)激素疗法剂，如受体拮抗剂，抗雌激素(甲地孕酮，雷洛昔芬，他莫昔芬)，LHRH兴奋剂(戈斯他林，醋酸亮丙瑞林)；抗雄激素药 (比卡鲁胺，氟他胺，卡鲁司酮，丙酸倍他雄酮，表雄甾醇，戈舍瑞林，亮丙瑞林，美替利定，尼鲁米特，睾内酯，曲洛司坦及其他雄激素抑制剂)；维甲类化合物，维生素D3同系物(CB1093，EB1089，KH1060，胆钙化醇，麦角钙化甾醇)；光动力疗法剂(维替泊芬，酞菁，光敏剂Pc4，去甲氧基-竹红菌素 A)；细胞因子(干扰素-α，干扰素-γ，肿瘤坏死因子(TNF)，含TNF的人蛋白)；f)激酶抑制剂，如BIBW 2992(抗-EGFR/Erb2)，伊马替尼，吉非替尼，呱加他尼，索拉非尼，达沙替尼，舒尼替尼，厄洛替尼，尼洛替尼，拉帕替尼，阿西替尼，帕唑帕尼，凡德他尼，E7080(抗VEGFR2)，mubritinib，普纳替尼(AP24534)，bafetinib(INNO-406)，bosutinib(SKI-606)，卡博替尼，维莫德吉，iniparib，鲁索利替尼，CYT387，阿西替尼，tivozanib，索拉非尼，贝伐单抗，西妥昔单抗，曲妥珠单抗，雷珠单抗，帕尼单抗，伊斯平斯； g)聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，如奥拉帕里、尼拉帕里、依尼帕里、塔拉佐帕里、维利帕里、维利帕里、CEP 9722(Cephalon)、E7016 (Eisai)、BGB-290(Beigene)、3-氨基苯甲酰酰胺；h)抗生素，如烯二炔类抗生素(卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1，δ1，α1和β1(参考J.Med.Chem. 1996，39(11)，2103-2117；Angew Chem Intl.Ed.Engl.1994，33：183-186)，达因霉素，包括达因霉素A和脱氧米霉素，埃斯培拉霉素，卡塔尔霉素，C-1027，maduropeptin，新卡嗪奥斯汀和相关蛋白烯二炔抗生素)， aclacinomysins，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，卡诺霉素，卡拉霉素，洋红霉素，嗜癌素，霉素，达金霉素，柔红霉素，去柔红霉素，6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸，阿霉素，吗啉-阿霉素，氰基吗啉-阿霉素，2-吡咯啉阿霉素和脱氧柔红霉素，表柔比星，阿柔比星，伊达比星，马可霉素，nitomycin，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，Peplomycin，potfiromycin，嘌呤霉素，奎拉霉素，罗道霉素，链黑霉素，链脲霉素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；i)其他，如聚酮化合物(番荔素)，特别是bullatacin和 bullatacinone；吉西他滨，环氧酶素(如卡菲偌米布)，硼替佐米，沙利度胺，来那度胺，pomalidomide，tosedostat，zybrestat，PLX4032，STA-9090， Stimuvax，allovectin-7，Xegeva，Provenge，Yervoy，异戊二烯化抑制剂(如洛伐他汀)，多巴胺能神经毒素(如星形孢菌素)，放线菌素(如放线菌素D，更生霉素)，博莱霉素(如博来霉素A2，博莱霉素B2，培洛霉素)，蒽环类抗生素(如柔红霉素)，鹅膏毒素，阿霉素(亚德里亚霉素)，伊达比星，表柔比星，吡柔比星，佐柔比星，米托蒽醌，MDR抑制剂(如维拉帕米)，Ca2+ ATP酶抑制剂(如毒胡萝卜素)，组蛋白去乙酰酶抑制剂(伏立诺他，罗米地辛，帕比司他，丙戊酸，Mocetinostat(MGCD0103)，Belinostat，PCI- 24781，恩替诺特，SB939，Resminostat，Givinostat，AR-42，CUDC-101，萝卜硫素，曲古抑菌素A)；塞来昔布，格列酮类，表没食子儿茶素没食子酸酯，双硫仑，Salinosporamide A；抗肾上腺药物，如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦，醋葡醛内酯，醛磷酰胺，氨基乙酰丙酸，安吖啶，阿拉伯糖苷，bestrabucil，比生，edatraxate，defofamine，美可辛，地吖醌，依氟鸟氨酸(DFMO)，elfomithine，依利醋铵，依托格鲁，硝酸镓，胞嘧啶，羟基脲，伊班膦酸盐，香菇多糖，氯尼达明，米托胍腙，米托蒽醌，莫呱达醇，二胺硝吖啶，喷司他丁，蛋氨氮芥，吡柔比星，鬼臼酸，2-乙肼，甲基苄肼；呱嗪二酮丙烷；根霉素；西佐；螺环锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素，疣孢菌素A，杆孢菌素A和anguidine)，聚氨酯，siRNA，反义药物和核酸分解酶；

2)自身免疫疾病药物，包括但不限于，环孢菌素、环孢菌素A、氨基己酸、硫唑嘌呤、溴隐亭、苯丁酸氮芥、氯喹、环磷酰胺、皮质类固醇(例如安西奈德、倍他米松、布地奈德、氢化可的松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、氟可龙达那唑、地塞米松、曲安奈德、二丙酸倍氯米松)、DHEA、依那西普、羟基氯喹、英夫利昔单抗、美洛昔康、甲氨蝶呤、麦考酚酸酯、泼尼松、西罗莫司、他克莫司；

3)抗传染病剂包括，但不限于：a).氨基糖苷类：丁胺卡那霉素、武夷霉素庆大霉素(奈替米星、西索米星、异帕米星)、潮霉素、卡那霉素(丁胺卡那霉素、阿贝卡星、氨基去氧卡那霉素、地贝卡星、妥布霉素)、新霉素 (新霉素B、巴龙霉素、核糖霉素)、奈替米星、大观霉素、链霉素、妥布霉素、甲基姿苏霉素；b).酰胺醇类：叠氮氯霉素、氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素；c).安沙霉素类：格尔德霉素、除莠霉素；d).碳青霉烯类：比阿培南、多尼培南、厄他培南、亚胺培南/西司他丁、美罗培南、帕尼培南；e).头孢类：碳头孢烯(氯碳头孢)、头孢乙腈、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢罗宁、头孢噻啶、头孢噻吩或头孢菌素、头孢氨苄、头孢来星、头孢孟多、头孢匹林、头孢三嗪、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑啉、头孢拉宗、头孢卡品、头孢达肟、头孢吡肟、头孢米诺、头孢西丁、头孢丙烯、头孢沙定、头孢替唑、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼头孢妥仑、头孢吡肟、头孢他美、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替安、头孢唑兰、头孢氨苄、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢喹肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻林、头孢唑肟、头孢、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑喃、头霉素(头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑)氧头孢烯(氟氧头孢、拉氧头孢)；f).糖肽：博来霉素、万古霉素(奥利万星、特拉万星)、拉宁(达巴万星)雷莫拉宁；g).甘氨酰：如替加环素；h).β-内酰胺酶抑制剂：青霉烷(舒巴坦、他唑巴坦)、克拉维烷(克拉维酸)；i).林可酰胺类：克林霉素、林可霉素；j).脂肽：达托霉素、A54145、钙依赖性抗生素(CDA)；k).大环内酯类：阿奇霉素、喹红霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、氟红霉素、交沙霉素、酮内酯类(泰利霉素、喹红霉素)麦迪霉素、美奥卡霉素、竹桃霉素、利福霉素(利福平、利福平、利福布汀、利福喷丁)、罗他霉素、罗红霉素、壮观霉素、螺旋霉素、他克莫司(FK506)、醋竹桃霉素、泰利霉素；l).单环β-内酰胺抗生素：氨曲南、替吉莫南；m).唑烷酮类：利奈唑胺；n).青霉素类：阿莫西林、氨苄西林(匹氨西林、海他西林、巴氨西林、美坦西林、酞氨西林)叠氮西林、阿洛西林、青霉素、苄星青霉素、苯氧基苄星青霉素、氯甲西林、普鲁卡因青霉素、羧苄青霉素(卡茚西林)、邻氯青霉素、双氯青霉素、先锋霉素、氟氯西林、美西林(氮卓脒青霉素双酯)、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、醋甲西林、青霉素、奈西林、青霉素、哌拉西林、苯丙西林、磺苄西林、替莫西林、替卡西林；o).多肽：杆菌肽、多粘菌素E、多粘菌素B； p).喹诺酮类药物：阿拉沙星、巴洛沙星、环丙沙星、克林沙星、达氟沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、Floxin、加雷沙星、加替沙星、吉米沙星、格帕沙星、曲伐沙星卡诺、左氧氟沙星、洛美沙星、麻保沙星、莫西沙星、那氟沙星、诺氟沙星、奥比沙星、氧氟沙星、培氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、西他沙星、司帕沙星、替马沙星、妥舒沙星、曲伐沙星；q).菌素：普那霉素、奎奴普丁/达福普汀)；r).磺胺类药物：磺胺米隆、百浪多息、磺胺醋酰、磺胺甲、磺胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺异恶唑、甲氧苄氨嘧啶、甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑(复方新诺明)；s).类固醇抗菌药物：如夫西地酸；t).四环素类：强力霉素、金霉素、氯羟四环素、地美环素、赖甲环素、氯甲烯土霉素、美他环素、米诺环素、土霉素、青哌四环素、罗利环素、四环素、甘氨酰(如替加环素)；u).其他类型的抗生素：番荔枝科、胂凡纳明、细菌萜醇抑制剂(杆菌肽)、DADAL/AR抑制剂(环丝氨酸)、dictyostatin、海绵内酯、艾榴塞洛素、埃博霉素、乙胺丁醇、依托泊苷、法罗培南、夫西地酸、痢特灵、、laulimalide、甲硝唑、莫匹罗星、mycolactones、NAM合成抑制剂(如磷霉素)、呋喃妥因、紫杉醇、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普汀、利福平 (利福平)、他唑巴坦替硝唑、番荔枝内酯；

4)抗病毒的药物：a)./融合抑制剂：aplaviroc、马拉韦罗、维立韦罗、 gp41的(恩夫韦)、PRO140、CD4(Ibalizumab)；b).整合酶抑制剂：拉替拉韦、埃替拉韦、globoidnan A；c).成熟抑制剂：贝韦立马、vivecon；d). 神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦；e).核苷和核苷酸：阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、氨多索韦、apricitabine、溴夫定、西多福韦克拉夫定、右艾夫他滨、去羟肌苷(DDI)、艾夫他滨、恩曲他滨(FTC)、恩替卡韦、泛昔洛韦、氟脲嘧啶(5-FU)、3'-氟取代的2'，3'-二脱氧核苷衍生物(例如，3'-氟-2'，3'-二脱氧胸苷(FLT)和3'-氟-2'，3'-双脱氧(FLG)福米韦生、更昔洛韦、碘苷、拉米夫定(3TC)、L-核苷(如β-L-胸苷、β-L-2'-脱氧胞苷)、喷昔洛韦、Racivir、利巴韦林、stampidine、司他夫定(d4T的)、他利韦林(伟拉咪定)、替比夫定、替诺福韦、伐昔洛韦三氟胸苷、缬更昔洛韦、扎西他滨(DDC)、齐多夫定(AZT)；f).非核苷类：金刚烷胺、 ateviridine、卡普韦林、二芳基嘧啶(依曲韦林、利匹韦林)、地拉韦啶、二十二烷醇、乙米韦林、依法韦仑、膦甲酸(磷酰基甲酸)、咪喹莫特、干扰素α、洛韦胺、洛德腺苷、他巴唑、奈韦拉平、NOV-205、聚乙二醇干扰素α、鬼臼毒素、利福平、金刚乙胺、瑞喹莫德(R-848)、醋胺金刚烷；g).蛋白酶抑制剂：安普那韦、阿扎那韦、博赛泼维、达芦那韦、福沙那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、pleconaril、利托那韦、沙奎那韦、特拉匹韦(VX-950)替拉那韦；h).其他类型的抗病毒的药物：抗体酶、阿比朵尔、calanolides A、浅蓝菌素、蓝藻-N、二芳基嘧啶、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、膦甲酸钠、格瑞弗森、他利韦林(伟拉咪定)、羟基脲、KP-1461、米替福新、普来可那立、合成抑制剂、利巴韦林、seliciclib；

5)放射使用的放射性同位素。放射性同位素(放射性核素)的实例有3H，11C，14C，18F，32P，35S，64Cu，68Ga，86Y，99Tc，111In，123I，124I，125I，131I，133Xe，177Lu，211At或213Bi。放射性同位素标记的抗体可用于受体靶向成像实验，或者可用于如本发明的抗体-药物偶联物的靶向(Wu et al Nature Biotechnology 2005，23(9)：1137-1146)。细胞结合分子，例如抗体可以通过本专利的连接体连结配体试剂，进行标记。配体可以用文献(CurrentProtocols in Immunology，Volumes 1and 2，Coligen et al，Ed.Wiley- Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991))所述的方法与放射性金属结合、螯合或生成复合物。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA，DOTP， DOTMA，DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas，TX)等；

6)另一种细胞结合分子-药物偶联物作为协同剂。优选的协同偶联物上的细胞毒性分子为：Tubulysin同系物、美登木素生物碱同系物、紫杉醇(紫杉烷) 同系物、CC-1065同系物、柔红霉素和多柔比星化合物、鹅膏毒素同系物、苯并二氮杂二聚体(如吡咯苯并二氮杂的二聚体(PBD、托马霉素、安曲霉素、吲哚苯并噻二氮卓类、咪唑苯并噻二氮卓类或恶唑烷苯并二氮卓类)、加利西霉素和烯二炔类抗生素化合物、放线菌素、重氮丝氨酸、博莱霉素、表柔比星、他莫昔芬、伊达比星、海兔毒素、澳瑞他汀(如MMAE、MMAF、澳瑞他汀 PYE、澳瑞他汀TP、澳瑞他汀2-AQ、6-AQ、EB(AEB)和EFP (AEFP))、多卡米星、格尔德霉素、氨甲喋呤、噻替派、长春碱、长春新碱、hemiasterlin、纳沙酰胺、小金霉素、radiosumin、互花米草素、microsclerodermin、噻吩甲酰胺、埃斯呱霉素、PNU-159682，以及它们的其同系物及以上所述物质的衍生物；

7)其他免疫药物例如：咪喹莫特，干扰素(如α，β)，粒细胞集落刺激因子，细胞因子，白介素抗体(如曲妥珠单抗，帕妥珠单抗，贝伐单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，英夫利昔单抗，阿达木单抗，巴利昔单抗，达达克珠单抗，奥马珠单抗，PD-1或PD-L1)，蛋白结合药物(如 Abraxane)，偶联下列药物的抗体：卡奇霉素衍生物，美登素衍生物(DM1和 DM4)，CC-1065，SN-38，伊喜替康，拓扑替康，拓扑异构酶I抑制剂，多卡霉素，PBD或IGN小沟结合剂，有效的紫杉醇衍生物，阿霉素，澳瑞他汀抗有丝分裂药物(例如曲妥珠单抗-DM1)，Trastuzumab deruxtecan(DS-8201a)， Inotuzumab ozogamicin，Brentuximabvedotin，Sacituzumab govitecan， Glembatumumab vedotin，Lorvotuzumab mertansine，AN-152LMB2，TP-38， VB4-845，Cantuzumab mertansine，AVE9633，SAR3419，CAT-8015(抗-CD22)，IMGN388，Mirvetuximab soravtansine(IMGN853)，Enfortumab vedotin，Milatuzumab-doxorubicin，SGN-75(抗CD70)，抗Her3-exetecan，抗- Trop2-exetecan，抗-CD79b-MMAE，抗-Her2-MMAE，抗-Trop2-MMAE，抗- Her2-MMAF，抗-Trop2-MMAF，抗-CD22-卡奇霉素衍生物，抗-CD22-MMAE，抗-Her2-澳瑞他汀衍生物，抗Muc1-澳瑞他汀衍生物，抗-cMet-澳瑞他汀衍生物或抗Claudin18.2-澳瑞他汀衍生物。

8)上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在另一种协同免疫疗法中，免疫检查点抑制剂抗体，TCR(T细胞受体)T 细胞抗体，CAR(嵌合抗原受体)T细胞抗体或B细胞受体(BCR)抗体， Natural killer(NK)细胞抗体或细胞毒细胞的抗体，或抗-CD3，CD4，CD8， CD16(FcγRIII)，CD19，CD20，CD22，CD25，CD27，CD30，CD33， CD37，CD38，CD40，CD40L，CD45RA，CD45RO，CD56，CD57， CD57bright，CD70，CD79，CD79b，CD123，CD125，CD138，TNFβ，Fas配体，MHC I类分子(HLA-A，B，C)，VEGF或NKR-P1抗原的抗体，优选与本专利的偶联物一起用于协同。

在另一个实施方案中，包含有效剂量的结构式为(I)或(VII)的偶联物，或本发明中描述的其它任何偶联物的药物组合物，可以与其他剂，如化学剂，放射剂，免疫剂，自身免疫病症剂，抗感染剂或其他偶联物协同给药，以有效或预防癌症或自身免疫疾病或感染性疾病。协同剂优选自以下药物中的一种或几种：阿巴西普、醋酸阿比特龙、对乙酰氨基酚/氢可酮、阿达木单抗、ADXS31-142、ADXS-HER2、阿法替来酸盐、阿仑单抗、阿利维A酸、曲妥珠单抗、混合盐(/右)阿那曲唑、阿立呱唑、阿扎那韦、Atezolizumab、阿托伐他汀、阿昔替尼、贝林、BCG Live、贝伐单抗、卡巴他赛、卡博替、贝沙罗汀、blinatumomab、硼替佐米、波舒替尼、brentuximab vedotin、布地奈德、布地奈德/福莫特罗、、卡培他滨、卡非佐米、塞来考昔、ceritinib、西妥昔单抗、环孢素、西那卡塞、克里唑替尼、达比加、达拉菲尼、阿法达贝汀、地瑞那韦、甲磺酸伊马替尼、达沙替尼、地尼白介素、狄诺塞麦、双丙戊酸钠、右兰索拉唑、右呱甲酯、Dinutuximab、多西环素、度洛西汀、恩曲他滨/利匹韦林/替诺福韦地索普西富马酸盐、恩曲他滨/替诺福韦/依法韦仑、依诺肝素、恩杂鲁胺、阿法依泊汀、厄洛替尼、埃索美拉唑、依折麦布、依折麦布/辛伐他汀、非诺贝特、非格司亭、芬戈莫德、丙酸氟替卡松、氟替卡松/沙美特罗、氟维司、吉非替尼、格拉替雷、醋酸戈舍瑞林、伊马替尼、替伊莫单抗、依鲁替尼、胰岛素门冬胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、干扰素β1a、干扰素β1b、拉帕替尼、Ipilimumab、异丙托溴铵/沙丁胺醇、醋酸兰乐肽、来那度胺、联合二甲苯磺酸盐、来曲唑、左甲状腺素、左旋甲状腺素、利多卡因、利奈唑胺、利拉鲁肽、 MEDI4736、美金刚、呱醋甲酯、美托洛尔、、莫米松、尼罗替尼、 Nivolumab、奥法木单抗、奥立他珠单抗、帕唑帕尼、派姆单抗、培美曲塞、帕妥珠单抗、肺炎球菌结合疫苗、泊马度胺、普瑞巴林、喹硫平、雷贝拉唑氯化镭223、雷洛昔芬、拉替拉韦、雷莫瑞单抗、雷珠单抗、瑞格菲尼、利妥昔单抗、利伐沙班、罗米地辛、罗苏伐他汀、鲁索替尼磷酸盐、沙丁胺醇、司维拉明、西地那非、siltuximab、西他列汀、西他列汀/二甲双胍、索非那新、索拉非尼、舒尼替尼、他达拉非、他莫昔芬、替拉普韦、替西罗莫司、替诺福韦/恩曲他滨、睾酮凝胶、沙利度胺(Talidex)、噻托溴铵、托瑞米芬、曲美替尼、曲妥珠单抗、Tretinoin、尤特克单抗、缬沙坦、凡德他尼、维罗非尼、伏立诺他、阿柏西普、Zostavax及其同系物、衍生物、药学上可接受的盐、载体、稀释剂或辅料或上述的组合。

