用葡萄糖合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌的构建及应用

本发明涉及工业微生物的生物技术以及生物化工领域，具体涉及一种以葡萄糖为底物合成甘氨酸的重组大肠杆菌工程菌株的构建和应用。

近些年，合成生物学与代谢工程的发展为大肠杆菌工程菌改造提供了有利条件，通过对野生菌进行定向进化以及合理的遗传改造，可以将廉价的底物转化为高附加值的化学品、燃料以及高分子聚合物。

甘氨酸(英文名为Glycine)又名氨基乙酸，是结构最简单的α-氨基酸。它是一种非常重要的精细化工合成中间体，在医药、食品、农药以及饲料添加剂等领域都有广泛应用。甘氨酸目前常用于以下几个领域：(1)在生物体内，甘氨酸是一些重要的小分子代谢物的合成前体，在饮食中加入适量的甘氨酸可以有效的心血管疾病、炎症、肥胖、肿瘤以及糖尿病病人的代谢紊乱(2)甘氨酸是盐酸地拉普利、草甘氨酸阿司匹林钙、扑热息痛甘氨酸盐、以及利血胺注射液等多种药物合成的中间体。(3)甘氨酸作为氨基酸强化剂、调味剂、甜味剂以及抗氧化剂广泛应用于食品行业。(4)甘氨酸是合成除草剂草甘膦的前体物质，该除草剂曾被美国政府评为最优秀的农药。

目前合成甘氨酸的方法主要有氨解法、施特雷克法(Strecker)法、催化脱氢氧化法，辐射合成法和生物合成法等。其中的生物合成法，在此之前有利用乙醇胺为底物，在好氧土壤杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属等微生物的作用下转化获得，也有利用假细胞菌属、酪蛋白菌属、产碱杆菌属等菌属将甘氨酰胺水解生成甘氨酸。虽然上述方法可以实现甘氨酸的生产，但是存在原料成本较高以及酶活性较低，需要大量菌体的问题。生物转化仍需要建立一种更为廉价的原料路线。大肠杆菌作为遗传背景清晰、遗传操作简单的模式微生物，常被用来进行代谢工程改造以生产具有高附加值的代谢产物。在大肠杆菌中甘氨酸可以由丝氨酸、苏氨酸等前体得到，但鲜有以葡萄糖作为底物通过代谢工程改造合成甘氨酸的研究。

本发明的目的是构建一种大肠杆菌重组菌，通过对重组菌的基因进行引入或敲除修饰，该重组菌可以高效将葡萄糖转化为甘氨酸。

本发明提供的大肠杆菌重组菌具有如下修饰：

一种大肠杆菌重组菌，所述菌株包括如下修饰:

1)引入外源的谷氨酸乙醛酸转氨酶基因cgaT；

2)引入外源苹果酸硫激酶基因mtk，引入外源苹果酰辅酶A裂解酶裂解酶基因mcl；

3)引入乙醛酸途径aceK基因，即异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的基因；

4)敲除aceB基因，即苹果酸合酶A的基因；

5)敲除iclR基因，即乙醛酸途径转录抑制因子的基因；

6)敲除glcB基因，即蛋白质苹果酸合酶G的基因；

7)敲除maeA基因，即苹果酸脱氢酶(需要NAD)的基因；

8)敲除maeB基因，即苹果酸脱氢酶的基因。

本发明还提供了一种上述大肠杆菌重组菌的构建方法，其制备步骤如下：

2)构建两种质粒，其中一种为谷氨酸乙醛酸转氨酶II基因cgaT的质粒pLB1k-cgaT(Cqu)，另一种为苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶异柠檬酸裂解酶和异柠檬酸脱氢酶激酶的重组质粒pSB1a-mtk(Mca)-mcl(Rsp)-aceAK。

2)构建宿主菌，将受体菌XY24的苹果酸合酶A基因aceB敲除，形成重组菌GC01；将重组菌GC01的乙醛酸途径转录抑制因子基因iclR敲除，形成重组菌GC02；将重组菌GC02的苹果酸合酶G基因glcB敲除，形成重组菌GC03；将重组菌GC03的苹果酸脱氢酶(需要NAD)基因maeA敲除，形成重组菌GC04；将重组菌GC04的苹果酸脱氢酶基因maeB敲除，形成重组菌GC05。

3)将重组菌GC05制备感受态细胞，将步骤1)中的质粒pLB1k-cgaT(Cqu)导入GC05，形成重组菌GC06；将菌株GC06制备感受态细胞，将步骤1)的pSB1a-mtk(Mca)-mcl(Rsp)-aceAK导入到GC06，构建成利用葡萄糖合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌GC07。

所述谷氨酸乙醛酸转氨酶II基因cgaT的质粒pLB1k-cgaT(Cqu)来源于藜麦Chenopodium quinoa；所述苹果酸硫激酶基因mtk来源于Methylococcus capsulatus，苹果酰辅酶A裂解酶裂解酶基因mcl来源于Rhodobacter sphaeroides；异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的重组质粒pSB1a-mtk(Mca)-mcl(Rsp)-aceAK来源于大肠杆菌。

进一步地，感受态细胞转化主要采用氯化钙法。

本发明另外一个目的是提供了一种用上述所述的重组大肠杆菌以葡萄糖为原料制备甘氨酸的方法，其包括以下步骤：

1)菌体的培养和酶的诱导：将重组大肠杆菌GC07菌株37℃过夜培养，以1％接种量转接于含50mL ZYM自诱导培养基摇瓶中，加入卡那霉素和氨苄青霉素，使终浓度分别为50μg/mL和100μg/mL，30℃诱导培养16h；