另外，本发明还涉及偶联物的制备方法。本发明的偶联物可以通过本领域技术人员公知的方法制备。偶联物中tubulysin衍生物可以通过采用或者应用后文合成方法而制备，或经本领域技术人员调整后来合成。适当的修饰和替代对于本领域技术人员而言将是显而易见的和众所周知的，并且可以从科学文献中容易地获得。这些方法可以参见：R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，第二版，Wiley-VCH Publishers出版，1999。

进行本申请所述的反应时，可能有必要保护部分活性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、巯基和羧基，以避免副反应的发生。保护官能团的常见使用方法可参见P.G.Wuts andT.W.Greene，Greene's Protective Groups in Organic Synthesis，Wiley-Interscience出版；第四版(2006)。有些反应可能需要在酸碱存在时，或在适当的溶剂中进行。对酸、碱和溶剂并没有特别的限制，只要没有不利的影响，任何常规的酸、碱以及溶剂都可以在这里使用。反应可以在广泛的温度范围内进行。总的来说，反应温度通常在-80℃-150℃之间比较容易操作(在室温与100℃之间更好)。反应所需的时间同样可以在很大的范围里变化，这取决于多种因素，尤其是反应温度和所用溶剂的性质。一般地说，理想条件下的反应，3至20小时的反应时间就足够了。

反应结束后的操作处理可以按常规方法进行。例如，可以通过把溶剂从反应体系中蒸掉的方式回收反应产物。或者，如果必要的话，在把溶剂蒸出后，可以先把剩余物倒入水中，再用与水不互溶的有机溶剂萃取，最后，蒸出萃取溶剂。此外，如有需要，产物还可通过各种常见的方法进一步纯化，如重结晶、沉降或各种谱层析的方法，如柱层析和制备薄板层析法。本发明中的 Tubulysin衍生物及其偶联物的合成见图1-22。

本发明的细胞结合分子与Tubulysin衍生物的偶联也在实施例中有进一步的描述。当然，本发明并不局限于下述实施例。

实验材料：

使用Bruker Esquire 3000系统获得质谱数据。NMR图谱在Bruker AVANCE300仪器上分析测得。化学位移(δ)以百万分数(ppm)为单位报告，TMS为内标。使用Hitachi U1200分光光度计记录紫外光谱。HPLC使用 Agilent 1100HPLC，该系统配有组分收集器和可变波长检测器。在Analtech GF 硅胶薄层谱板上进行薄层谱分析。氨基酸及其衍生物以及预载树脂购于 Merck Chemicals International Co.、Synthetech Co.、PeptidesInternational Inc.或 Chembridge International Co.或Sigma–Aldrich Co.。一些连接子，NHS酯/马来酰亚胺连接子(AMAS、BMPS、GMBS、MBS、SMCC、EMCS或sulfo-EMCS、 SMPB、SMPH、LC-SMCC、sulfo-KMUS、SM(PEG)4、SM(PEG)6、SM (PEG)8、SM(PEG)12，SM(PEG)24；NHS酯/吡啶基二硫醇(SPDP，LC- SPDP或sulfo-LC-SPDP，SMPT，sulfo-LC-SMPT)；NHS酯类/卤代乙酰基 (SIA、SBAP、SIAB或sulfo-SIAB)；NHS酯/Diazirine(SDA或sulfo-SDA、 LC-SDA或sulfo-LC-SDA、SDAD或sulfo-SDAD)；马来酰亚胺/酰肼(BMPH， EMCH，MPBH，KMUH)；吡啶基二硫醇/酰肼(PDPH)；异氰酸酯/马来酰亚胺(PMPI)购自Thermo Fisher Scientific Co.，SPDB，SPP连接子是根据参考文献制备的(Cumber，A.等，Bioconjugate Chem.，1992，3，397–401)。T-DM1 和曲妥单抗来自基因泰克。所有其他化学品或无水溶剂均来自Sigma-AldrichInternational或阿拉丁化工(上海)有限公司。

实施例1.二叔丁基-1，2-双(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)肼-1，2-二甲酸酯的合成。

向二叔丁基肼-1，2-二羧酸二叔丁酯(8.01g，34.4mmol)的DMF(150 mL)溶液中加入NaH(60％，2.76g，68.8mmol)。在室温搅拌30分钟后，加入2-溴乙酸叔丁酯(14.01g，72.1mmol)。将混合物搅拌过夜，加入甲醇 (3mL)淬灭，浓缩，用乙酸乙酯(100mL)和水(100mL)稀释，分离，并将水层用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。合并有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩，并通过SiO2柱谱法纯化(乙酸乙酯/己烷1∶5至1∶3)，得到标题化合物(12.98g，82％收率)，为无油状物。MS ESI m/z C22H41N2O8[M+H]+：计算值461.28，实测值461.40。

实施例2.2，2'-(肼-1，2-二基)二乙酸的合成。

向1，2-双(2-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)肼-1，2-二羧酸二叔丁基酯 (6.51g，14.14mmol)的1，4-二噁烷(40mL)中加入HCL(12M， 10mL)。将混合物搅拌30分钟，用二噁烷(20mL)和甲苯(40mL)稀释，浓缩并与二噁烷(20mL)和甲苯(40mL)蒸发至干，得到粗品，用于下一步，无需进一步纯化(2.15g，103％产率，93％纯度)。MS ESI m/z C4H9N2O4 [M+H]+：计算值149.05，实测值149.40。

实施例3.2，2'-(1，2-双((E)-3-溴丙烯酰基)肼-1，2-二基)二乙酸的合成。

向2，2'-(1，2-肼基)二乙酸(1.10g，7.43mmol)的四氢呋喃(50ml)和磷酸二氢钠(0.1M，80ml，pH 6.0)的混合物中加入(E)-3-溴丙烯酰溴 (5.01g，23.60mmol)。将混合物搅拌6小时，浓缩并在硅胶柱上纯化，用含有 3％甲酸的水/乙腈(1：9)洗脱，得到目标化合物(2.35g，77％产率，-93％的纯度)。MS ESI m/z C10H11Br2N2O6[M+H]+：计算值412.89，实测值413.50。

实施例4.2，2'-(1，2-双((E)-3-溴丙烯酰基)肼-1，2-二基)二乙酰氯的合成。

向2，2'-(1，2-双((E)-3-溴丙烯酰基)-1，2-肼基)二乙酸(210mg， 0.509mmol)的二氯乙烷(15ml)溶液中加入草酰氯(505mg，4.01mmol)，然后加入0.040ml DMF。在室温下搅拌2小时后，将混合物浓缩，依次与二氯乙烷(2×20ml)和甲苯(2×15ml)共浓缩至干，得到目标产物(245mg，107％产率)，无需进一步纯化(不稳定)。MS ESI m/z C10H9Br2Cl2N2O4[M+H]+：计算值448.82，450.82，452.82，454.82，实测值448.60，450.60，452.60， 445.60。

实施例5.2，8-二氧代-1，5-噁唑烷-5-羧酸叔丁酯的合成。

在4℃下，向3，3'-亚氨基二丙酸(10.00g，62.08mmol)的1.0N NaOH (300ml)溶液中，加入二碳酸二叔丁酯(22.10g，101.3mmol)的200ml THF溶液。添加1小时后，将混合物在4℃下搅拌2小时。用0.2M H3PO4将混合物小心酸化至pH-4，真空浓缩，用二氯甲烷萃取，用硫酸钠干燥，浓缩后用硅胶柱纯化，用AcOH/MeOH/CH2Cl2(0.01：1：5)洗脱，得到3，3'-((叔丁氧基羰基)亚氨基)二丙酸(13.62g，产率84％)。ESI MS m/z C11H19NO6[M+H]+：计算值262.27，实测值262.40。

在0℃，向3，3'-((叔丁氧基羰基)亚氨基)二丙酸(8.0g，30.6mmol) 的二氯甲烷(500ml)溶液中加入五氧化二磷(8.70g，61.30mmol)。将混合物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌1小时，通过短硅胶柱过滤，并用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：6)洗脱。浓缩滤液，用乙酸乙酯/正己烷打浆，得到目标化合物(5.64g，74％产率)。ESI MS m/z C11H17NO5[M+H]+：计算值244.11，实测值244.30。

实施例6.2，5-二氧吡咯烷-1-基丙戊酸酯的合成。

在丙炔酸(5.00g，71.4mmol)的二氯甲烷(150ml)溶液中加入N，N’- 二异丙基乙胺(5ml，28.7mmol)、NHS(9.01g，78.3mmol)和EDC (20.0g，104.1mmol)，搅拌过夜，通过SiO2柱谱法(乙酸乙酯/正己烷1： 4)纯化，浓缩得到无油状的目标化合物(9.30g，产率79％)。1HNMR (500MHz，CDCl3)δ2.68(s，1H)，2.61(s，4H)。MS ESI m/z C7H5NaNO4[M+Na]+：计算值190.02，实测值190.20。

实施例7.2-丙氨酰肼基甲酸叔丁酯的合成。

向丙炔酸(5.00g，71.4mmol)、肼基羧酸叔丁酯(9.45g，71.5mmol)的二氯甲烷(150ml)溶液中加入N，N’-二异丙基乙胺(5ml，28.7mmol)和 EDC(20.0g，104.1mmol)，搅拌过夜，通过SiO2柱谱法(乙酸乙酯/正己烷 1：5)纯化，浓缩得到呈无油状的目标化合物(7.92g，产率84％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.76(m，2H)，2.68(s，1H)，1.39(s， 9H)。MS ESIm/z C5H12NaN2O2[M+Na]+：计算值155.09，实测值155.26。

实施例8.丙炔酰肼盐酸盐的合成。

将2-丙醇酰肼羧酸叔丁酯(4.01g，30.35mmol)溶解于1，4-二噁烷 (12mL)中的与4ml浓盐酸在4℃搅拌30分钟，用二噁烷(30ml)和甲苯(30 ml)稀释，并减压浓缩。将粗品用硅胶柱纯化，使用甲醇/二氯甲烷(5％至 10％，含1％的甲酸)的混合物作为洗脱剂洗脱，得到目标化合物(2.11g，产率 83％)，ESI MS m/z C3H5N2O[M+H]+：计算值85.03，实测值85.30。

实施例9.化合物2的合成

在10-L反应釜中将二乙氧基乙腈(1.00kg，7.74mol)溶解于甲醇(6.0 L)，在室温下加入(NH4)2S(48％水溶液，1.41kg，9.29mol)。釜内温度升至33℃而后又降回室温。搅拌过夜后，浓缩反应液。向残留物中加入乙酸乙酯(5L)，用饱和NaHCO3溶液(4×1.0L)洗，水相用乙酸乙酯(5×1.0 L)反萃。合并有机相，用饱和食盐水(3L)洗，之后用无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗品用石油醚打浆，真空抽滤，收集固体并用石油醚洗涤。滤液浓缩后再用石油醚打浆，合并收集所得固体，总共得到1.1kg(87％产率) 目标产物，为白或亮黄固体。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.81(d，J ＝71.1Hz，2H)，5.03(s，1H)，3.73(dq，J＝9.4，7.1Hz，2H)，3.64 (dq，J＝9.4，7.0Hz，2H)，1.25(t，J＝7.1Hz，6H)。

实施例10.化合物3的合成

在5-L三颈圆底瓶上装备一个回流冷凝管和一个恒压滴液漏斗。在其中加入分子筛(500g)和硫酰胺2(350g，2.14mol)的乙醇溶液(3L)，30 分钟内滴入3-溴丙酮酸乙酯(纯度80％，404mL，2.57mol)。滴加过程中内温稍有上升，随后将反应液加热至回流并搅拌30分钟。将反应液冷却至室温后用硅藻土过滤除去不溶物，并用乙酸乙酯洗滤饼。滤液浓缩后的粗产物和硅胶 (1.5kg)混合拌匀，通过硅胶柱(10kg)柱层析(10-20％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱)纯化，得到棕油状物，为目标化合物(509g，92％产率)。

实施例11.化合物4的合成

将缩醛(300g，1.16mol)的丙酮(3.0L)溶液加热至回流，在1.0小时内滴加4N HCl溶液(250mL)。TLC显示起始原料反应完全。反应液减压浓缩后分离两相。有机相加入乙酸乙酯稀释(1.5L)，并依次用饱和NaHCO3水溶液(1.0L)、水(1.0L)和食盐水(1.0L)洗，然后用无水硫酸钠干燥。合并所有的水相并用乙酸乙酯反萃，并用无水硫酸钠干燥有机相。滤出干燥剂后浓缩有机相，所得粗产品用石油醚/乙酸乙酯(5：1)溶液打浆，析出的固体经真空过滤收集，并用石油醚/乙酸乙酯(10：1)溶液洗。滤液浓缩用柱层析纯化(0-15％乙酸乙酯/石油醚)，所有固体合并，得目标产物40g(43％产率)，为白或亮黄固体。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ10.08–10.06 (m，1H)，8.53–8.50(m，1H)，4.49(q，J＝7.1Hz，2H)，1.44(t，J ＝7.1Hz，3H)。MS ESI m/z C7H8NO3S[M+H]+：计算值186.01，实测值 186.01.

实施例12.化合物6的合成

将NaN3(740g，11.4mol)溶于水(2.0L)后加入二氯甲烷(2.0L)并冷却至0℃，向该溶液中加入Tf2O(700mL，4.10mol)，历时1.5小时。加完后在0℃下继续搅拌3小时。分离出有机相，水相用二氯甲烷萃取(2×500 mL)。合并有机相，用饱和NaHCO3(3×1.0L)洗。室温下将此二氯甲烷溶液加入到(L)-异亮氨酸(300g，2.28mol)，碳酸钾(472g，3.42mol)，五水硫酸铜(5.7g，22.8mmol)的混合甲醇/水(1：1v/v，6.0L)溶液中。加料过程中反应体系内温度会稍微升高。混合液在室温下搅拌16小时，减压蒸去溶剂，水相用浓盐酸(大约280mL)酸化至pH 6-6.5(约280mL)，然后用磷酸盐缓冲液稀释(0.25M，pH 6.2，6.0L)，用乙酸乙酯(6×2.0L)洗去磺酸胺副产物。水相用浓盐酸(大约400mL)酸化至pH 3后用乙酸乙酯(4×2.0L)萃取。合并有机相，饱和食盐水洗(2.0L)，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得产物6(320g，89％产率)，为亮黄油状物。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ 12.01(s，1H)，3.82(d，J＝5.9Hz，1H)，2.00(ddd，J＝10.6，8.6，5.5 Hz，1H)，1.54(dqd，J＝14.8，7.5，4.4Hz，1H)，1.36–1.24(m， 1H)，1.08–0.99(m，3H)，0.97–0.87(m，3H)。

实施例13.化合物10的合成

在N2保护下室温下向(S)-叔丁基亚磺酸胺(100g，0.825mol)的四氢呋喃(1L)溶液中加入Ti(OEt)4(345mL，1.82mol)和3-甲基-2-丁酮(81 mL，0.825mol)。加热反应液，回流16小时后冷却至室温，然后倒入冰水 (1L)。过滤并且用乙酸乙酯洗滤饼。分离滤液中的有机相，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，其残留物减压蒸馏(15-20torr，95℃)得目标产物10(141g， 90％产率)，为黄油状物。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ2.54–2.44 (m，1H)，2.25(s，3H)，1.17(s，9H)，1.06(dd，J＝6.9，5.1Hz， 6H)。MS ESI m/z C9H19NaNOS[M+Na]+：计算值212.12，实测值212.11。

实施例14.化合物11的合成

在N2保护下，于-78℃下向二异丙胺(264mL，1.87mol)的四氢呋喃溶液中加入正丁基锂溶液(2.5M，681mL，1.70mol)。反应在30分钟内升温至0℃然后重新冷却至-78℃，向其中加入化合物10(258g，1.36mol)并用四氢呋喃(50mL)冲洗。搅拌1小时后滴加ClTi(OiPr)3(834g，3.17mol) 的四氢呋喃(1.0L)溶液。滴加完成1小时后再缓慢滴入化合物4(210g，1.13mol)的四氢呋喃(500mL)溶液，耗时1小时。所得溶液在-78℃继续搅拌3小时。TLC监测反应进行完全后，用乙酸和四氢呋喃(体积比1：1，300 mL)的混合液淬灭反应，而后将反应液倒入盐水(2L)，用乙酸乙酯萃取(8 ×1L)。有机相用水和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残留物经柱层析(二氯甲烷/乙酸乙酯/石油醚2：1：2)纯化，得化合物11(298g，74％产率)，为无油状物。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ8.13(s，1H)，6.63 (d，J＝8.2Hz，1H)，5.20–5.11(m，1H)，4.43(q，J＝7.0Hz，2H)， 3.42–3.28(m，2H)，2.89(dt，J＝13.1，6.5Hz，1H)，1.42(t，J＝7.1 Hz，3H)，1.33(s，9H)，1.25–1.22(m，6H)。MS ESI m/z C16H26NaN2O4S2[M+Na]+：计算值397.13，实测值397.11。

实施例15.化合物12的合成

将化合物11(509g，1.35mol)溶于四氢呋喃(200mL)，冷却至- 78℃，向其中缓慢加入Ti(OEt)4(570mL，2.72mol)，加完后搅拌1小时。然后在90分钟内分批加入NaBH4(51.3g，1.36mol)，反应在-78℃搅拌 3小时。TLC监测发现起始原料仍有剩余。缓慢加入EtOH(50mL)，继续搅拌1.5小时后将反应液倒入饱和食盐水(2L，含250mL HOAc)，升至室温。经过硅藻土过滤，分离有机相。水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥有机相、过滤并浓缩。残留物经柱谱法(乙酸乙酯/石油醚1：1)纯化得化合物 12(364g，71％产率)，为白固体。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ8.10 (s，1H)，5.51(d，J＝5.8Hz，1H)，5.23–5.15(m，1H)，4.41(q，J ＝7.0Hz，2H)，3.48–3.40(m，1H)，3.37(d，J＝8.3Hz，1H)，2.29 (t，J＝13.0Hz，1H)，1.95–1.87(m，1H)，1.73–1.67(m，1H)，1.40 (t，J＝7.1Hz，3H)，1.29(s，9H)，0.93(d，J＝7.3Hz，3H)，0.90 (d，J＝7.2Hz，3H).MS ESI m/z计算值C16H28NaN2O4S2[M+Na]+：399.15，实测值399.14。

实施例16.化合物13的合成

在0℃下，于化合物12(600g，1.60mol)的乙醇(590mL)溶液中加入 4N HCl的1，4-二氧六环(590mL)溶液。反应逐渐升至室温后搅拌2.5小时。过滤收集析出的白固体并用乙酸乙酯洗。滤液浓缩后用乙酸乙酯打浆。合并两次获得的白固体，共446g(90％产率)。

实施例17.化合物14的合成

将叠氮-Ile-OH(6，153g，0.97mol)溶于四氢呋喃(1.5L)并冷却至 0℃，依次加入NMM(214mL，1.94mol)和氯甲酸异丁酯(95mL，0.73 mol)。在0℃搅拌1小时后分批加入化合物13(150g，0.49mmol)。在 0℃搅拌30分钟后，逐渐升至室温并继续搅拌2小时。反应在0℃下加冰水淬灭并用乙酸乙酯萃取三遍。合并有机相用1N HCl洗，饱和NaHCO3洗和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤浓缩，残留物经柱层析(0-30％乙酸乙酯/石油醚) 纯化得到白固体(140g，70％产率)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.14 (s，1H)，6.57(d，J＝8.9Hz，1H)，4.91(d，J＝11.1Hz，1H)，4.44 (dd，J＝13.2，6.3Hz，2H)，4.08–3.95(m，2H)，2.21(dd，J＝24.4，11.5Hz，2H)，1.90–1.79(m，3H)，1.42(t，J＝6.6Hz，3H)，1.37– 1.27(m，2H)，1.11(d，J＝6.4Hz，3H)，1.01–0.94(m，9H)。MS ESI m/z计算值C18H30N5O4S[M+H]+：412.19，实测值412.19。

实施例18.化合物15的合成

在0℃下依次向化合物14(436g，1.05mol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入咪唑(94g，1.37mmol)和三乙基氯硅烷(222mL，1.32mol)。反应液历时1小时升至室温后，继续搅拌1小时。加入饱和食盐水淬灭，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取。合并后的有机相经干燥、过滤、浓缩后用柱层析 (15-35％乙酸乙酯/石油醚)纯化得产物15(557.4g，95％产率)，为无油状物。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.12(s，1H)，6.75(d，J＝8.0 Hz，1H)，5.20–5.12(m，1H)，4.44(q，J＝7.0Hz，2H)，4.06–3.97 (m，1H)，3.87(d，J＝3.8Hz，1H)，2.14(d，J＝3.8Hz，1H)，2.01– 1.91(m，3H)，1.42(t，J＝7.1Hz，3H)，1.34–1.25(m，2H)，1.06 (d，J＝6.8Hz，3H)，1.00–0.93(m，18H)，0.88(dd，J＝19.1，6.8 Hz，6H).MS ESI m/z C24H44N5O4SSi[M+H]+：计算值526.28，实测值526.28。

Example 19.化合物16的合成

在0℃下，向化合物15(408g，0.77mol)和(145mL，2.32 mol)的四氢呋喃(4L)溶液中加入钠氢(60％，62.2g，1.55mol)。将所得的反应液在0℃搅拌过夜，而后倒入激烈搅拌的冰水饱和氯化铵(5L)溶液中。用乙酸乙酯(3×500mL)萃取。合并后的有机相经干燥、过滤、浓缩后用柱层析(15-35％乙酸乙酯/石油醚)纯化得产物16(388g，93％产率)，为亮黄油状物。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.09(s，1H)，4.95(d，J ＝6.6Hz，1H)，4.41(q，J＝7.1Hz，2H)，3.56(d，J＝9.5Hz，1H)， 2.98(s，3H)，2.27–2.06(m，4H)，1.83–1.70(m，2H)，1.41(t，J＝ 7.2Hz，3H)，1.29(ddd，J＝8.9，6.8，1.6Hz，3H)，1.01(d，J＝6.6 Hz，3H)，0.96(dt，J＝8.0，2.9Hz，15H)，0.92(d，J＝6.6Hz，3H)， 0.90(d，J＝6.7Hz，3H).MS ESI m/zC25H46N5O4SSi[M+H]+：计算值 540.30，实测值540.30。

实施例20.化合物17的合成

向化合物16(1.01g，1.87mmol)的甲醇(15mL)溶液中滴入0.1N HCl 直到pH为中性。加入Pd/C(10wt％，583mg)后将该混合溶液在H2(1atm) 环境于室温搅拌16小时。滤去Pd/C，甲醇洗。滤液旋干，残留物复溶于乙酸乙酯(50mL)中，用无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩得化合物17(900mg，94％产率)，为浅黄油状物。

实施例21.化合物22的合成

向D-呱啶酸(10.0g，77.4mmol)的甲醇(100mL)溶液中加入甲醛 (37％水溶液，30.8mL，154.8mmol)和Pd/C(10wt％，1.0g)。将该反应液在H2(1atm)环境中搅拌过夜，而后用硅藻土过滤，甲醇洗。滤液浓缩得化合物22(10.0g，90％产率)，为白固体。

实施例22.化合物23的合成

向D-N-甲基呱啶酸(2.65g，18.5mmol)的乙酸乙酯(50mL)溶液中加入五氟苯酚(3.75g，20.4mmol)和DCC(4.21g，20.4mmol)。反应在室温下搅拌16小时，硅藻土过滤，用10mL乙酸乙酯洗。滤液不用进一步纯化，直接使用。

实施例23.化合物28的合成

将2-甲基丙氨酸(500g，4.85mol)，甲醛(37％水溶液，1.0L，12.1 mol)和甲酸(1.0L)的混合液加热至回流(80℃)。搅拌3.0小时后冷却至室温，加入6N HCl(850mL)，而后浓缩反应液。过滤收集所得的固体并用乙酸乙酯洗三遍(1.0L)。将固体溶于水(1.5L)并用4N NaOH(约1.0 L)中和至pH 7。浓缩并用乙醇(2.0L)共沸以除水。残留物用甲醇(2.0L) 溶解，过滤除去NaCl固体，乙酸乙酯洗。滤液浓缩后得白固体639.2g，包含有少量NaCl，可直接使用不用进一步纯化。

实施例24.化合物29的合成

向化合物2-(二甲基氨基)-2-甲基丙酸(97g，0.74mol)的乙酸乙酯(1 L)溶液中加入五氟苯酚(163g，0.88mol)和DIC(126mL，0.81mol)。反应室温搅拌24小时后用硅藻土过滤，用10mL乙酸乙酯洗。滤液不经进一步纯化直接使用。

实施例25.化合物30的合成

向五氟苯基酯23的乙酸乙酯溶液中加入干Pd/C(10wt％，300mg)和叠氮化合物16(3.33g，6.61mmol)。反应液在氢气(1atm)环境中搅拌27小时，而后用硅藻土过滤，乙酸乙酯洗。滤液旋干经柱层析(0-5％甲醇/乙酸乙酯) 纯化得化合30(3.90g，86％产率)。MS ESIm/z C32H59N4O5SSi[M+H]+计算值639.39，实测值639.39。

实施例26.化合物31的合成

将化合物30(3.90g，6.1mmol)溶于乙酸/水/四氢呋喃(v/v/v 3：1：1， 100mL)混合溶液中，室温搅拌48小时。然后浓缩，残留物经柱层析(2：98至 15：85甲醇/乙酸乙酯)纯化得化合物31(2.50g，两步产率72％).MS ESI m/z C26H45N4O5S[M+H]+：计算值525.30，实测值525.33。

实施例27.化合物32的合成

在0℃下将LiOH(0.4N，47.7mL，19.1mmol)水溶液加入化合物31 (2.50g，4.76mmol，1.0eq.)的二噁烷(47.7mL)溶液中。室温搅拌2小时后浓缩。残留物经柱层析(100％二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇/氨水80：20：1) 纯化得化合物32(2.36g，99％产率)，为无定形白固体。MS ESI m/z C24H41N4O5S[M+H]+：计算值497.27，实测值497.28。

实施例28.化合物33的合成

在0℃下向化合物32(2.36g，4.75mmol)的吡啶(50mL)溶液中滴入乙酸酐(2.25mL，24mmol)。反应经2小时逐渐升至室温，并继续搅拌24小时。浓缩后加入二噁烷/水(v/v 1：1，10mL)混合液搅拌1小时，以破坏可能生成的酸酐。浓缩后的残留物经柱层析(100％二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇/氨水50： 50：1)纯化，得化合物33(2.25g，88％产率)为无定形白固体。MS ESI m/z C26H43N4O6S[M+H]+：计算值539.28，实测值539.28。

实施例29.化合物38的合成

向上述五氟苯基酯29的乙酸乙酯溶液中加入化合物16(200g，0.37mol) 和干的Pd/C(10wt％，10g)。反应液在氢气(1atm)环境中搅拌27小时。硅藻土过滤，乙酸乙酯洗。合并的有机相浓缩后经柱层析(0-5％甲醇/乙酸乙酯) 纯化得化合物38(184g，79％产率).MSESI m/z C31H58N4O5SSi[M+H]+：计算值627.39，实测值627.39。

实施例30.化合物39的合成

将化合物38(200g，0.32mmol)溶于乙酸/水/四氢呋喃(v/v/v 3：1： 1，638mL)混合溶液中，室温搅拌4天。反应液浓缩后加甲苯共沸浓缩，此步骤重复两遍后得化合物39，直接用于下一步反应。MS ESI m/z C25H45N4O5S [M+H]+：计算值513.30，实测值513.30。

实施例31.化合物40的合成

在0℃下将氢氧化锂(0.4N，600mL，2.55mol)的水溶液加入化合物39 (160g，0.319mol，1.0eq.)的甲醇(1.2L)溶液中。反应在室温搅拌2小时后浓缩。经柱层析(100％二氯甲烷至80：20：1二氯甲烷/甲醇/氨水)得化合物 40(140g，两步产率91％)为无定形白固体。MS ESI m/z C23H40N4O5S [M+H]+：计算值485.27，实测值485.27。

实施例32.化合物41的合成

将化合物27(143g，0.30mol，1.0eq.)和DMAP(0.36g，2.95mmol， 0.01eq.)溶于无水四氢呋喃(1.4L)与无水DMF(75mL)的混合溶液中。冷却至0℃，加入三乙胺(82.2mL，0.59mmol，2.0eq.)和乙酸酐(56mL，0.59 mmol，2.0eq.)。反应逐渐升至室温并搅拌24小时。浓缩后经柱层析(5-50％甲醇/二氯甲烷)纯化得化合物41(147g，95％产率)，为无定形白固体。MS ESI m/z C25H44N4O6S[M+H]+：计算值527.28，实测值527.28。

实施例33.化合物41a的合成

在室温下的氮气环境中，向化合物41(5.0g，9.5mmol，1.0eq.)的无水二氯甲烷(100mL)溶液中加入EDC(4.6g，23.8mmol，2.5eq.)和五氟苯酚 (4.4g，23.8mmol，2.5eq.)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后在二氯甲烷 (100mL)中稀释，用水(2×200mL)和盐水(200mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，并通过硅胶柱层析(50％EtOAc/PE)纯化，得到白固体状的化合物41a(5.2g，产率79％)。MS ESI m/z C31H42F5N4O6S[M+H]+：计算值693.27，实测值693.27。.

实施例34.化合物95的合成

向配备有机械搅拌棒的500mL圆底瓶中加入三苯基膦(100g，381 mmol，1.0eq.)和2-溴丙酸乙酯(100mL，762mmol，2.0eq.)。反应液在N2保护下加热至50℃，搅拌过夜。当白固体(PPh3)全部溶解后，大量的白产物开始析出。经石油醚/乙酸乙酯打浆后抽滤收集白固体，得化合物95 (135g，80％产率)。MS ESI m/z C23H24O2P[M-Br]+：计算值363.15，实测值 363.13.。

实施例35.化合物96合成

在剧烈的搅拌下将化合物95(135.42g，305.7mmol)的二氯甲烷(500 mL)溶液加入到10％NaOH(450mL)水溶液中。有机相立即变黄，搅拌30 分钟后，TLC显示反应完全。分离出有机相，水相用二氯甲烷(2×200mL) 萃取。合并后的有机相经饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后浓缩得黄固体96 (104g，94％产率)。MS ESI m/z C23H24O2P[M+H]+：计算值362.14，实测值 363.13。粗产物直接用于下一步。

实施例36.化合物98的合成

向Boc-L-酪氨酸甲酯(670g，2.27mol，1.1eq.)，碳酸钾(358g， 2.5mol，1.1eq.)和碘化钾(38g，0.227mol，0.1eq.)的丙酮(3L)溶液中缓慢加入苄基溴(283mL，2.38mol，1.05eq.)。回流过夜，冷却后加入水 (6L)，用乙酸乙酯(5×100L)萃取。合并后的有机相用饱和食盐水(2L) 洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经硅胶柱层析(4：1石油醚/乙酸乙酯)得白固体98(795g，91％产率).1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.43(d，J ＝7.0Hz，2H)，7.38(t，J＝7.4Hz，2H)，7.32(t，J＝7.2Hz，1H)，7.04 (d，J＝8.5Hz，2H)，6.91(d，J＝8.6Hz，2H)，5.04(s，2H)，4.55 (d，J＝6.9Hz，1H)，3.71(s，3H)，3.03(qd，J＝14.0，5.8Hz，2H)， 1.43(s，9H)。MS ESI m/z C22H28NO5[M+H]+：计算值386.19，实测值 386.19。

实施例37.化合物99的合成

在-78°C下向化合物98(380g，987mmol，1.0eq.)的无水二氯甲烷 (1L)溶液中缓慢滴加DIBAL(1.0M正己烷溶液，2.9L，2.9eq.)，历时3 小时。加完后用3L乙醇淬灭反应。滴加1N HCl至pH 4。所得混合液逐渐升至 0℃，分出有机相，水相用乙酸乙酯(3×3L)萃取。合并后的有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，并浓缩。经石油醚/乙酸乙酯打浆得白固体99 (263g，75％产率).1H NMR(500MHz，CDCl3)δ9.65(s，1H)，7.45 (d，J＝7.1Hz，2H)，7.41(t，J＝7.4Hz，2H)，7.35(t，J＝7.1Hz， 1H)，7.11(d，J＝8.6Hz，2H)，6.95(d，J＝8.6Hz，2H)，5.07(s， 2H)，4.42(dd，J＝12.4，6.1Hz，1H)，3.09(d，J＝6.2Hz，2H)，1.46 (s，9H).MSESI m/z C21H26NO4[M+H]+：计算值356.18，实测值356.19。

实施例38.化合物100的合成

室温下，向化合物99(81.4g，229mmol，1.0eq.)的无水二氯甲烷(800 mL)溶液中加入叶立德96(2.0eq.)的无水二氯甲烷(800mL)溶液，历时 30分钟。反应在室温搅拌过夜后浓缩，经硅胶柱层析(6：1石油醚/乙酸乙酯)纯化后得白固体100(63.4g，63％产率).1HNMR(500MHz， CDCl3)δ7.45–7.41(m，2H)，7.40–7.35(m，2H)，7.33(d，J＝7.2 Hz，1H)，7.10–7.06(m，2H)，6.92–6.88(m，2H)，6.50(dd，J＝ 8.8，1.3Hz，1H)，5.04(s，2H)，4.57(s，2H)，4.18(q，J＝7.1Hz， 2H)，2.86(d，J＝8.5Hz，1H)，2.72(dd，J＝13.6，6.8Hz，1H)，1.71 (d，J＝1.4Hz，3H)，1.41(d，J＝2.2Hz，9H)，1.28(td，J＝7.5，5.1 Hz，4H).MS ESI m/zC26H33NaNO5[M+Na]+：计算值462.24，实测值 462.22。

实施例39.化合物101的合成

在氢化反应瓶中将Pd/C(1.83g，10wt％，50％水)加入到化合物100 (30.2g，68.9mmol)的四氢呋喃(100mL)与甲醇(300mL)混合溶液中。混合物在1atm H2环境下振摇过夜。硅藻土过滤，滤液浓缩得化合物101(25.0 g，接近理论产率)，为无油状物。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.99 (d，J＝7.0Hz，2H)，6.72(d，J＝7.6Hz，2H)，4.39(s，1H)，4.18– 4.04(m，2H)，3.82(s，1H)，2.60(dd，J＝37.2，20.9Hz，4H)，1.95– 1.81(m，1H)，1.39(s，11H)，1.24(dd，J＝9.5，4.3Hz，3H)，1.13 (t，J＝8.9Hz，3H).MS ESI m/z C19H31NO5[M+H]+：计算值352.20，实测值 352.19。

实施例40.化合物102的合成

在室温下向化合物101(5.96g，35.9mmol，1.0eq.)的无水二氯甲烷 (200mL)溶液中加入乙酸酐(3.2mL，33.9mmol，2.0eq.)和硝酸(65％- 68％水溶液，3.5mL，50.79mmol，3.0eq.)。室温搅拌30分钟后，TLC显示反应完全。反应液用水(3×200mL)洗，水相用二氯甲烷(3×100mL)反萃。合并的二氯甲烷相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。经硅胶柱层析(5：1石油醚/乙酸乙酯)纯化得化合物102(4.18g，72％产率)，为一黄固体。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ10.49(s，1H)，7.89(s， 1H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.09(d，J＝8.6Hz，1H)，4.32(d，J＝ 8.3Hz，1H)，4.12(dd，J＝14.0，7.0Hz，2H)，3.80(s，1H)，2.76 (dd，J＝13.0，6.8Hz，2H)，2.59(s，1H)，1.88(s，1H)，1.37(t，J＝ 8.7Hz，9H)，1.25(dd，J＝13.5，6.9Hz，4H)，1.16(t，J＝8.0Hz，3H). MS ESI m/z C19H28NaN2O7[M+Na]+：计算值419.19，实测值419.17。

实施例41.化合物103的合成

在室温下，向化合物102(15.3g，38.6mmol，1.0eq.)的四氢呋喃(100 mL)与甲醇(100mL)混合溶液中加入LiOH·H2O(16.3g，389mmol， 10.0eq.)的水溶液(190mL)。反应室温搅拌40分钟后，加水(400mL)稀释并用1N KHSO4调至pH 3-4。用乙酸乙酯(3×300mL)萃取后，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得103(14.4g，约100％产率)，为一黄固体。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ10.48(s，1H)，7.98– 7.88(m，1H)，7.42(dd，J＝18.4，8.2Hz，1H)，7.14–7.03(m，1H)， 4.48(d，J＝8.6Hz，1H)，3.90(s，1H)，2.82–2.53(m，3H)，1.97– 1.82(m，2H)，1.42–1.27(m，10H)，1.21(d，J＝6.7Hz，4H).MS ESI m/z C17H23N2O7[M-H]-：计算值367.16，实测值367.14。

实施例42.化合物104的合成

在氢化反应瓶中将Pd/C(2.60g，10wt％)加入到化合物103(26.0g， 70.6mmol，1.0eq.)的甲醇(260mL)溶液中。混合物在1atm H2环境下搅拌反应过夜。硅藻土过滤，滤液浓缩得化合物104(24.0g，约100％产率)，为绿油状物。

实施例43.化合物106的合成

将2-溴丙酸叔丁酯(255g，1.22mol，1.0eq.)和三苯基膦(320g，1.22 mol，1.0eq.)的干燥乙腈(1L)溶液在室温搅拌18小时。减压旋去乙腈后加入甲苯使白固体析出。倾倒出甲苯后将白固体溶于二氯甲烷(1L)并转移至分液漏斗。加入10％NaOH水溶液(1L)，摇晃后有机相很快变黄。分出有机相，水相用二氯甲烷(1L)反萃一次。合并二氯甲烷相，饱和食盐水(400 mL)洗，无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩得叶立德106(280g，58％)，为一黄固体。

实施例44.化合物107的合成

向化合物99(450g，1.27mol，1.0eq.)的干燥二氯甲烷(3L)溶液中加入叶立德106(546g，1.40mmol，1.1eq.)。室温搅拌过夜。TLC监测反应完全后，经柱层析(10-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物107(444g，75％产率)，为一白固体。ESI m/z C28H38NO5[M+H]+：计算值468.27，实测值 468.22。

实施例45.化合物108的合成

将化合物107(63g，0.13mol)溶于甲醇(315mL)，加入Pd/C(10 wt％，6.3g)，在氢气(1atm)环境下室温搅拌过夜。过滤除去催化剂后浓缩滤液得化合物108(45.8g，93％产率)。

实施例46.化合物109的合成

在室温下向化合物108(390g，1.03mol，1.0eq.)的四氢呋喃(4L)溶液中加入亚硝酸叔丁酯(1.06kg，10.3mol.，1.0eq.)。搅拌过夜后旋去四氢呋喃，残留物经柱层析(10-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物109(314g， 72％产率)，为一亮黄固体。

实施例47.化合物110的合成

在氮气保护下向化合物109(166g，0.392mol，1.0eq.)的乙酸乙酯(500 mL)溶液中加入Pd/C(10wt％，16g)。通入氢气，真空置换三次。反应液在氢气(1atm)环境中于室温搅拌16小时。硅藻土过滤，浓缩得化合物110 (146g，97％产率)，为一黄泡沫状固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 6.62(d，J＝7.9Hz，1H)，6.55(s，1H)，6.43(d，J＝7.3Hz，1H)， 4.39(dd，J＝53.0，44.2Hz，1H)，3.77(s，4H)，2.72–2.29(m， 3H)，1.83–1.58(m，1H)，1.40(d，J＝7.6Hz，18H)，1.24(s， 1H)，1.06(t，J＝5.7Hz，3H).MS ESI m/z C21H35N2O5[M+H]+：计算值394.25，实测值395.25。

实施例48.化合物114的合成

在在氮气保护下，将(S)-4-异丙基恶唑烷-2-酮(5.00g，38.7mmol， 1.0eq.)溶于无水四氢呋喃(200mL)中，降温至-78℃，30分钟内将正丁基锂(2.5M正己烷溶液，17.0mL，1.2eq.)滴加进反应瓶中，在-78℃下反应1小时。然后滴加丙酰氯(4.0mL，42.58mmol，1.1eq.)，滴加完毕后，在-78℃下反应1小时，薄层谱监测反应完毕，将反应液倒入饱和食盐水溶液(250 mL)中，乙酸乙酯萃取(3×100mL)，合并有机相，用1N NaOH溶液(200 mL)洗涤一次，饱和食盐水溶液(300mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用硅胶柱纯化(7：1石油醚/乙酸乙酯)得到无油状物6.36g，产率89％。MS ESI m/z C9H16NO3[M+H]+计算值186.10，实测值186.10。1H NMR (400MHz，CDCl3)δ4.48–4.39(m，1H)，4.27(t，J＝8.7Hz，1H)，4.21(dd，J＝9.1，3.1Hz，1H)，3.06–2.82(m，2H)，2.38(dtd，J＝ 14.0，7.0，4.0Hz，1H)，1.17(t，J＝7.4Hz，3H)，0.90(dd，J＝17.0， 7.0Hz，6H)。

实施例49.化合物115的合成

在氮气保护下，将化合物(S)-4-异丙基-3-丙酰基恶唑烷-2-酮(2.00g，11.9mmol)溶于无水二氯甲烷(200mL)中，降温至0℃，将二异丙基乙基胺 (2.3mL，12.9mmol，1.2eq.)和n-Bu2BOTf(1.0M二氯甲烷溶液，12.0 mL，1.1eq.)滴加进反应瓶中，0℃下反应45分钟，再降温至-78℃，将化合物99(4.24mL，10.8mmol，1.0eq.)的二氯甲烷溶液滴加进反应瓶中，-78℃下反应1小时，然后慢慢升温至室温并反应过夜。次日，将磷酸盐缓冲液 (0.1M，pH 7.0，100mL)加进反应瓶中，分液，水相用二氯甲烷萃取(3×50 mL)，合并有机相，用饱和食盐水溶液(200mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干得粗品。将粗品溶于甲醇(100mL)中，降温至0℃，将H2O2(30％水溶液，26mL)滴入，0℃下反应3小时，旋蒸除去甲醇，加水(100mL)，用乙酸乙酯萃取(3×100mL)，合并有机相，饱和食盐水溶液(300mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经硅胶柱纯化(3：1石油醚/乙酸乙酯)得到白泡沫状固体2.7g，产率49％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 7.36(ddd，J＝24.2，14.2，7.1Hz，5H)，7.12(d，J＝8.4Hz，2H)，6.90 (d，J＝8.5Hz，2H)，5.02(s，2H)，4.69(d，J＝9.0Hz，1H)，4.45 (d，J＝4.1Hz，1H)，4.33(t，J＝8.4Hz，1H)，4.15(d，J＝8.6Hz， 1H)，3.90(dd，J＝16.6，8.0Hz，1H)，3.85–3.77(m，2H)，2.81(d， J＝7.6Hz，2H)，2.27(dd，J＝11.4，6.7Hz，1H)，1.35(s，9H)，0.89 (dd，J＝14.3，6.9Hz，6H)。MS ESI m/z C30H41N2O7[M+H]+计算值541.28，实测值541.30。

实施例50.化合物116的合成

在氮气保护下，将化合物115(2.50g，4.63mmol，1.0eq.)溶于无水四氢呋喃(46mL)中，加入二硫羰基咪唑(2.48g，13.89mmol，3.0eq.)，回流反应过夜。次日，加水(100mL)，乙酸乙酯萃取(3×50mL)，合并有机相，用饱和食盐水溶液(300mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经硅胶柱纯化(3：1石油醚/乙酸乙酯)得到黄泡沫状固体2.33g，产率77％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.41(s，1H)，7.67(s，1H)，7.36(dt，J＝ 16.0，6.9Hz，6H)，7.09(s，1H)，7.05(d，J＝8.4Hz，2H)，6.86(d， J＝8.4Hz，2H)，6.32(d，J＝9.5Hz，1H)，5.01(s，2H)，4.56–4.43 (m，2H)，4.32(ddd，J＝16.2，15.6，7.8Hz，3H)，4.19(d，J＝8.7 Hz，1H)，2.96(dd，J＝14.6，4.4Hz，1H)，2.49(dd，J＝14.5，10.5 Hz，1H)，2.29(td，J＝13.4，6.7Hz，1H)，1.73(s，1H)，1.29(s， 9H)，0.91(dd，J＝13.9，6.9Hz，6H)。MS ESI m/z C34H43N4O7S[M+H]+计算值651.27，实测值651.39。

实施例51.化合物117的合成

在氮气保护下，将化合物116(1.90g，2.92mmol，1.0eq.)溶于无水甲苯 (30mL)中，加入偶氮二异(0.05g，0.584mmol，2.0eq.)和三丁基锡烷 (1.6mL，5.84mmol)，回流反应2.5小时，旋干，经硅胶柱纯化(5：1石油醚/乙酸乙酯)得到白泡沫状固体1.21g，产率79％。1H NMR(400MHz， CDCl3)δ7.36(ddd，J＝24.5，14.5，7.1Hz，5H)，7.08(d，J＝8.5Hz，2H)，6.90(d，J＝8.5Hz，2H)，5.04(d，J＝5.1Hz，2H)，4.48(d，J＝ 4.2Hz，1H)，4.33(t，J＝8.4Hz，1H)，4.22(d，J＝9.7Hz，1H)，4.15 (d，J＝8.8Hz，1H)，3.81(s，2H)，2.73(dd，J＝14.1，5.9Hz，1H)， 2.61(dd，J＝14.0，7.2Hz，1H)，2.29(dq，J＝13.5，6.8Hz，1H)，2.11–2.00(m，1H)，1.60(dd，J＝15.2，6.2Hz，2H)，1.35(s，9H)，1.20 (d，J＝6.9Hz，3H)，0.89(dd，J＝14.0，6.9Hz，6H)。MS ESI m/z C30H41N2O6[M+H]+：计算值525.28，实测值525.37。

实施例52.化合物118的合成

将化合物117(1.20g，2.29mmol，1.0eq.)溶于四氢呋喃(30mL)和水 (6mL)中，冰浴下加入LiOH(0.192g，4.58mmol，2.0eq.)和H2O2(30％水溶液，1.4mL)，冰浴反应3小时，加入亚硫酸钠(1.5M，30mL)，冰浴下搅拌30分钟后用1N KHSO4调节pH至4，乙酸乙酯萃取(3×50mL)，合并有机相，饱和食盐水溶液(200mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(3：1石油醚/乙酸乙酯)得到白固体0.78g，产率82％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.46–7.28(m，5H)，7.07(d，J＝7.7Hz， 2H)，6.91(d，J＝7.8Hz，2H)，5.04(s，2H)，4.52(d，J＝8.5Hz， 1H)，3.87(d，J＝41.8Hz，1H)，2.82–2.43(m，3H)，1.85(t，J＝12.2 Hz，1H)，1.41(s，9H)，1.17(d，J＝6.9Hz，3H)。MS ESI m/z C24H32NO5[M+H]+计算值414.22，实测值414.21。

实施例53.化合物119的合成

将化合物118(0.77g，1.86mmol，1.0eq.)溶于甲醇(15mL)中，加入 Pd/C(10wt％，0.25g)，催化加氢(1atm H2)反应16小时，用硅藻土(助滤剂)过滤，旋干得到化合物119为白固体0.58g，产率96％。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.00(d，J＝7.5Hz，2H)，6.80(s，2H)，4.51(d，J＝ 9.0Hz，1H)，3.88(s，1H)，2.66(dd，J＝65.6，22.6Hz，4H)，1.88 (t，J＝12.2Hz，1H)，1.42(s，9H)，1.14(d，J＝6.6Hz，3H)。MS ESI m/z C17H26NO5[M+H]+：计算值324.17，实测值324.16。

实施例54.化合物120的合成

将化合物119(0.57g，1.76mmol，1.0eq.)溶于无水四氢呋喃(10mL) 中，冰浴下滴加亚硝酸叔丁酯(0.63mL，5.28mmol，3.0eq.)，完毕升温至室温反应2h，加水(50mL)，用乙酸乙酯萃取(3×30mL)，合并有机相，用饱和食盐水溶液(100mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，经硅胶柱纯化(2：1石油醚/乙酸乙酯，含0.1％乙酸)得到黄固体0.50g，产率77％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.00(s，1H)，10.68(s，1H)， 7.67(s，1H)，7.34(d，J＝8.4Hz，1H)，7.03(d，J＝8.4Hz，1H)， 6.69(d，J＝8.9Hz，1H)，3.56(d，J＝3.8Hz，1H)，2.67(dd，J＝13.5，5.1Hz，1H)，2.41(dd，J＝13.8，6.6Hz，1H)，1.78–1.65(m， 1H)，1.27(s，9H)，1.18(s，1H)，1.05(d，J＝7.1Hz，3H)。MS ESI m/z C17H25N2O7[M+H]+：计算值369.15，实测值369.14。

实施例55.化合物121的合成

将化合物120(0.77g，1.86mmol)溶于甲醇(10mL)中，加入Pd/C (10wt％，0.02g)，催化加氢(1atm H2)反应1小时，用硅藻土(助滤剂)过滤，旋干得到化合物121白固体0.43g，产率93％。MS ESI m/z C17H27N2O5 [M+H]+计算值339.18，实测值339.17。1H NMR(400MHz，MeOD)δ6.60 (d，J＝7.9Hz，2H)，6.44(d，J＝7.3Hz，1H)，3.71(d，J＝6.3Hz， 1H)，2.62–2.37(m，3H)，1.83(ddd，J＝13.7，9.9，3.7Hz，1H)，1.39 (s，9H)，1.13(d，J＝7.1Hz，3H)。

实施例56.化合物124的合成

将马来酸酐(285g，2.76mol)溶于乙酸(1L)中，加入4-氨基丁酸(285 g，2.76mo)，室温反应30分钟，升温至回流后反应1.5小时，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，用乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品用石油醚和乙酸乙酯重结晶得到白固体(400g，产率 80％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.71(s，2H)，3.60(t，J＝6.7 Hz，2H)，2.38(t，J＝7.3Hz，2H)，2.00–1.84(m，2H)。

实施例57.化合物125的合成

将化合物124(400g，2.18mol，1.0eq.)溶于无水二氯甲烷(1.5L)中，加入N-羟基马来酰亚胺(276g，2.40mmol，1.1eq.)和DIC(303g，2.40 mol，1.1eq.)，室温反应过夜，旋干，硅胶柱纯化(1：2石油醚/乙酸乙酯) 得到NHS酯125为白固体382g，产率63％。1H NMR(500MHz，CDCl3) δ6.74(s，2H)，3.67(t，J＝6.8Hz，2H)，2.85(s，4H)，2.68(t，J＝ 7.5Hz，2H)，2.13–2.03(m，2H)。

实施例58.化合物126的合成

将化合物124(60g，328mmol，1.3eq.)溶于THF(600mL)中，冰浴，滴加N-甲基吗啉(85.3mL，984mmol，3.0eq.)和氯甲酸异丁酯(44.6mL， 426mmol，1.3eq.)，0℃下反应2小时后，滴加化合物104(102g，259 mmol)的THF(400mL)溶液，完毕，0℃反应30分钟，加水(300mL)，用乙酸乙酯萃取(3×300mL)，合并有机相，饱和食盐水溶液(100mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(9-35％乙酸乙酯/石油醚)得到化合物126为浅黄固体(104g，产率73％)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ8.86(s，1H)，8.40(d，J＝17.3Hz，1H)，6.87(s， 3H)，6.70(s，2H)，4.53–4.16(m，0H)，3.79(s，0H)，3.62(t，J＝ 6.1Hz，1H)，2.63(s，1H)，2.40(t，J＝6.9Hz，1H)，2.12–1.88(m，4H)，1.84–1.64(m，0H)，1.38(t，J＝9.6Hz，6H)，1.06(t，J＝6.0 Hz，3H)。

实施例59.化合物127的合成

将溶解在二氯甲烷(20mL)中的化合物126(12.7g，22.7mmol)，在0℃用三氟乙酸(40mL)处理，温热反应物至室温，并搅拌3小时。浓缩混合物并与甲苯一起浓缩三次。将残留物用乙醚研磨，收集浅黄固体127(11.4g，理论产率)。

实施例60.化合物128的合成

将化合物33(40mg，0.074mmol，1.0eq.)溶于乙酸乙酯中，加入五氟苯酚(27mg，0.148mmol，2.0eq.)和DCC(23mg，0.111mmol，1.5eq.)，室温反应16小时，硅胶垫过滤，用乙酸乙酯洗脱，将滤液浓缩，再溶于DMA(6 mL)中，加入化合物127(56.6mg，0.13mmol)和N，N’-二异丙基乙胺 (47.4μL，0.18mmol)，室温反应24小时，浓缩，制备HPLC(C18柱，10- 100％乙腈/水)纯化得到白固体128(43mg，产率63％)。MS ESI m/z C46H66N7O11S[M+H]+：计算值924.45，实测值924.45。

实施例61.化合物132的合成

将化合物41a(11g，15.9mmol，1.0eq.)和化合物127(12.3g，23.8 mmol，1.5eq.)溶于DMF(100mL)中，冰浴下加入N，N’-二异丙基乙胺 (6.9mL，39.7mmol)，升温至室温反应1小时，浓缩，硅胶柱纯化(0-10％甲醇/二氯甲烷)得到无定型固体10g，产率69％。MS ESI m/zC45H65N7O11S [M+H]+：计算值912.45，实测值912.45。

实施例62.化合物204的合成

将(R)-4-异丙基-2-恶唑烷酮(25.0g，0.194mol，1.0eq.)溶于1150mL无水THF中，在N2保护下，降温至-70℃，滴加n-BuLi(85.0mL，0.213mol， 1.1eq.)(温度控制在-70至-65℃之间)，滴加过程中有大量白固体析出，滴加完毕，-70℃下反应1h，再滴加丙酰氯(20.0mL，0.232mol，1.2eq.)，滴加完毕，-70℃下反应1h，薄层谱跟踪，反应完毕。将反应液倒入到1.2L 饱和氯化铵溶液中，乙酸乙酯萃取(700mL×1，350mL×2)，合并乙酸乙酯相，用1L 1mol/LNaOH溶液洗涤一次，1L水洗涤一次，1L饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干，得无液体。乙酸乙酯/石油醚(6-10％)过柱，得产物32.6g，产率90.8％。ESI：m/z：C9H17NO3[M+H]+：计算值186.1，实测值186.1。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.48–4.37(m，1H)，4.27(t， J＝8.7Hz，1H)，4.21(dd，J＝9.1，3.1Hz，1H)，3.04–2.82(m，2H)， 2.45–2.30(m，1H)，1.17(t，J＝7.4Hz，3H)，0.90(dd，J＝17.1，7.0 Hz，6H)。

实施例63.化合物205的合成。

在0℃下，在N2中，向(R)-4-异丙基-3-丙酰基氧唑烷-2-酮(18.4g，99.5 mmol，1.1eq.)的无水DCM(200mL)溶液中加入Bu2BOTf(1M二氯甲烷溶液，100mL，100mmol，1.1eq.)和DIPEA(19mL，108.6mmol，1.2eq.)，将混合物在相同温度下搅拌45分钟。在-78℃下加入醛99(32.2g，90.5mmol， 1.0eq.)的二氯甲烷(320mL)溶液，并在相同温度下搅拌1h，然后将该溶液在15小时内缓慢升温至室温。将混合物倒入700mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0) 中，并用乙酸乙酯萃取。有机萃取液用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，然后真空浓缩。将残余物溶于甲醇(730mL)中并冷却至0℃，然后缓慢加入 30％H2O2水溶液(225mL)，并将混合物在相同温度下搅拌3小时。加入水 (750mL)，然后将混合物真空浓缩以除去甲醇。所得水溶液用乙酸乙酯 (500mL，150mL×2)萃取，有机萃取液用5％碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，然后通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷/乙酸乙酯＝3∶1)得到标题化合物，为白泡沫状物(31.7g，64.8％)。ESI m/z： C30H41N2O7[M+H]+：541.3，实测值541.3。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ 7.49–7.29(m，5H)，7.17(t，J＝10.7Hz，2H)，6.93(d，J＝7.0Hz， 2H)，5.06(s，2H)，4.28(dd，J＝44.4，36.4Hz，3H)，4.04–3.52 (m，3H)，3.11–2.73(m，2H)，2.35(s，1H)，1.41(t，J＝16.3Hz， 9H)，0.91(dd，J＝15.6，6.4Hz，5H)。

实施例64.化合物206的合成。

向化合物205(28.3g，52.3mmol，1.0eq.)的无水THF(350mL)溶液中加入1，1-硫代羰基二咪唑(TCDI)(35.1g，157.0mmol，3.0eq.)，并将混合物加热回流过夜。通过TLC监测原料消耗后，将混合物真空浓缩并通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷：乙酸乙酯＝3∶1)，得到标题化合物，为浅黄泡沫状物 (26.1g，76.8％)。ESI m/z：C34H43N4O7S[M+H]+：计算值651.3，实测值 651.3。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.21(s，1H)，7.43(d，J＝11.8 Hz，1H)，7.42–7.28(m，5H)，7.06(d，J＝8.3Hz，2H)，7.01(s， 1H)，6.80(d，J＝8.3Hz，2H)，6.17(dd，J＝8.5，2.9Hz，1H)，4.96 (s，2H)，4.42–4.04(m，5H)，2.83(dd，J＝14.2，6.2Hz，1H)，2.69 (dd，J＝14.2，7.1Hz，1H)，2.32(dd，J＝6.8，4.2Hz，1H)，1.37(s， 9H)，1.30(d，J＝6.9Hz，3H)，0.87(dd，J＝9.9，7.0Hz，6H)。

实施例65.化合物207的合成。

在N2中，向化合物206(26.0g，40.0mmol，1.0eq.)的无水甲苯(350 mL)溶液中加入n-Bu3SnH(21.5mL，80.0mmol，2.0eq.)和2，2'-氮杂双(2- 甲基)(AIBN)(0.066g，0.01eq.)，并将混合物加热回流1小时。通过 TLC监测原料消耗后，将混合物真空浓缩并通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷：乙酸乙酯＝5∶1)，得到标题化合物，为白泡沫状物(6.0g，37.3％)。ESI m/z：C30H41N2O6[M+H]+：计算值525.3，实测值525.3。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.37(ddd，J＝25.1，15.1，7.1Hz，5H)，7.08(d，J＝7.9 Hz，2H)，6.89(d，J＝8.4Hz，2H)，5.03(s，2H)，4.61(d，J＝8.4 Hz，1H)，4.40(s，1H)，4.32–4.08(m，2H)，3.91–3.66(m，2H)， 2.83(d，J＝8.4Hz，1H)，2.60(t，J＝10.1Hz，1H)，2.33(s，1H)， 1.71(s，1H)，1.41(s，9H)，1.15(d，J＝6.5Hz，3H)，0.87(dd，J＝ 17.0，7.0Hz，6H)。

实施例66.化合物208的合成。

向化合物207(7.84g，15.0mmol，1.0eq.)的THF(90mL)和水(30 mL)溶液中加入LiOH·H2O(1.57g，37.5mmol，2.5eq.)的30％H2O2水溶液 (11.4mL，112.5mmol，7.5eq.)，并将混合物在相同温度下搅拌3小时。在 0℃下加入1.5M Na2SO3溶液(160mL)后，将混合物在相同温度下搅拌30分钟。然后缓慢加入1N KHSO4直至pH为4。用乙酸乙酯(200mL，75mL×2)萃取水溶液，有机萃取液用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩并通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷：乙酸乙酯＝2∶1)得到标题化合物，为白固体(6.18g，100％)。ESI m/z：C24H32N1O5[M+H]+：计算值414.2，实测值 414.2。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.39(ddd，J＝24.5，15.0，7.2Hz， 5H)，7.11(d，J＝7.8Hz，2H)，6.93(d，J＝8.3Hz，2H)，5.06(s， 2H)，4.44(t，J＝8.3Hz，1H)，3.83(d，J＝69.4Hz，1H)，2.85–2.61 (m，2H)，2.61–2.40(m，1H)，1.99–1.70(m，1H)，1.39(d，J＝ 26.1Hz，9H)，1.19(s，3H)。

实施例67.化合物209的合成

在氢化瓶中，将Pd/C(0.6g，10％Pd/C)加入到化合物208的甲醇 (50mL)溶液中加入。将混合物在1atm氢气环境中振荡过夜，然后过滤。浓缩滤液，得到标题化合物，为无油状物(4.8g，99％收率)。ESI m/z： C17H26N1O5[M+H]+：324.2，实测值324.2。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 6.97(d，J＝6.5Hz，2H)，6.74(d，J＝8.2Hz，2H)，3.93–3.66(m， 1H)，2.58(tdd，J＝19.5，12.9，7.4Hz，3H)，1.75(ddd，J＝20.1，16.3， 7.7Hz，1H)，1.37(d，J＝21.5Hz，9H)，1.11(d，J＝7.0Hz，3H)。

实施例68.化合物210的合成。

在N2中，0℃下向化合物209(4.8g，15.0mmol，1.0eq.)的无水THF(75 mL)溶液中缓慢加入t-BuONO(18.0mL，150mmol，10.0eq.)。在相同温度下搅拌3小时。通过TLC监测原料消耗后，向混合物中缓慢加入1N KHSO4直至pH为4。将所得水溶液用乙酸乙酯(150mL，75mL×2)萃取，有机萃取液用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，残余物通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷：乙酸乙酯＝3∶1)，得到标题化合物，为黄固体(3.6g， 65.4％)。ESI m/z：C17H25N2O7[M+H]+，计算值369.2，实测值369.2。1H NMR(400MHz，MeOD)δ7.93(d，J＝2.0Hz，1H)，7.48(dd，J＝8.6， 2.1Hz，1H)，7.06(d，J＝8.5Hz，1H)，3.83–3.71(m，1H)，2.82 (dd，J＝13.6，5.0Hz，1H)，2.66–2.41(m，2H)，1.84(ddd，J＝14.0， 10.6，5.6Hz，1H)，1.65–1.51(m，1H)，1.28(d，J＝24.9Hz，9H)， 1.15(d，J＝7.0Hz，3H)。

实施例69.化合物211的合成。

在氢化瓶中，将的Pd/C(0.2g，10％Pd/C)加入到化合物210(3.2g， 7.74mmol，1.0eq.)的甲醇(20mL)溶液中。将混合物在1atm氢气环境中振荡 3小时。通过TLC监测原料消耗后，将混合物过滤并将滤液浓缩，得到标题化合物，为白泡沫状物(2.3g，92.0％收率)。ESI m/z：C17H27N2O5[M+H]+计算值339.2，实测值339.2。1H NMR(400MHz，MeOD)δ6.61(d，J＝8.0 Hz，2H)，6.45(d，J＝6.3Hz，1H)，3.72(d，J＝7.3Hz，1H)，2.68– 2.34(m，3H)，1.81–1.66(m，1H)，1.56–1.45(m，1H)，1.36(d，J ＝29.0Hz，9H)，1.08(d，J＝6.9Hz，3H)。

实施例70.化合物390的合成

在-25℃下，向化合物102(1.00g，2.52mmol)的乙腈(10mL)溶液中加入 CCl4(2.2mL，22.7mmol，9.0eq.)。搅拌10分钟后，加入二异丙基乙胺 (0.88mL，5.04mmol，2.0eq.)和DMAP(0.03g，0.252mmol，0.1eq.)，然后加入亚磷酸二苄酯(0.84mL，3.78mmol，1.5eq.)。在1.5小时内将反应物温热至室温。然后用KH2PO4溶液(0.5M，50mL)淬灭。反应混合物用乙酸乙酯 (3×50mL)萃取。将合并的有机萃取物用无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩。残余物通过快速柱谱法纯化(10-50％乙酸乙酯/石油醚)，得到化合物390 (1.60g，96％收率)，为无油状物。MS ESI m/z C33H41N2O10P[M+H]+657，实测值657。

实施例71.化合物391的合成

向化合物390(1.60g，2.43mmol)的甲醇(20mL)溶液中加入Pd/C (10wt％，160mg)。在室温下将反应混合物在氢气环境(1atm)中搅拌3小时，然后通过硅藻土过滤并减压浓缩，得到白固体的化合物391(1.00g， 91％收率)。MS ESI m/z C19H31N2O8P[M-H]-计算值447，实测值447。

Example 72.化合物392的合成

在室温下，将化合物391(730mg，1.63mmol)的乙醇(10mL)溶液与1N NaOH(16mL，16.3mmol，10eq.)反应过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于水 (20mL)中，并用1N HCl酸化至pH 6。将水溶液减压浓缩，并将残余物经甲醇/乙酸乙酯(80：20，5mL)打浆后抽滤收集作为白固体化合物392 (0.68g，99％收率)。MS ESI m/z C17H27N2O8P[M-H]-计算值417，实测值417。

实施例73.化合物399的合成。

向2-(2-氨基乙氧基)乙醇(21.00g，200mmol，1.0eq.)和K2CO3(83.00 g，600mmol，3.0eq.)的乙腈(350mL)中加入BnBr(57.0mL，480mmol， 2.4eq.)。将混合物回流过夜，加入水(1L)，并用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。合并的有机层用盐水(1000mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱谱纯化(4∶1己烷/乙酸乙酯)，得到无油状物(50.97g，89.2％收率)。MS ESI m/z C18H23NO2Na[M+Na]+计算值309.17，实测值 309.19。

实施例74.化合物400的合成

向2-(2-(二(苄基氨基)乙氧基)乙醇(47.17g，165.3mmol，1.0 eq.)，丙烯酸叔丁酯(72.0mL，495.9mmol，3.0eq.)和n-Bu4NI(6.10g， 16.53mmol，0.1eq.)加入DCM(560mL)的氢氧化钠溶液(300mL，50％)。将混合物搅拌过夜。分离有机层，水层用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将有机层用水(3×300mL)和盐水(300mL)洗涤，用无水Na 2SO 4干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱谱纯化(7：1己烷/乙酸乙酯)，得到无油状物(61.08g，收率为89.4％)。MS ESIm/z C25H36NO4[M+H]+计算值414.2566，实测值 414.2384。

实施例75.化合物401的合成

在氢化瓶中，向3-(2-(2-(2-(二(苄基氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(20.00g，48.36mmol，1.0eq.)的THF(30mL)和甲醇(60mL)溶液中加入Pd/中的C(2.00g，10wt％，50％水)。将混合物振荡过夜，通过硅藻土 (助滤剂)过滤，并将滤液浓缩，得到无油状物(10.58g，93.8％收率)。 MS ESI m/z C11H24NO4[M+H]+计算值234.1627，实测值234.1810。

实施例76.化合物402的合成

在0℃下，向(E)-3-溴丙烯酸(0.15g，1mmol)，DMAP(0.15g，1.2 mmol)和DCC(0.21g，1mmol)的DCM(10ml)中的溶液中加入化合物401 (0.23g，加入1mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌过夜。将粗产物浓缩并通过硅胶柱谱纯化用EA/DCM梯度洗脱，得到标题产物402(0.31g，85％收率)。ESI MS m/z：C14H25BrNO5[M+H]+：计算机366.08，实测值366.08。

实施例77.化合物403的合成

在0℃下，将化合物402(0.31g，0.84mmol)溶解在甲酸(4mL)中，然后加入H2O(2mL)。将反应混合物温特至室温并搅拌过夜。将粗产物浓缩，无需进一步纯化即可用于下一步。ESI MS m/z：C10H17BrNO5[M+H]+计算值 310.02，实测值310.03。

实施例78.化合物404的合成

将化合物303(0.12g，0.39mmol)，NHS(0.067g，0.58mmol)和EDCI (0.11g，0.58mmol)溶解于DCM(10mL)中，并将混合物在室温下搅拌过夜，浓缩并通过硅胶柱谱纯化，得到标题产物404(0.13g，82％收率)。ESI MS m/z：C14H20BrN2O7[M+H]+计算值407.04，实测值407.04.

实施例79.化合物426的合成

将4-氨基丁酸(7.5g，75mmol)和NaOH(6g，150mmol)的H2O(40 mL)溶液冷却至0℃，并滴加CbzCl(16.1g，95mmol)的THF(32ml)与其反应。1小时后，使反应温热至室温并搅拌3小时。在真空下除去THF，加入 6N HCl将水溶液的pH调节至1.5。将溶液用乙酸乙酯萃取，有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到化合物426(16.4g，92％收率)。MS ESI m/z C12H16NO5[M+H]+计算值238.10，实测值238.08.

实施例80.化合物427的合成

将DMAP(0.8g，6.56mmol)和DCC(17.1g，83mmol)加入到4- (((苄氧基)羰基)氨基)丁酸(16.4g，69.2mmol)和t-BuOH(15.4g， 208mmol)的DCM(100mL)溶液中。在室温下搅拌过夜，将反应物过滤并将滤液浓缩。将残余物溶解在乙酸乙酯中，并用1N HCl，盐水洗涤，并经Na2SO4干燥。浓缩并通过柱谱纯化(10至50％乙酸乙酯/正己烷)，得到化合物427(7.5g，37％收率)。MS ESI m/z C16H23NO4Na[M+Na]+316.16，实测值316.13。

实施例81.化合物428的合成

将4-((((苄氧基)羰基)氨基)丁酸叔丁酯(560mg，1.91mmol)溶于甲醇(50mL)中，并与Pd/C(10wt％，100mg)混合，催化加氢(1 atm)在室温下反应3小时。滤出催化剂，并在真空下除去所有挥发物，得到化合物428(272mg，90％收率)。MS ESI m/z C8H18NO2[M+H]+计算值 160.13，实测值160.13。

实施例82.化合物430的合成

将4-氨基丁酸叔丁酯(477mg，3mmol)和2，3-二溴丁二酸(414mg， 1.5mmol)溶于DCM(35mL)中，加入DIPEA(1.16g，9mmol)和EDC (0.86g，4.5mmol)。将所得溶液在室温搅拌过夜，然后用盐水洗涤，经 Na2SO干燥。通过柱谱(纯DCM至10％甲醇/二氯甲烷)进行过滤，浓缩和纯化，得到化合物430(160mg，22％收率)。MS ESI m/z C20H34BrN2O6 [M+H]+计算值477.15，实测值477.16。

实施例83.化合物431的合成

将化合物430(80mg，0.168mmol)溶解于DCM(5mL)中，并在38℃下与甲酸(8mL)反应过夜。真空除去所有挥发物，得到化合物431(61mg，99％收率)。MS ESI m/z C12H18BrN2O6[M+H]+计算值365.03，实测值365.05。

实施例84.化合物432的合成

向NHS(60mg，0.504mmol)和EDCI(97mg，0.504mmol)加入化合物 431(61mg，0.168mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液。在室温搅拌过夜，将反应混合物浓缩并通过柱谱纯化(0至10％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物 432(72mg，77％收率)。MS ESI m/z C20H24BrN4O10[M+H]+计算值559.06，实测值559.78.

实施例85.化合物433的合成

将NaH2PO4(0.1M的水溶液，1mL)加入化合物432(36mg，0.065 mmol)和化合物110(25mg，0.063mmol)的EtOH(5mL)溶液中。在室温下搅拌过夜，真空除去所有挥发物，并将残余物通过柱谱纯化(0至10％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物433(19.7mg，41％收率)。MSESI m/z计算值 741.35([M+H]+)。

实施例86.化合物435的合成

将化合物433(18mg，0.024mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)中，并在室温与用TFA(2mL)反应2小时。真空除去所有挥发物，得到化合物435 (14mg，98％收率)，直接用于下一步。MSESI m/z 585.22([M+H]+)。

实施例87.化合物437的合成

将化合物435(14mg，0.0239mmol)和五氟苯基酯33a(18mg， 0.0255mmol)溶解在DMA(5mL)中。向混合物中加入DIPEA(10mg， 0.077mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜，浓缩并通过制备型HPLC (C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，得到化合物437(12.8mg，48％收率)。 MS ESI m/z 1105.50([M+H]+)。

实施例88.化合物441的合成

向2，2’-(乙烷-1，2-二基双(氧基))二乙醇(55.0mL，410.75mmol，3.0eq.)的无水四氢呋喃(200mL)溶液中加入钠(0.1g)。搅拌混合物直至 Na消失，然后滴加丙烯酸叔丁酯(20.0mL，137.79mmol，1.0eq.)。将混合物搅拌过夜，然后在0℃下通过盐酸溶液(20.0mL，1N)淬灭。通过旋转蒸发除去四氢呋喃，加入盐水(300mL)，并将所得混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。有机层用盐水(3×300mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到无油状物(30.20g，79.0％收率)，其无需进一步纯化即可使用。MS ESI m/z：计算值C13H27O6[M+H]+278.1729，实测值278.1730。

实施例89.化合物442的合成

在0℃下，向3-(2-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(30.20g，108.5mmol，1.0eq.)和TsCl(41.37g，217.0mmol，2.0 eq.)的无水二氯甲烷(220mL)溶液中加入三乙胺(30.0mL，217.0mmol，2.0 eq.)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后用水(3×300mL)和盐水(300mL) 洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱谱法纯化(3：1正己烷/ 乙酸乙酯)得到无油状物(39.4g，84.0％产率)。MS ESI m/zC20H33O8S[M +H]+：计算值433.1818，实测值433.2838。

实施例90.化合物443的合成

向3-(2-(2-(2-(2-(甲苯磺酰基氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)叔丁基丙酸酯(39.4g，91.1mmol，1.0eq.)的无水DMF(100mL)溶液中加入叠氮化钠(20.67g，316.6mmol，3.5eq.)。将混合物在室温搅拌过夜。加入水 (500mL)，并用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。用水(3×900mL)和盐水(900 mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱谱法纯化(5：1正己烷/乙酸乙酯)，得到浅黄油状物(23.8g，85.53％的产率)。MS ESIm/z C13H25O3N5Na[M+Na]+：计算值326.2，实测值326.2。

实施例91.化合物444的合成

将Raney-镍(7.5g，悬浮于水中)用水(三次)和异丙醇(三次)洗涤，并与3-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(5.0g，16.5mmol)的异丙醇溶液混合。将混合物在H2气球下于室温搅拌。保持16小时，然后在硅藻土垫上过滤，用异丙醇洗涤。浓缩滤液，并通过柱谱法纯化 (5-25％甲醇/二氯甲烷)，得到浅黄油状物(2.60g，57％产率)。MS ESI m/z C13H28NO5[M+H]+：计算值279.19；实测值279.19。

实施例92.化合物445的合成

将乙炔二羧酸(0.35g，3.09mmol，1.0eq.)溶于NMP(10mL)中并冷却至0℃，加入化合物444(2.06g，7.43mmol，2.4eq.)，然后分批加入 DMTMM(2.39g，8.65mmol，2.8eq.)将反应在0℃下搅拌6小时，然后用乙酸乙酯稀释，并用水和盐水洗涤。将有机溶液用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂浓缩，打浆。滤出固体并将滤液浓缩，并通过柱谱法纯化(80-90％乙酸乙酯/ 石油醚)，得到浅黄油状物(2.26g，＞100％收率)，其无需进一步纯化即可使用。MSESI m/z C30H53N2O12[M+H]+计算值633.35；实测值633.30。

实施例93.化合物446的合成

将化合物445(2.26g)溶于二氯甲烷(15mL)中并冷却至0℃，然后与 TFA(15mL)反应。将反应温热至室温并搅拌45分钟，然后在旋转蒸发仪上除去溶剂和残留的TFA。通过柱谱纯化(0-15％甲醇/二氯甲烷)粗产物，得到浅黄油状物(1.39g，两步收率86％)。MSESI m/z C22H37N2O12[M+H]+计算值521.23；实测值521.24。

实施例94.化合物480的合成

将化合物110(68mg，0.17mmol)，化合物124(94.5mg，0.52mmol)和 HATU(162mg，0.425mmol)溶解于二氯甲烷(50mL)中。然后加入TEA (73μL，0.52mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。然后减压除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱谱纯化，得到标题产物480(98mg，80％收率)。ESI m/z C37H49N4O11[M+H]+：计算值725.33，实测值725.34。

实施例95.化合物481的合成

在室温下，将化合物480(98mg，0.135mmol)溶于二氯甲烷(1.0mL)与 TFA(1.0mL)反应2小时，然后浓缩并重新溶解于DMA(1mL)中，加入五氟苯基酯41a(44mg，0.06mmol)和DIPEA(45.8μL，0.27mmol)。将反应搅拌过夜，然后浓缩。残余物通过制备型HPLC用MeCN/H2O梯度纯化，得到标题产物481(37mg，55％收率)。ESI m/z：C53H73N8O14S[M+H]+计算值1077.49，实测值1077.50。

实施例96.化合物484的合成

在0℃下，向(S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸(13.2g，62.8mmol)的甲醇(120mL)溶液中加入亚硫酰氯(9mL，125.6mmol)。将反应混合物加热回流并搅拌1小时，然后在真空下浓缩并悬浮在乙酸乙酯(50mL)中。然后将混合物过滤，得到标题化合物，为白固体(14.5g，91％收率)。ESI m/z C10H13N2O4[M+H]+：计算值225.08，实测值225.08。

实施例97.化合物485的合成

向化合物484(9.5g，36.4mmol)的THF(200mL)溶液中加入三乙胺 (12.6mL，91.1mmol)。将混合物搅拌30分钟后，加入二碳酸二叔丁酯 (12.5mL，54.7mmol)，并将反应混合物搅拌1小时，然后用乙酸乙酯 (200mL)稀释，用1N HCl，水(30mL)洗涤，用硫酸钠干燥，真空下过滤并浓缩，得到标题化合物，为白固体(11.4g，97％收率)。ESI m/z：C15H21N2O6[M+H]+计算值325.13，实测值325.13。

实施例98.化合物486的合成

在-78℃下，向化合物485(14g，43.2mmol)的无水二氯甲烷(150mL)溶液中加入DIBAL-H(108mL，108mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌30分钟，然后倒入冰水(200mL)中，用乙酸乙酯(3×80mL)萃取。合并的有机相用1N HCl(2×50mL)，水(50mL)洗涤，用硫酸钠干燥，真空下过滤，浓缩，并通过硅胶柱谱纯化，得到标题化合物(8.6g，68％收率)。ESI m/z： C14H19N2O5[M+H]+计算值295.12，实测值295.12。

实施例99.化合物487的合成

在0℃下，向化合物106(8.1g，20.8mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入化合物486(5.2g，17.8mmol)。将反应混合物加热至室温。搅拌30分钟。然后真空浓缩并通过硅胶柱谱纯化，得到标题化合物，为黄固体 (5.9g，82％收率)。ESI m/z：C21H31N2O6[M+H]+计算值406.21，实测值 406.21。

实施例100.化合物488的合成

在氢化瓶中，向化合物487(4g，9.85mmol)的MeOH(40mL)溶液中加入Pd/C(0.4g，10wt％)。将混合物在1atm H2下搅拌过夜，通过硅藻土(助滤剂)过滤，并将滤液浓缩，得到化合物488(3.6g，收率100％)。ESI m/z：C21H35N2O4[M+H]+：计算值379.25，实测值379.25。

实施例101.化合物489的合成

在0℃下，向化合物488(3.6g，9.52mmol)和三乙胺(1.3mL， 9.52mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入4-硝基苯磺酰氯(2.1g， 9.52mmol)。将反应混合物加热至室温。并搅拌1小时，然后用二氯甲烷 (50mL)稀释，用1N HCl(20mL)，水(20mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩，然后通过硅胶柱谱纯化，得到标题化合物为黄固体(4g， 75％收率)。ESIm/z C27H38N3O8S[M+H]+：计算值564.23，实测值564.23。

实施例102.化合物490的合成

向化合物489(3.6g，6.39mmol)的乙腈(40mL)溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2.29mL，19.1mmol)。将反应混合物加热至45℃并搅拌6小时。然后将反应真空浓缩，并通过硅胶柱谱纯化，得到标题化合物(3g，79％收率)。 ESI m/z C27H37N4O10S[M+H]+：计算值609.22，实测值609.22。

实施例103.化合物491的合成

向化合物490(3.0g，4.92mmol)的乙腈/DMSO(30mL/1mL)溶液中加入4-甲氧基苯硫酚(2.76g，19.7mmol)和碳酸钾(2.7g，19.7mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后用乙酸乙酯(100mL)稀释，用水(20mL)，盐水(20mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，并通过硅胶柱谱纯化，得到标题化合物(1.7g，85％收率)。ESI m/z C21H34N3O6[M+H]+：424.24，实测值424.24。

实施例104.化合物492的合成

在氢化瓶中，向化合物491(100mg，0.236mmol)的MeOH(4mL)溶液中加入Pd/C(10mg，10wt％)。将混合物在1atm H2下搅拌过夜，通过硅藻土(助滤剂)过滤，并将滤液浓缩，得到标题化合物(92.9mg，100％收率)。ESI m/z：C21H36N3O4[M+H]+计算值394.26，实测值394.26。

实施例105.化合物493的合成

将化合物492(66mg，0.17mmol)，化合物124(94.5mg，0.52mmol)和 HATU(162mg，0.425mmol)溶解在二氯甲烷(50mL)中，然后加入TEA (73μL，0.52mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，减压除去溶剂，残余物通过硅胶柱谱纯化，得到标题产物493(98mg，80％收率)。ESI m/z C37H50N5O10[M+H]+：计算值724.35，实测值724.35。

实施例106.化合物494的合成

在室温下，将化合物493(98mg，0.135mmol)的二氯甲烷(1.0mL)与 TFA(1.0mL)反应2小时，然后浓缩，得到化合物494，其无需进一步纯化即可用于下一步。

实施例107.化合物495的合成

向化合物494(76.9mg，0.135mmol)的DMA(1mL)溶液中加入五氟苯基酯41a(44mg，0.06mmol)和DIPEA(45.8μL，0.27mmol)。将反应搅拌过夜，然后浓缩，并将残余物通过制备型HPLC用乙腈/水梯度纯化，得到标题产物495(37mg，55％收率)。ESI m/z C53H74N9O13S[M+H]+：计算值1076.50，实测值1076.50。

实施例108.化合物509的合成

在0℃下，向马来酰亚胺(6.35g，65.4mmol，1.0eq.)的乙酸乙酯(120 mL)溶液中加入N-甲基吗啉(8.6mL，78.5mmol，1.2eq.)和(6.0 mL，78.5mmol，1.2eq.)。将反应在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌1 小时，滤出固体，并将滤液浓缩。将残余物溶于二氯甲烷中，并通过硅胶塞过滤，并用二氯甲烷洗脱以除去颜。将该组分浓缩，所得的固体用10％乙酸乙酯/石油醚打浆，得到白固体(9.00g，89％收率)。

实施例109.化合物510的合成

将化合物401(8.16g，35.0mmol，1.0eq.)和饱和NaHCO3(40mL)的混合物冷却至0℃，然后然后分批加入化合物509(5.43g，35.0mmol，1.0eq.)。在 0℃下搅拌1小时，将反应温热至室温并搅拌1小时，将反应物用二氯甲烷 (3×100mL)萃取，将有机萃取液进行纯化，用Na2SO4干燥，浓缩并在通过硅胶柱谱纯化，得到白固体(6.76g，62％收率)。MS ESI m/z C15H23NO6 [M+H]+计算值314.15，实测值314.15。

实施例110.化合物511的合成

将化合物510(1.85g，5.9mmol)溶解于二氯甲烷(20mL)，加入TFA (7mL)，在室温下反应16h，然后浓缩，并通过硅胶柱谱纯化(11：1二氯甲烷/甲醇)得到白泡沫(1.47g，97％收率)。MS ESI m/z C11H15NO6 [M+H]+计算值258.09，实测值258.09。

实施例111.化合物519的合成

将N-Boc-乙二胺(5.6mL，35.4mmol，1.1eq.)和饱和NaHCO3(60mL) 的混合物冷却至0℃，分批加入化合物509(5.00g，32.2mmol，1.0eq.)。在 0℃搅拌30分钟，将反应温热至室温，搅拌1小时，过滤收集固体，用冷水洗涤，然后将其溶于乙酸乙酯中，用纯净水洗涤，之后用硫酸钠干燥，浓缩得到白固体(6.69g，87％收率)。

实施例112.化合物520的合成

在高压管中将化合物519(6.00g，25.0mmol)，呋喃(18.0mL)的甲苯溶液(120mL)加热回流并搅拌16小时。无溶液在反应过程中变为黄。然后将混合物冷却至室温并浓缩，将所得白固体用乙醚打浆，得到化合物520 (6.5g，84％收率)。

实施例113.化合物521的合成

将化合物520(9.93g，32.2mmol)的溶解于二噁烷(15mL)中，并在室温下与浓HCl(15mL)反应3小时，将反应浓缩，并过滤收集得到的固体，用乙酸乙酯洗涤滤饼。将固体在烘箱(50℃)中干燥过夜，得到化合物521 (6.94g，88％收率)。

实施例114.化合物522的合成

在-10℃下，向化合物521(0.85g，3.47mmol)的THF(10mL)溶液中加入POCl3(162μL，1.73mmol)，之后加入TEA(966μL，6.95mmol)。将反应在-10℃下搅拌三小时，然后将溶液用二氯甲烷(20mL)稀释，并在硅藻土上过滤，将过滤物浓缩，得到化合物522，将其直接用于下一步。ESI m/z C20H23ClN4O7P[M+H]+：计算值497.09，实测值497.09.

实施例115.化合物523的合成

在0℃下，将化合物522(0.50g，1.0mmol)和DIPEA(0.4mL，2.4mmol) 溶解于二氯甲烷(5.0mL)中，然后加入化合物401(0.23g，1.0mmol)。在 0℃下搅拌2.5小时，然后浓缩并通过硅胶柱谱纯化，得到标题产物523 (0.30g，43％)。ESI m/z C31H45N5O11P[M+H]+：计算值694.28，实测值 694.28。

实施例116.化合物524的合成

将化合物523(0.30g，0.5mmol)溶解在二氯甲烷(3mL)中，与TFA (3mL)在室温下反应2小时，然后浓缩以得到化合物524，其无需进一步纯化即可用于下一步。

实施例117.化合物525的合成

将化合物524(40mg，0.063mmol)，化合物110(40mg，0.10mmol)， HATU(24mg，0.063mmol)溶解在二氯甲烷(5mL)中，然后加入TEA (27.8μL，0.2mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后减压除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱谱纯化，得到标题产物525(53.4mg，84％收率)。ESI m/z C48H69N7O15P[M+H]+：计算值1014.45，实测值1014.45。

实施例118.化合物526的合成

将化合物525(53.4mg，0.053mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)中，并在室温下与TFA(2mL)反应1小时，然后浓缩得到化合物526，无需进一步纯化即可用于下一步。

实施例119.化合物527的合成

向化合物526(45.0mg，0.053mmol)的DMA(1mL)溶液中加入五氟苯基酯41a(37.0mg，0.053mmol)和DIPEA(17L，0.1mmol)。将反应搅拌过夜并浓缩。残留物通过制备型HPLC纯化，用MeCN/H2O梯度洗脱，得到标题产物527(26.2mg，36％收率)。ESI m/zC64H93N11O18PS[M+H]+：计算值 1366.61，实测值1366.61。

实施例120.化合物528的合成

将化合物527(8.0mg，0.0058mmol)溶解于甲苯(5.0mL)中，加热回流过夜，然后浓缩并通过制备型HPLC纯化，用乙腈/水梯度洗脱，得到标题产物 528(6.4mg，90％收率)。ESIm/z C56H85N11O16PS[M+H]+：计算值1230.56，实测值1230.56。

实施例121.化合物529的合成

向3-(2-(2-(2-(二苄氨基氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(5.00 g，12.1mmol)的10mL二氯甲烷溶液中加入5mL TFA。将反应混合物在室温下搅拌一小时之后浓缩。将粗产物溶于二氯甲烷(50mL)中，之后加入NHS (4.25g，37mmol)和EDCI(7.10g，37mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩并通过硅胶柱谱纯化，用二氯甲烷/甲醇梯度纯化，得到标题化合物529(5.00g，91％)。ESI m/z C25H31N2O6[M+H]+：计算值455.21，实测值455.21。

实施例122.化合物530的合成

在室温下，向化合物110(1.00g，2.5mmol，1.0eq.)的EtOH(10mL) 溶液中加入化合物529(1.80g，3.9mmol，1.5eq.)和0.1M NaH2PO4(2 mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜之后浓缩。用水(100mL)将残余物稀释，然后用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，通过硅胶柱谱纯化，用硫酸钠干燥。用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到标题化合物530(0.93g，50％)。ESI m/z C42H60N3O8[M+H]+：计算值 734.43，实测值734.43。

实施例123.化合物531的合成

在氢化瓶中，向化合物530(0.93g，1.27mmol)的乙酸乙酯(20mL)溶液中加入Pd/C(0.093g，10wt％)。将混合物在1atm H2环境下振摇过夜，然后通过硅藻土(助滤剂)过滤，浓缩滤液，得到化合物531(0.57g，81％)，其无需进一步纯化即可用于下一步。ESI m/zC28H48N3O8[M+H]+：计算值554.34，实测值554.34。

实施例124.化合物537的合成

将HATU(39.9g，105mmol)加入至4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酸 (26.1g，110mmol)的DMF(300mL)溶液中。在室温下搅拌30分钟，将混合物加入到化合物110(39.4g，100mmol)和TEA(20.2g，200mmol)的DMF (300mL)溶液中。将混合物在室温下搅拌2小时。之后加入水，用乙酸乙酯萃取，之后有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥。通过柱谱纯化(20％至 70％EA/PE)，得到标题产物，为白固体(45g，73％收率)。ESI m/z C33H48N3O8[M+H]+：计算值614.34，实测值614.15。

实施例125.化合物538的合成

将化合物537(100g，163mmol)溶于甲醇(500mL)中，并在室温下用Pd /C催化加氢(10wt％，10g)过夜。滤出催化剂，并将滤液减压浓缩，得到化合物538(75.8g，97％收率)，为棕泡沫状固体。1H NMR(400MHz， CDCl3)δ7.11(s，1H)，6.83(d，J＝10.3Hz，2H)，5.04–4.52(m， 6H)，3.90–3.56(m，1H)，2.81(d，J＝5.3Hz，2H)，2.63(dd，J＝12.5，6.1Hz，2H)，2.54-2.26(dd，J＝14.0，7.6Hz，4H)，1.94-1.64(m， 3H)，1.44–1.36(m，18H)，1.08(d，J＝6.9Hz，3H).ESI m/z C25H42N3O6[M+H]+：计算值480.30，实测值480.59。

实施例126.化合物539的合成

向化合物537(1.00g，1.63mmol)的1mL二氯甲烷中加入2mL TFA，将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩。所得粗产物539无需进一步纯化即可用于下一步。ESI m/zC24H32N3O6[M+H]+：计算值458.22，实测值 458.22。

实施例127.化合物540的合成

向化合物539(0.42g，0.92mmol)的DMF(3mL)溶液中加入五氟苯基酯 41a(0.63g，0.91mmol)和DIPEA(0.46mL，2.73mmol)。将反应物在室温搅拌过夜，然后浓缩，并过硅胶柱谱纯化，用二氯甲烷/甲醇梯度纯化，得到标题化合物540(0.67g，75％收率)，为黄油状物。ESI m/z C49H72N7O11S [M+H]+：计算值966.49，实测值966.49.

实施例128.化合物541的合成

在氢化瓶中，化合物540(0.40g，0.41mmol)的MeOH(15mL)溶液中加入Pd/C(0.02g，10wt％)。然后加入一滴1N HCl将pH调节至约4。将混合物在1atm H2下振摇过夜，然后通过硅藻土(助滤剂)过滤，浓缩滤液，得到化合物541，将其不经进一步纯化用于下一步。进一步纯化。ESI m/z C41H66N7O9S[M+H]+：计算值832.46，实测值832.46.

实施例129.化合物587的合成

将化合物110(0.30g，0.76mmol)，化合物Z-L-Ala-OH(0.17g，0.76 mmol)和HATU(0.29g，0.76mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，然后加入 TEA(110μL，0.8mmol))。将反应混合物在室温搅拌过夜。然后减压除去溶剂，残余物通过硅胶柱谱纯化，得到标题产物587(0.43g，95％收率)。 ESI m/z C32H46N3O8[M+H]+：计算值600.32，实测值600.32。

实施例130.化合物627的合成

在室温下，向H-Lys(Boc)-OH(1.00g，3.8mmol，1.0eq.)的EtOH(16 mL)溶液中加入化合物125(1.00g，5.6mmol，1.5eq.)。之后加入0.1M NaH2PO4(3mL)，将反应混合物在室温搅拌过夜。将反应在真空下浓缩，并将残余物通过硅胶柱谱纯化，用二氯甲烷/甲醇的梯度洗脱，得到标题化合物 627(1.62g，理论收率)。ESI m/z C19H30N3O7[M+H]+：计算值412.20，实测值412.20。

实施例131.化合物628的合成

向羧酸627(0.24g，0.58mmol)的乙酸乙酯(10mL)溶液中加入五氟苯酚 (0.21g，1.17mmol)和DCC(0.24g，1.17mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后过滤，用乙酸乙酯洗涤滤饼，并将滤液浓缩。将所得的五氟苯基酯 (32mg，0.056mmol)溶解在1mL DMF中，向其中加入化合物531(50mg， 0.056mmol)和i-Pr2EtN(29μL，0.168mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时并浓缩。将残余物通过HPLC用MeCN/H2O梯度洗脱，得到标题化合物628 (3mg，4％收率)。ESI m/z C63H99N10O17S[M+H]+：计算值1299.68，实测值 1299.68。

实施例132.化合物629的合成

向化合物628(3mg，0.002mmol)的0.5mL二氯甲烷溶液中加入1mL TFA，将反应混合物在室温搅拌1小时，然后浓缩。粗产物通过HPLC用 MeCN/H2O梯度洗脱，得到标题化合物629(1.43mg，52％收率)。ESI m/z C58H91N10O15S[M+H]+：计算值1199.63，实测值1199.62。

实施例133.化合物632的合成

将化合物627的五氟苯基酯(0.11g，0.19mmol)溶解于1mL DMF中，加入化合物541(0.21g，0.25mmol)和i-Pr2EtN(86μL，0.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时并浓缩。残余物通过制备型HPLC用MeCN/H2O梯度洗脱，得到标题产物632(20mg，9％)。ESI m/zC60H93N10O15S[M+H]+：计算值1225.65，实测值1225.66。

实施例134.化合物633的合成

向化合物632(20mg，0.016mmol)的1mL二氯甲烷溶液中加入2mL TFA。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩，并将粗产物通过制备型 HPLC用MeCN/H2O梯度纯化，得到标题化合物633(8.9mg，18％收率)。 ESI m/z C55H85N10O13S[M+H]+：计算值1125.59，实测值1125.59。

实施例135.化合物636的合成

在室温下，向H-Dap(Boc)-OH(1.00g，4.9mmol，1.0eq.)的EtOH(30 mL)中的溶液中加入化合物125(2.00g，7.3mmol，1.5eq.)。之后加入0.1M NaH2PO4(6mL)，并将反应混合物在室温搅拌过夜。真空除去溶剂，并将残余物通过硅胶柱谱用二氯甲烷/甲醇梯度纯化，得到标题化合物636(1.41g， 78％)。ESI m/z C16H24N3O7[M+H]+：计算值370.15，实测值370.15。

实施例136.化合物637的合成

向化合物636(1.41g，3.8mmol)的2mL二氯甲烷中的溶液中加入5mL TFA。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后浓缩。粗产物637无需进一步纯化即可用于下一步。ESI m/zC11H16N3O5[M+H]+：计算值270.10，实测值 270.10。

实施例137.化合物638的合成

在室温下，向以上得到的化合物637的EtOH(20mL)溶液中加入化合物 125(1.90g，6.9mmol，1.5eq.)。然后加入0.1M NaH2PO4(4mL)，并将反应混合物在室温搅拌过夜。真空除去溶剂后，然后将残余物通过HPLC用H2O/ MeCN梯度纯化，得到标题化合物638(0.45g，22％收率)。ESI m/z C19H23N4O8[M+H]+：计算值435.14，实测值435.14。

实施例138.化合物639的合成

向化合物638(0.15g，0.34mmol)，化合物538(0.17g，0.34mmol)和 HATU(0.16g，0.41mmol)的DMF(2mL)溶液中加入TEA(95μL， 0.68mmol)。在室温搅拌后在1小时内，将反应物减压浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化，用MeCN/H2O梯度洗脱，得到标题化合物639(34mg，收率 11％)。ESI m/z C44H62N7O13[M+H]+：计算值896.43，实测值896.42。

实施例139.化合物640的合成

向化合物639(34mg，0.04mmol)的0.5mL二氯甲烷溶液中加入1mL TFA。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后浓缩，得到标题化合物640，其无需进一步纯化即可用于下一步。ESI m/z C35H46N7O11[M+H]+：计算值740.30，实测值740.32。

实施例140.化合物641的合成

向化合物640的DMA(2mL)溶液中加入五氟苯基酯41a(28mg， 0.04mmol)，然后加入DIPEA(21μL，0.12mmol)。将反应搅拌过夜，然后浓缩，并通过制备型HPLC纯化，用MeCN/H2O梯度洗脱，得到标题化合物641 (14.4mg，29％)。ESI m/z C60H86N11O16S[M+H]+：计算值1248.59，实测值 1248.60。

实施例141.化合物644的合成

在0℃下，向化合物132(0.300g，0.329mmol，1.0eq.)和(2-氨基乙基) 氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(0.063g，0.395mmol，1.2eq.)的无水DCM中加入 EDCI(0.189g，0.988mmol，3.0eq.)。搅拌10分钟后，将反应温热至室温并搅拌过夜。将反应物用二氯甲烷稀释并用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷/甲醇)，得到为黄泡沫状固体化合物 644(0.132g，54％收率)。ESI m/z C52H80N9O12S[M+H]+：计算值1054.6，实测值：1054.6。

实施例142.化合物645的合成

在室温下，向化合物644(0.132g，0.125mmol，1.0eq.)的二氯甲烷 (4.5mL)溶液中加入TFA(1.5mL)，并搅拌1小时。将反应物用无水甲苯稀释并浓缩，重复该操作三次，得到黄油状物，将其通过制备型HPLC纯化 (C18柱，流动相A：水，流动相B：乙腈，由10％的B至80％B，60min)。合并组分并冻干，得到化合物645(111mg，93％收率)。ESI m/z C47H72N9O10S[M+H]+：计算值954.5，实测值：954.5。

实施例143.化合物648的合成

在0℃下，向化合物645(0.050g，0.0549mmol，1.0eq.)和叔丁基(2-(2- (2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(0.024g， 0.0824mmol，1.5)的无水二氯甲烷(10mL)溶液中加入EDCI(0.032g， 0.1647mmol，3.0eq.)。搅拌10分钟后，将反应温热至室温并搅拌过夜。然后将混合物用二氯甲烷稀释并用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷/甲醇)，得到标题化合物，为黄泡沫状固体(0.030g，46％收率)。ESI m/z C58H92N9O15S[M+H]+：计算值1186.6，实测值：1186.6。

实施例144.化合物649的合成

在室温下，向化合物648(0.030g，0.0253mmol，1.0eq.)的二氯甲烷 (3.0mL)溶液中加入TFA(1.0mL)。将反应搅拌1小时，然后用无水甲苯稀释并浓缩，重复此操作3次，得到黄油状物，在制备型HPLC上纯化(C18柱，流动相A：水，流动相B：乙腈，10％的B到80％的B，60min)。合并组分并冻干，得到化合物649(11.7mg，43％收率)。ESI m/z C53H84N9O13S[M+H]+：计算值1086.6，实测值：1086.6。

实施例145.化合物652的合成

在0℃下，在3小时内向N-(2-氨基乙基)乙烷-1，2-二胺(28.7g，275 mmol，10.0eq.)和DMAP(0.034g，0.000275mmol，0.01eq.)的无水二氯甲烷 (350mL)中加入Boc2O(6.0g，0.0275mmol，1.0eq.)的无水二氯甲烷 (100mL)。然后将反应加热至室温并搅拌过夜，浓缩并通过硅胶柱谱纯化 (二氯甲烷/甲醇)，得到标题化合物，为黄油状物(4.5g，80％收率)。ESI m/z C9H22N3O2[M+H]+：计算值204.2，实测值：204.2。

实施例146.化合物653的合成

在0℃下，向化合物645(0.060g，0.0658mmol，1.0eq.)和叔丁基(2- (((2-氨基乙基)氨基)乙基)氨基甲酸酯(0.016g，0.0790mmol，1.2eq.) 的无水二氯甲烷(6mL)中加入EDCI(0.038g，0.1974mmol，3.0eq.)。搅拌 10分钟后，将反应温热至室温，搅拌过夜，将混合物浓缩并在制备型HPLC上纯化(C18柱，流动相A：水，流动相B：乙腈，从10％的B至80％的B，60min)。合并组分并冻干，得到标题化合物653(48mg，66％收率)。ESI m/z C54H85N10O12S[M+H]+：计算值1097.6，实测值：1097.6。

实施例147.化合物654的合成

在室温下，向化合物653(0.048g，0.0437mmol，1.0eq.)的二氯甲烷 (3.0mL)溶液中加入TFA(1.0mL)搅拌1小时。将反应混合物用无水甲苯稀释并浓缩，重复此操作3次，得到黄油状物，通过制备型HPLC纯化(C18谱柱，流动相A：水，流动相B：乙腈，10％的B到80％的B，60min)。合并组分并冻干，得到标题化合物654(111mg，93％收率)。ESI m/zC49H77N10O10S[M+H]+：计算值997.5，实测值：997.5。

实施例148.化合物658的合成

在0℃，向化合物645(0.400g，0.439mmol，1.0eq.)和H-Lys(Boc)- OtBu·HCl(0.135g，0.528mmol，1.2eq.)的无水DCM(40ml)中加入EDCI (0.189g，1.317mmol，3.0eq.)。搅拌10分钟后，将反应温热至室温搅拌过夜，将混合物用二氯甲烷稀释并用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷/甲醇)，得到为黄油的化合物658(0.43g， 82％收率)。ESI m/z C60H94N9O14S[M+H]+：计算值1196.7，实测值： 1196.7。

实施例149.化合物559的合成

在室温下向化合物658(0.230g，0.192mmol，1.0eq.)的二氯甲烷 (6.0mL)溶液中。加入TFA(2.0mL)，将反应搅拌3h，然后用甲苯稀释并浓缩，重复此操作3次，得到黄油状物，将其通过制备型HPLC纯化(C18谱柱，流动相A：水，流动相B：乙腈，在60分钟内从10％的B到80％的 B)。合并级分并冻干，得到标题化合物(153mg，76％收率)。ESI m/z C51H78N9O12S[M+H]+：1040.5，实测值：1040.5。

实施例150.化合物662的合成

向0℃，向化合物658(0.200g，0.167mmol，1.0eq.)和Boc-L-Lys (Boc)-OH(0.070g，0.200mmol，1.2eq.)的无水二氯甲烷(10mL)溶液加入HATU(0.095g，0.250mmol，1.5eq.)和TEA(46μL，0.334mmol， 2.0eq.)。将反应在0℃下搅拌10分钟，然后温热至室温并搅拌过夜，将混合物用二氯甲烷稀释并用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷/甲醇)，得到化合物662，为无油状物(0.270g，理论收率)。ESIm/z C76H122N11O19S[M+H]+：计算值1524.9，实测值：1524.9。

实施例151.化合物663的合成

在室温下，向化合物662(0.270g，0.177mmol，1.0eq.)的二氯甲烷 (6.0mL)溶液中加入TFA(2.0mL)并搅拌4小时。混合物用无水甲苯稀释并浓缩，重复此操作三次，得到黄油状物，将其在制备型HPLC(C18柱，流动相A：水，流动相B：乙腈，从10％的B 80％，60min)上纯化。合并组分并冻干，得到标题化合物(172mg，83％收率)。ESI m/z C57H90N11O13S [M+H]+：计算值1168.6，实测值：1168.6。

实施例152.化合物666的合成

在0℃下，在7小时内向乙烷-1，2-二胺(30.0g，0.5mol，10.0eq.)的无水二氯甲烷(500mL)中加入CbzCl(8.53g，0.050mol，1.0eq.)的无水二氯甲烷(250毫升)，然后将反应加热至室温搅拌过夜，将混合物用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，浓缩，得到白固体状的(2-氨基乙基)-氨基甲酸苄酯(7.0g，94％收率)。ESI m/z C10H14N2O2[M+H]+：计算值195.1，实测值：195.2。

实施例153.化合物667的合成

在0℃下，向化合物666(7.0g，35.8mmol，1.0eq.)和37％HCHO(aq) (14mL，0.1772mmol，5.0eq.)的MeOH(120mL)溶液中加入NaBH3CN(3.9 g，0.0620mol，1.6eq.)，然后加入HOAc(3mL)，将pH调节至7.0。将该混合物加热至室温搅拌过夜，然后浓缩。将残余物溶于二氯甲烷(200mL)，并用水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷/甲醇)，得到标题化合物，为浅黄油状物(6.4g，收率80％)。ESI m/： C12H18N2O2[M+H]+：计算值224.1，实测值：224.1。

实施例154.化合物668的合成

在氢化瓶中，将化合物667(3.0g，13.4mmol，1.0eq.)和Pd/C(0.3g， 10％Pd/C，50％wet)、HCl(3mL)和MeOH(100mL)混合，在100psi H2环境中振摇5小时。然后将混合物经硅藻土过滤，并将滤液浓缩，得到标题化合物，其为黄固体(2.1g，98％收率)。1H NMR(400MHz，D2O)δ3.33 (d，J＝4.6Hz，2H)，3.27(s，2H)，2.79(s，6H)。

实施例155.化合物669的合成

在0℃下，向化合物103(0.58g，1.58mmol，1.0eq.)和化合物668 (0.051g，3.15mmol，2.0eq.)的无水DMF(10mL)溶液中加入HATU (0.090g，2.37mmol，1.5eq.)和TEA(0.656mL，4.74mmol，3.0eq.)，搅拌 10分钟，将反应温热至室温搅拌90分钟，将混合物用水稀释并用乙酸乙酯 (3×100mL)萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，浓缩，得到标题化合物，为黄泡沫状固体(0.67g，97％收率)。ESI m/z C21H35N4O6[M+H]+：计算值439.2，实测值：439.2。

实施例156.化合物670的合成

将Pd/C(0.2g，10％Pd/C，50％wet)与化合物669(0.60g，13.7 mmol，1.0eq.)的乙酸乙酯(10mL)溶液混合。将混合物在100psi H2环境下振摇4小时。然后将混合物经硅藻土过滤并将滤液浓缩，得到标题化合物，为绿油状物(5.50g，98％收率)。ESI m/zC21H37N4O64[M+H]+：计算值 409.3，实测值：409.3。

实施例157.化合物671的合成

向化合物670(0.50g，1.22mmol，1.0eq.)的95％乙醇(10mL)和0.1M NaH2PO4(2mL)溶液中加入化合物125(0.683g，2.44mmol，2.0eq.)并将反应搅拌过夜，然后浓缩并通过硅胶柱谱纯化(二氯甲烷/甲醇)，得到标题化合物，为浅黄油状物(0.624g，89％收率)。ESI m/z C29H44N5O7[M+H]+：计算值574.3，实测值：574.3。

实施例158.化合物672的合成

在室温下，向化合物671(0.20g，0.349mmol，1.0eq.)的二氯甲烷 (6.0mL)溶液中加入TFA(2.0mL)，并将反应搅拌2小时，然后用无水甲苯稀释并浓缩，重复此操作3次，得到标题化合物，为黄油状物(165mg，理论收率)。ESI m/z C24H36N5O5[M+H]+：计算值474.3，实测值：474.3。

实施例159.化合物673的合成

在0℃下，向化合物672(0.165g，0.349mmol，1.0eq.)的无水DMF(2 mL)溶液中加入化合物41a(0.290g，1.047mmol，1.2eq.)的无水DMF(3 mL)溶液。将反应搅拌10分钟，然后温热至室温。搅拌1小时。将反应混合物浓缩并在制备型HPLC上纯化(C18柱，流动相A：水，流动相B：乙腈， 10％的B到80％的B，60min)。合并组分并冻干，得到标题化合物(58mg， 17％收率)，为浅黄泡沫状固体。ESI m/z C49H76N9O10S[M+H]+：计算值 982.5，实测值：982.5。

实施例160.化合物704的合成

将(S)-2-(((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸(33mg， 0.14mmol)，DCC(32mg，0.154mmol)和五氟苯酚(39mg，0.21mmol)溶解在乙酸乙酯(20mL)中，将反应在室温搅拌过夜。然后将反应浓缩至干，得到化合物(S)-五氟苯基2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)-3-甲基丁酸酯，将其溶解在2mL DMA中，并加入2-(3mL(1R，3R)-3-((2S，3S)- 2-氨基-N，3-二甲基戊酰胺)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸(52mg，0.14 mmol)的DMA(3mL)溶液和DIPEA(48.5μL，0.28mmol)。将反应在室温搅拌过夜，然后浓缩。将残留物用1mL乙腈稀释，并通过反相HPLC用乙腈/ 水梯度纯化，得到化合物704(40.2mg，收率49％)。ESI m/z：C28H49N4O7S [M+H]+：计算值585.32，实测值585.32。

实施例161.化合物705的合成

在0℃下，向化合物704(40mg，0.069mmol)的吡啶(8mL)溶液中加入乙酸酐(20.4mg，0.2mmol)，并将反应物升温至室温并搅拌过夜，然后浓缩。残余物通过柱谱(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物705(48.1mg， 100％收率)。ESI：m/z：C30H51N4O8S[M+H]+：计算值627.33，实测值 627.33。

实施例162.化合物708的合成

将化合物705(48.1mg，0.077mmol)，DCC(17.4mg，0.085mmol)和五氟苯酚(21.2mg，0.115mmol)溶于乙酸乙酯(10mL)中，并将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩至干得到化合物五氟苯基2-((6S，9S，12R， 14R)-9-((S)-仲丁基)-6，12-二异丙基-2，2，5，11-四甲基-4，7，10，16- 四氧杂-3，15-二氧杂-5，8，11-三氮杂十四烷基-14-基)噻唑-4-羧酸酯，将其溶于4mL DMA和加入化合物(4R)-4-氨基-2-甲基-5-苯基戊酸的三氟乙酸盐 (20.7mg，0.1mmol)的DMA(3mL)溶液和DIPEA(26.8μL， 0.154mmol)。将反应在室温搅拌过夜，然后浓缩。将残余物用1mL乙腈稀释，并通过反相HPLC纯化，用MeCN/H2O梯度洗脱，得到化合物708(33mg，收率84％)。ESI：m/z：C42H66N5O9S[M+H]+：计算值816.45，实测值816.45。

实施例163.化合物709的合成

将上一步的化合物708溶解在二氯甲烷(1mL)中，并在室温下与TFA (1mL)反应2小时。浓缩反应物，并将残余物溶于EtOH(20mL)。加入化合物125(30.8mg，0.11mmol)和0.1MNaH2PO4(4mL)，并在室温搅拌过夜，然后浓缩，残余物通过柱谱(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物 709(28.5mg，42％收率)。ESI m/z：C45H65N6O10S[M+H]+：计算值881.44，实测值881.44。

实施例164.化合物712的合成

在室温下，化合物708(63mg，0.077mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液与 TFA(1ml)反应2小时，然后浓缩，并将残余物溶于DMA(4mL)。加入化合物711(65.8mg，0.11mmol)和DIPEA(27μL，0.154mmol)，并将反应在室温下搅拌过夜，然后浓缩，并将残余物通过反相HPLC用MeCN/H2O梯度纯化，得到化合物712(14mg，16％收率)。ESI：m/z：C55H84N7O16S [M+H]+：计算值1130.56，实测值1130.57。

实施例165.17-(2，5-二氧杂-2-，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-14-氧杂-4，7， 10-三氧杂-13-氮杂十七烷-1-叔丁酯(化合物157a)的合成

将化合物444(27.92g，0.1mol)和化合物124(18.3g，0.1mol)溶解在二氯甲烷(300mL)中，向其中加入DIPEA(12.9g，0.1mol)和EDC(38.6g， 0.2mol)。将所得溶液在室温搅拌过夜，然后用盐水洗涤，经Na2SO4干燥。过滤，浓缩后通过柱谱(5％乙酸乙酯/二氯甲烷至20％乙酸乙酯/二氯甲烷) 纯化，得到化合物157a(38.03g，收率86％)。MS ESI m/zC21H35N2O8 [M+H]+计算值443.2394，实测值443.2412。

实施例166.17-(2，5-二氧杂-2-，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-14-氧杂-4，7， 10-三氧杂-13-氮杂十七烷-1-酸的合成(化合物158a)

向化合物157a(38.0g，85.9mmol)的150mL二氯甲烷中加入50mL TFA。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后用甲苯(50ml)稀释，真空浓缩，并通过柱谱纯化(10％甲醇/二氯甲烷至20％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物158a (27.53g，收率83％)。MS ESI m/zC17H27N2O8[M+H]+计算值：387.1768，实测值387.1792。

实施例167.2，5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯- 1-基)-14-氧代-4，7，10-三氧杂-13-氮杂十七烷-1-酯(化合物159a)的合成

向NHS(3.20g，27.82mmol)和EDCI(9.70g，50.4mmol)中加入化合物158a(10.10g，26.15mmol)的二氯甲烷(80mL)溶液中。在室温下搅拌过夜，将反应混合物浓缩并通过柱谱纯化(5至20％乙酸乙酯/二氯甲烷)，得到化合物159a(10.73g，85％收率)。MS ESI m/zC21H30N3O10[M+H]+计算值484.1942，实测值484.1978。

实施例168.(2S，5S)-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，5- 二甲基-4，7，20-三氧代-10，13，16-三氮杂-3，6，19-三氮杂二十三烷-1-酸 (化合物162a)的合成

在两小时内分四份，向化合物161((S)-Ala-(S)-Ala，5.01g，31.2 mmol)的乙醇(100ml)和pH 7.5缓冲液(0.1M NaH2PO4/Na2HPO4，100 ml)的混合物中加入化合物159a(15.08g，31.20mmol)。将混合物继续搅拌4 小时，真空浓缩，并通过柱谱纯化(10至20％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物162a(13.18g，80％收率)。MS ESI m/z C23H37N4O10[M+H]+计算值 529.2511，实测值529.2545。

实施例169.(2S，5S)-2，5-二氧吡咯烷-1-基23-(2，5-二氧代-2，5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-2，5-二甲基-4，7，20-三氧代-10，13，16-三氧杂-3，6，19-三氮杂二十三烷-1-酯(163a)的合成

向NHS(1.60g，13.91mmol)和EDCI(5.90g，30.7mmol)中加入化合物162a(6.50g，12.30mmol)的二氯甲烷(70mL)溶液。在室温下搅拌过夜，将反应混合物浓缩并通过柱谱纯化(5至20％乙酸乙酯/二氯甲烷)，得到化合物163a(6.61g，86％收率)。MS ESI m/zC27H40N5O12[M+H]+计算值 626.2672，实测值626.2698。

实施例170.(2S，4R)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(3-((2S，5S)- 23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，5-二甲基-4，7，20-三氧杂- 10，13，16-三氧杂-3，6，19-三氮杂二十三烷酰胺)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸 (164a)的合成

在2小时内分四份，向化合物121(3.57g，10.55mmol)的乙醇(70ml) 和pH 7.5缓冲液(0.1M NaH2PO4/Na2HPO4，60ml)中加入化合物163a (6.60g，10.55mmol)。加入之后，将混合物继续搅拌4小时，真空浓缩，并通过柱谱纯化(15至25％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物164a(7.25g，81％收率)。MS ESI m/z C40H61N6O14[M+H]+计算值849.4267，实测值849.4295。

实施例171.(2R，4S)-4-羧基-1-(3-((2S，5S)-23-(2，5-二氧代-2， 5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，5-二甲基-4，7，20-三氧代-10，13，16-三氧杂-3， 6，19-三氮杂二十三烷酰胺)-4-羟基苯基)戊-2-铵三氟乙酸盐(165a)的合成

在室温下，向化合物164a(0.20g，0.349mmol，1.0eq.)的二氯甲烷 (6.0mL)溶液中加入TFA(2.0mL)，将反应搅拌2小时，然后用无水甲苯稀释并浓缩，重复此操作3次，得到标题化合物，为黄油状物(165mg，理论收率)，无需进一步纯化直接用于下一步。ESI m/zC35H54N6O12[M+H]+：计算值 750.3795，实测值：750.3825。

实施例172.(2S，4R)-4-(2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9- 异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十一烷-11- 基)噻唑-4-甲酰胺)-5-(3-((2S，5S)-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯 -1-基)-2，5-二甲基-4，7，20-三氧杂-10，13，16-三氧杂-3，6，19-三氮杂二十三烷酰胺)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(166a)的合成

将化合物165a(45mg，0.0600mmol)和五氟苯基酯41a(45mg， 0.0650mmol)溶解在DMA(5mL)中。向混合物中加入DIPEA(20mg， 0.154mmol)。将得到的混合物在室温搅拌过夜，浓缩并通过制备型HPLC (C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，得到化合物166a(49.1mg，收率65％)。 ESI m/z C60H93N10O17S[M+H]+：计算值1256.6442，实测值：1256.6510。

实施例173.五氟苯基2-甲基-2-(吡咯烷-1-基)丙酸酯713的合成

将2-甲基-2-(吡咯烷-1-基)丙酸25(401mg，2.50mmol)，EDC(654 mg，3.40mmol)和五氟苯酚(480mg，2.60mmol)溶解在二氯甲烷(45mL) 中并在室温搅拌过夜，然后浓缩至干，得到化合物五氟苯基2-甲基-2-(吡咯烷- 1-基)丙酸酯713(662mg，82％收率)。MS ESI m/zC14H15F5NO2[M+H]+计算值324.1024，实测值324.1045。

实施例174.2-((5R，7R，10S)-10-((S)-仲丁基)-3，3-二乙基-7-异丙基-8，13-二甲基-9，12-二氧代-13-(吡咯烷-1-基)-4-氧杂-8，11-二氮杂-3-硅十四基-5-基)噻唑-4-羧酸乙酯714的合成

向五氟苯基酯713(650mg，2.01mmol)的EtOAc溶液(40ml)中加入化合物16(1.085g，2.01mmol)和干的Pd/C(10wt％，100mg)。将反应混合物在氢气环境(1atm)下搅拌24小时，然后通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤滤垫。浓缩合并的有机部分，并通过柱谱纯化，用0-5％甲醇的CH2Cl2溶液梯度洗脱，得到化合物714(1.10g，84％收率)。MS ESI m/zC33H61N4O5SSi [M+H]+计算值653.4133，实测值653.4148。

实施例175.乙基2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-N，3-二甲基-2-(2-甲基- 2-(吡咯烷基-1-基)丙酰胺)戊酰胺)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸酯， 715的合成

将化合物714(1.10g，1.68mmol)溶解于AcOH/水/THF(v/v/v 3∶1∶1，25mL)中，并在室温搅拌2天。反应浓缩后，加入甲苯并再次浓缩。重复该步骤两次，得到化合物715，将其直接用于下一步。MS ESI m/z C27H47N4O5S[M+H]+计算值539.3268，实测值539.3295.

实施例176.2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-N，3-二甲基-2-(2-甲基-2- (吡咯烷基-1-基)丙酰胺)戊酰胺)1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸716的合成

在0℃下，将LiOH(0.4N，5mL)的水溶液加入到化合物715(0.85g， 1.65mmol)的MeOH(20mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后浓缩。通过柱谱(纯CH2Cl2至80∶20∶1CH2Cl2/MeOH/NH4OH)得到化合物716(773mg，两步收率90％)，为无定形固体。MS ESI m/z C25H43N4O5S [M+H]+计算值511.2955，实测值511.2980。

实施例177.2-((1R，3R)-1-乙酰氧基-3-((2S，3S)-N，3-二甲基-2- (2-甲基-2-(吡咯烷基-1-基)丙酰胺))戊二胺)-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸 717的合成

将化合物716(765mg，1.50mmol)和DMAP(180mg，1.48mmol)的无水THF(30mL)和无水DMF(15mL)溶液冷却至0℃，向其中加入DIPEA (3.0mL，17.2mmol)和乙酸酐(1.0g，9.79mmol)，使反应混合物升温至室温，搅拌4小时，然后浓缩。通过柱谱(5-50％甲醇/二氯甲烷)纯化，得化合物717(785mg，95％产率)，为无定形固体。MS ESI m/z C27H45N4O6S[M+H]+计算值553.3061，实测值553.3095。.

实施例178.五氟苯基2-(((1R，3R)-1-乙酰氧基-3-((2S，3S)-N， 3-二甲基-2-(2-甲基-2-(吡咯烷-1-基))丙酰胺)戊酰胺)-4-甲基戊基)噻唑 -4-羧酸酯718的合成

在室温和N2下，向化合物717(775mg，1.40mmol)的无水二氯甲烷(10 mL)的溶液中加入EDC(805mg，4.19mmol)和五氟苯酚(276mg，1.50 mmol)。将该混合物在室温下搅拌4小时，然后用二氯甲烷(100mL)稀释，用水(2×200mL)和盐水(200mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱谱(50％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到白固体化合物718(815mg，81％产率)MS ESI m/z C33H44F5N4O6S[M+H]+：计算值719.2901，实测值： 719.2945。

实施例179.(2S，4R)-4-(2-(((1R，3R)-1-乙酰氧基-3-((2S， 3S)-N，3-二甲基-2-(2-甲基-2-(吡咯烷-1-基丙酰胺)戊酰胺)-4-甲基戊基) 噻唑-4-羧酰胺)-5-(3-((2S，5S)-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢)-1H-吡咯- 1-基)-2，5-二甲基-4，7，20-三氧代-10，13，16-三氧杂-3，6，19-三氮杂二十三烷酰胺)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸的合成

在化合物718(153mg，0.213mmol)和化合物165a(160mg，0.213mmol) 的7mL DMA的溶液中，加入DIPEA(100μL，0.575mmol)。将反应在室温搅拌过夜，然后浓缩。将残余物用1mL乙腈稀释，并通过反相HPLC纯化，并用乙腈/水梯度洗脱(10％MeCN至40％MeCN，45min，d2cmx L25cm，C-18 柱，8ml/min)，得到化合物719(166.1mg，61％产率)。ESI：m/z： C62H95N10O17S[M+H]+：计算值1282.6598，实测值1282.6630.

实施例180.(2S，4R)-4-(2-((1R，3R)-1-乙酰氧基-3-((2S，3S)- N，3-二甲基-2-((R)-1-甲基-2-羧酰胺)戊酰胺)-4-甲基戊基噻唑-4-羧酰胺)-5-(3-((2S，5S)-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基))- 2，5-二甲基-4，7，20-三氧杂-10，13，16-三氧杂-3，6，19-三氮二十三烷酰胺)-4-羟苯基)-2-甲基戊酸720的合成

将化合物33(30.2mg，0.056mmol)，EDC(25.0mg，0.130mmol)和五氟苯酚(11mg，0.060mmol)溶于二氯甲烷(4mL)中，在室温下将反应搅拌过夜，然后浓缩至干，得到化合物五氟苯基2-((1R，3R)-1-乙酰氧基-3- ((2S，3S)-N，3-二甲基-2-((R)-1-甲基-2-甲酰胺)戊二胺)-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸酯33a，之后加入化合物165a(160mg，0.213mmol)的DMA(3mL)溶液和DIPEA(26.8μL，0.154mmol)。将反应在室温搅拌过夜，然后浓缩。残留物用1mL乙腈稀释，并通过反相HPLC纯化，梯度为 MeCN/H2O(在45分钟内10％MeCN至40％MeCN，D2cm×L 25cm，C-18 柱，8ml/min)得到化合物720(133.1mg，48％产率)。ESI：m/z：C61H93N10O17S[M+H]+：1269.6442，实测值1282.6630。

实施例181.(2S，4R)-叔丁基4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(4-((2S， 5S)-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，5-二甲基-4，7，20-三氧代-10，13，16-三氧杂-3，6，19-三氮二十三烷酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸酯 721的合成

在2小时内分四份，向化合物488(310mg，0.82mmol)的乙醇(70ml) 和pH 7.5缓冲液(0.1M NaH2PO4/Na2HPO4，60ml)的混合物中加入化合物 163a(660mg，1.055mmol)，加入之后将混合物继续搅拌4小时，真空浓缩，并通过柱谱纯化(15至25％乙酸乙酯/二氯甲烷)，得到化合物714 (604.5mg，83％收率)。MS ESI m/z C44H69N6O13[M+H]+计算值889.4923，实测值889.4965。

实施例182.(2S，4R)-4-氨基-5-(4-((2S，5S)-23-(2，5-二氧代-2， 5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2，5-二甲基-4，7，20-三氧杂-10，13，16-三氧杂-3， 6，19-三氮杂二十三酰胺)苯基)-2-甲基戊酸三氟乙酸盐的合成。

在室温下，向化合物721(0.20g，0.225mmol，1.0eq)的二氯甲烷 (6.0mL)溶液中加入TFA(2.0mL)，将反应搅拌2h，然后用无水甲苯稀释并浓缩，重复此操作3次，得到标题化合物，为黄油状物(165mg，理论产率)，无需进一步纯化用于下一步。ESI m/z C35H53N6O11[M+H]+：计算值 732.3773，实测值：732.3795。

实施例183.(2S，4R)-4-(2-(((1R，3R)-1-乙酰氧基-3-((2S， 3S)-N，3-二甲基-2-((R)-1)-甲基-2-羧酰胺)戊酰胺)-4-甲基戊基) 噻唑-4-羧酰胺)-5-(4-((2S，5S)-23-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-2，5-二甲基-4，7，20-三氧杂-10，13，16-三氧杂-3，6，19-三氮杂二十三烷酰胺)苯基)-2-甲基戊酸(723，作为控制对照品)的合成

将化合物33(30.2mg，0.056mmol)，EDC(25.0mg，0.130mmol)和五氟苯酚(11mg，0.060mmol)溶解在二氯甲烷(4mL)中，并将反应在室温下搅拌过夜，然后浓缩至干，得到化合物五氟苯基2-(((1R，3R)-1-乙酰氧基 -3-((2S，3S)-N，3-二甲基-2-((R)-1-甲基-2-羧酰胺)戊酰胺)-4)- 甲基戊基)噻唑-4-羧酸酯，将其溶解在4mL DMA中，之后加入化合物722 (160mg，0.213mmol)的DMA(3mL)溶液和DIPEA(26.8μL，0.154 mmol)。将反应在室温搅拌过夜，然后浓缩。将残余物用1mL乙腈稀释，并通过反相HPLC纯化，并用乙腈/水梯度洗脱(10％MeCN至40％MeCN， 45min，D 2cm×L 25cm，C-18柱，8ml/min)得到化合物723(47.7mg， 68％产率)。ESI m/z：C61H93N10O16S[M+H]+：计算值1253.6492，实测值 1253.6540。

实施例184.化合物128、132、437、481、495、528、629、633、641、 645、649、654、659、663、673、709、712、166a、719、720和723的一般制备方法

向20.0mL的pH 6.0～8.0，10mg/ml Herceptin中加入7.0～20.0mL的100 mMNaH2PO4的PBS缓冲液，pH 6.5～8.5的缓冲液，TCEP(140-350μL，20 mM水溶液)以及化合物128、132、437、481、495、528、629、633、641、645、649、654、659、663、673、709、712、166a、719、720和723(140～280 μL，20mM的DMA溶液)，之后加入4-(叠氮甲基)苯甲酸(140～500μL，20mM，pH 7.5的PBS缓冲液)。将混合物在室温下孵育4～18h，然后加入 DHAA(1.35mL，50mM)。在室温下连续孵育过夜后，将混合物在G-25柱上纯化，用100mM NaH2PO4、50mM NaClpH 6.0～7.5缓冲液洗脱，得到 125～186.8mg的偶联物C-128，C-132，C-437，C-481，C-495，C-528，C- 629，C-633，C-641，C-644，C-645，C-649，C-654，C-659，C-663，C-673， C-709，C-712，C-166a，C-719，C-720和C-723(80％～93％产率)(在 134.5～158.2ml的NaH2PO4缓冲液中)。偶联物的药物/抗体比(DAR)通过 UPLC-QTOF质谱确定为3.4～3.9。SEC HPLC(TosohBioscience，Tskgel G3000SW，7.8mm ID×30cm，0.5ml/min，100min)分析表明单体含量为94～99％，SDS-PAGE显示为单条带。

实施例185.与T-DM1相比，偶联物C-128，C-132，C-437，C-481，C-495， C-528，C-629，C-633，C-641，C-644，C-645，C-649，C-654，C-659，C- 663，C-673，C-709，C-712，C-166a，C-719，C-720和C-723的体外细胞毒性评价：

用于细胞毒性测定的细胞系是人胃癌细胞系NCI-N87，细胞在含有10％FBS 的RPMI-1640中生长。测定时，将细胞(180μL，6000个细胞)加入到96孔板中的每个孔中，并在37℃，5％CO2下温育24小时。然后，在适当的细胞培养基里，用不同浓度的测试化合物(20μL)处理细胞(总体积，0.2mL)。对照孔含有细胞和培养基但无测试化合物。将孔板在37℃和5％CO2下温育120小时，然后向孔中加入MTT(5mg/mL)(20μL)，并将孔板在37℃下孵育1.5小时。小心去除培养基，然后加入DMSO(180μL)，振荡15分钟，在490nm和570nm处测量吸光度，620nm为参考。依照以下公式计算抑制率：抑制率％＝[1-(分析值 -空白对照值)/(控制值-空白对照值)]×100。结果列于表1。

表1.本专利申请的Her2-tubullysin衍生物偶联物及其对NCI-N87细胞的细胞毒性结果(IC50)：

实施例186.BALB/c裸鼠人胃癌NCI-N87异种移植瘤模型上的体内抗肿瘤活性

在人胃癌NCI-N87异种移植瘤模型上评估了偶联物C-166a，C-719，C-720， C-723和T-DM1的体内疗效。五周龄的雌性BALB/c小鼠(66只动物)在右肩下区域用0.1mL无血清培养基里的N-87癌细胞(5×106个细胞/小鼠)进行皮下接种。肿瘤生长7天后长至平均大小125mm3。然后将动物随机分成10组(每组6只动物)。第一组小鼠用作对照组，注射磷酸盐缓冲液(PBS)。另5组分别静脉注射6mg/kg剂量的偶联物C-166a，C-719，C-720，C-723和T-DM1。每3天或4天 (每周两次)测量肿瘤的三个维度，并使用公式肿瘤体积＝1/2(长×宽×高)计算肿瘤体积。同时测量动物的体重。当满足以下任何一个条件时，需要处死小鼠：(1)体重减少超过注射前体重的20％，(2)肿瘤体积大于1500mm3， (3)病态严重至无法进食和进水或(4)皮肤坏死。如果肿瘤是未可感知的，则认为小鼠是无肿瘤的。结果如图23。

实施例187.偶联物C-166a，C-719，C-720，C-723和T-DM1的毒性比较研究

将6-7周大的66只ICR雌性小鼠分为11组。每组包括6只小鼠，用于肝毒性研究。第一组小鼠用作对照组，注射磷酸盐缓冲液(PBS)。其他10组分别注射偶联物C-166a，C-719，C-720，C-723和T-DM1，静脉注射，剂量75mg/ Kg和150mg/Kg。在12天内每天测量每只动物的体重变化。血液采集遵循NCI 的啮齿动物采血指南。通常而言，给药后第5天和第12天，通过小鼠的眶后窦采血，离心以获得血清。使用PUS-2018半自动生化分析仪(分别使用天冬氨酸和丙氨酸作为底物)，分析天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)和碱性磷酸酶(ALP)的水平。根据制造商的建议，通过跟随反应动力学建立参考值。采血后，处死小鼠，并将小鼠肝脏切片以进行病理研究。AST 和ALT的结果如表2所示，动物的体重变化和病理图片如图24和25所示。

肝毒性结果和动物体重变化的结果表明，在相对更高的75mg/Kg和150 mg/Kg剂量下，偶联物C-166a和C-719的毒性低于T-DM1，偶联物C-720具有与T-DM1相似的毒性，偶联物C-723的毒性比T-DM1高得多。在测试剂量下的毒性顺序为：C-723>T-DM1≥C-720>C-719>C-166a>PBS。如图23所示，由于偶联物C-166a，C-719，C-720和C-723具有相似的体内活性，并且它们均比T-DM1具有更好的体内活性，因此，偶联物C-166a和C-719的窗口将比 T-DM1更大。总体而言，用2-N-烷基-2，2-二烷基-乙酸基团取代tubulysin左侧的N-烷基--2-羧基可以显著地降低药物的毒副作用，同时能保持其体内活性。

表2.受试动物的AST和ALT的平均测试结果

实施例188.化合物C-166a和C-719偶联物的冻干制剂的制备和偶联物的稳定性研究

在纯化后浓度为20mg/ml的C-166a和C-719偶联物的柠檬酸缓冲溶液中，加入了不同浓度的不同辅料(聚山梨酯80、蔗糖、海藻糖、苯甲醇和氯化钠)。将混合物调节至不同的pH值(pH 4.5～7.0)，将约80mg偶联物装入10mL硼硅酸盐小瓶中，然后在-65℃至0℃再至室温下减压(5～10torr)冻干，形成干燥饼状化合物。将饼状化合物在设定条件下储存，用4mL无菌水复溶后分析，研究其稳定性。

蛋白质熔解温度(Tm)是反映生物药物构象热稳定性的重要指标。通常， Tm越高表示生物分子的变性和聚集温度越高，蛋白质构象越稳定，在实际存储条件下(例如2-8℃或室温下)稳定性越高。通过nano DSF扫描并通过pr.control 软件分析(NanoTemperTechnologies GmbH,Floessergasse 4,81369Munich, Germany)，测量Tm。聚集起始(Tagg onset)是聚集开始的温度，聚集强度 (Tagg int)是总体聚集度的定性度量。表3总结了一些配方的分析结果。

表3.不同辅料配方的冻干偶联物C-166a的稳定性分析。

配方的热稳定性结果表明，pH值对产品的热稳定性和聚集有很大的影响，并且pH在5.0和6.0之间时，pH值越高，产品的热稳定性越好；在相同的pH 值下，不同的辅料配比对产品的热稳定性影响不大，相同pH值条件下，制剂中同时包含蔗糖或海藻糖与聚山梨酯80或20均可提高产品的热稳定性(例如 S4→S6，S7→S24和S25→S36)。

表4.冻干的偶联物C-166a和C-719的稳定性的分析，在25℃下保存6个月

注：C-166a1的配方为：10ml硼硅酸盐瓶中(冻干后)含80mg C-166a、 240mg蔗糖、0.8mg聚山梨酯-80、24mg柠檬酸钠，pH～5.8(用4ml抑菌水复溶后)。

C-166a2的配方为：10ml硼硅酸盐小瓶中(冻干后)含80mg C-166a，240 mg海藻糖，0.8mg聚山梨酸酯20、45mg苯甲醇，15mg蛋氨酸、24mg柠檬酸钠，pH～6.0(用4ml抑菌水复溶后)。

C-7191的配方为：10ml硼硅酸盐小瓶中(冻干后)含80mg C-719、240 mg蔗糖，0.8mg聚山梨酯80、24mg柠檬酸钠，pH～5.8(用4毫升的抑菌水复溶后)。

7192的配方是：10毫升硼硅酸盐小瓶中(冻干后)含80mg C-719、240mg 蔗糖，0.8mg聚山梨酯-80、60mg苯甲醇，24mg柠檬酸钠，pH～5.5(用4ml抑菌水复溶后)。

表4中的结果表明，在25℃下，上述配方的偶联物C-166a和C-719可稳定保存6个月。

附图的简要说明

图1显示了Tubulysin衍生物的Tuv片段的一般合成。

图2显示了Tubulysin的片段的合成。

图3显示了Tubulysin的片段的合成。

图4显示了Tubulysin衍生物的片段的合成。

图5显示了Tubulysin衍生物的片段的合成。

图6显示了Tubulysin衍生物的片段的合成。

图7显示了Tubulysin衍生物的片段的合成。

图8显示了含有偶联物连接子的Tubulysin衍生物的片段的合成。

图9显示了Tubulysin衍生物的片段的合成及其与抗体的偶联。

图10显示了连接子的片段的合成。

图11显示了含有连接子的Tubulysin衍生物的合成及其与抗体的偶联。

图12显示了含有连接子的Tubulysin衍生物的合成及其与抗体的偶联。

图13显示了含有连接子的Tubulysin衍生物的合成及其与抗体的偶联。

图14显示了含有连接子的Tubulysin衍生物的合成及其与抗体的偶联。

图15显示了连接子的片段的合成及其与含有连接子的Tubulysin衍生物的连接以及其与抗体的偶联。

图16显示了Tup和Tuv衍生物的片段的合成。

图17显示了Tuv衍生物的片段的合成。

图18显示了含有连接子的Tubulysin衍生物的合成及其与抗体的偶联。

图19显示了含有连接子的Tubulysin衍生物的合成及其与抗体的偶联。

图20显示了含有连接子的Tubulysin衍生物的合成及其与抗体的偶联。

图21显示了含有连接子的Tubulysin衍生物的合成及其与抗体的偶联。

图22显示了含有连接子的Tubulysin衍生物的合成及其与抗体的偶联。

图23显示了在人胃肿瘤N87细胞模型上偶联物C-166a，C-719，C-720和C- 723与T-DM1的抗肿瘤作用的比较，i.v.一次注射，剂量为6mg/kg。四种偶联物显示出比T-DM1更好的抗肿瘤活性。化合物C-166a，C-719，C-720和C-723组中的所有动物(6/6)在第22天至第36天完全没有可测量的肿瘤，并且它们都可以抑制肿瘤生长超过48天。相比之下，剂量为6mg/Kg的T-DM1不能消除肿瘤，只能抑制肿瘤生长31天。

图24(a)和(b)显示了ADC偶联物T-DM1，C-166a，C-719，C-720和C- 723的急性毒性研究，观察给药剂量分别为75mg/Kg(图24-a)和150mg/Kg (图24-b)的小鼠在12天内的体重(BW)变化。体重变化显示了偶联物C-723 的毒性在两种剂量下都比T-DM1高；偶联物C-720在剂量为75mg/Kg时，与T- DM1的毒性相似，而在剂量为150mg/Kg时，毒性小于T-DM1；偶联物C-166a 和偶联物C-719在两种测试剂量下，毒性都比T-DM1低得多。

图25显示了注射75mg/Kg的偶联物T-DM1，C-166a，C-719，C-720和C-723 以及PBS缓冲液后，在第5天小鼠的肝病理图片(图片放大40倍)。图片表明： (1)T-DM1组(图25-(a))，75mg/kg T-DM1组病理表明肝细胞肿胀和多灶性坏死。小叶结构不清楚。中央小静脉包含肿胀的肝细胞，红血球和其他的红物质。肝细胞核的大小和染程度不同。肝细胞显示边界模糊，体积增加和血浆嗜酸性染。肝细胞核部分消失。呈现增殖特征。(2)在C-723组(图25- (b))，分散的单细胞坏死和水样变性是主要的病理学表现。在肿胀区域，肝小叶结构消失，中央小静脉中充斥着大量红细胞。肝细胞呈肿胀，边界不清和嗜酸性染。细胞核的大小和颜多变。观察到轻度增殖。(3)C-720组的病理(图25-(c))显示小叶中央静脉中的渗出液，肝板排列紊乱和肝细胞增生。偶尔会观察到Kupffer细胞肥大。(4)在C-719(图25-(e))和C-166a(图25- (f))组中，肝小叶结构均出现轻微紊乱，可见肝窦。胆管壁可见炎性细胞浸润。少量Kupffer细胞肥大，肝细胞轻度肿胀，其显微结构与对照组PBS组相似 (图25-(g))。

图26显示了通过nanoDSF技术测得的配方S7，S8，S9，S10，S11和S12的蛋白质熔解温度(Tm)。结果表明，配方S10比其余配方更稳定，并且S7，S8， S9，S11和S12之间的热稳定性差异很较小。

图27显示了通过nanoDSF技术测得的配方S7，S8，S9，S10，S11和S12的聚集开始温度(Tagg onset)。结果表明，配方S10比其余配方更稳定，并且配方 S7，S8，S9和S11之间的热稳定性几乎没有差异，S12比其余测试配方的稳定性稍差。

图28显示了通过nanoDSF技术测得的配方S12，S18和S24的蛋白质熔解温度 (Tm)。结果表明，配方S24比其他两种配方都稳定，配方S12比其他两种配方都不稳定。

图29显示了通过nanoDSF技术测量测得的配方S12、S18和S24的聚集开始温度(Taggonset)。结果表明，配方S24比其他两种配方都稳定，配方S12比其他两种配方都不稳定。