2)全细胞催化转化：将上述诱导后的培养液分光光度计测定菌浓度，收集1.5×1011菌体，4℃、5000rpm离心10min后取沉淀，用0.85％生理盐水洗涤两次，弃上清后，将菌体用5mL转化液重悬，转移到试管，使最终菌浓度为3×1010/mL，全细胞转化生成甘氨酸，全细胞转化体系中含有终浓度50mM的葡萄糖及1×PBS，转化条件为37℃、200rpm。

本发明有益效果

本发明技术通过对大肠杆菌重组菌进行基因修饰，改变其代谢途经，大肠杆菌重组菌以葡萄糖为原料先后经过糖酵解，乙醛酸途经和反向乙醛酸途经合成甘氨酸，中间有“固碳”的步骤，其转化率能很高，且转化成本低廉。

图1为大肠杆菌重组菌以葡萄糖为原料合成甘氨酸的途经。

图2为用葡萄糖为原料的重组大肠杆菌工程菌株甘氨酸产量。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，大肠杆菌BW25113(Datsenko KA,Wanner BL.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000；97(12):6640-6645.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌BW25113可从中国科学院微生物研究所获得。大肠杆菌XY24是以大肠杆菌BW25113为出发株通过遗传学改造获得(Piao XY,WangL,Lin BX,Chen H,Liu WF*,Tao Y*.Metabolic engineering of Escherichia coli forproduction of L-aspartate and itsderivativeβ-alanine with high stoichiometricyield.Metabolic Engineering.2019；54:244-254.)，该菌株通过ppc加强、mdh敲除等改造实现草酰乙酸(OAA)的积累，通过poxB敲除等改造去除副产物产生。

实施例1重组大肠杆菌工程菌株GC07的构建

重组大肠杆菌工程菌株GC07的构建，具体步骤如下：

1.构建藜麦(Chenopodium quinoa)来源的谷氨酸乙醛酸转氨酶II基因cgaT的质粒pLB1k-cgaT(Cqu)。

1)cgaT基因的PCR扩增。经过改造的藜麦(Chenopodium quinoa)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶II基因cgaT(Cqu)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。序列通过全基因合成，连接在pUC57载体上，获得载体pUC57-cgaT(Cqu)。以cgaT(Cqu)-F和cgaT(Cqu)-R为引物，载体pUC57-cgaT(Cqu)质粒为模板，用高保真TransStart FastPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为AP221)PCR扩增出cgaT(Cqu)基因片段。

2)构建含有cgaT(Cqu)基因的重组表达载体。将上述步骤1)得到的PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。同时用NcoI和XhoI酶切载体pLB1k，载体pLB1k核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，回收载体大片段LB1k-NX。用Gibson组装方法(Gibson DG,Young L,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat.methods.2009；6(5):343-345)将上述cgaT(Cqu)片段与LB1k-NX片段进行连接反应。用CaCl2法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录为CD201。涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物105-F/cgaT(Cqu)-R鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，挑选阳性克隆提取质粒，获得阳性质粒命名为pLB1k-cgaT(Cqu)。

SEQ ID No.2序列中，araC基因编码序列：第86-964位；PBAD启动子序列：第1238-1266位；RBS序列：第1295-1299位；NcoI位点：第1308位；XhoI位点：第1367位；TrrnB终止子序列：第1501-1658位；P15A复制起始位点RepA基因编码序列：第1742-2128位；卡那霉素抗性基因编码序列：第2275-3090位。

2.构建协同表达Methylococcus capsulatus来源的苹果酸硫激酶、Rhodobactersphaeroides来源的苹果酰辅酶A裂解酶和大肠杆菌来源的异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的重组质粒pSB1a-mtk(Mca)-mcl(Rsp)-aceAK。

人工合成经过大肠杆菌密码子优化过的Methylococcus capsulatus来源的苹果酸硫激酶基因mtk和Rhodobacter sphaeroides来源的苹果酰辅酶A裂解酶基因mcl，mcl基因前引物了RBS序列，按照上述扩增藜麦(Chenopodium quinoa)来源的谷氨酸乙醛酸转氨酶II基因cgaT(Cqu)的方法，用引物mtk(Mca)-F和mcl(Rsp)-R扩增出mtk(Mca)-mcl(Rsp)-NX片段，含有RBS的mtk(Mca)-mcl(Rsp)的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。与载体片段pSB1a-NX，载体pSB1a核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，进行Gibson组装，得到质粒pSB1a-mtk(Mca)-mcl(Rsp)。用EcoRI和PstI酶切质粒pSB1a-mtk(Mca)-mcl(Rsp)获得大片段pSB1a-mtk(Mca)-mcl(Rsp)-EP。

SEQ ID No.3序列中，mtk(Mca)编码序列：第1-2088位；RBS序列：第2089-2104位；mcl(Rsp)编码序列：第2105-3061位。

SEQ ID No.4序列中，araC基因编码序列：第86-964位；PBAD启动子序列：第1238-1266位；RBS序列：第1295-1299位；NcoI位点：第1308位；XhoI位点：第1367位；TrrnB终止子序列：第1501-1658位；P15A复制起始位点RepA基因编码序列：第2260-3210位；氨苄青霉素抗性基因编码序列：第3832-4692位。

从大肠杆菌中提取基因组DNA，用引物aceA-F/aceK-R扩增aceAK基因片段，同时将RBS序列引入在引物中。将aceAK片段与pSB1a-mtk(Mca)-mcl(Rsp)-EP片段进行连接反应。转化大肠杆菌DH5a，用引物108-F/124-R鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，筛选阳性克隆，并获得质粒命名为pSB1a-mtk(Mca)-mcl(Rsp)-aceAK。aceAK的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示。

SEQ ID No.5序列中，aceA基因编码序列：第1-1305位；aceK基因编码序列：第1488-3224位。

3.构建宿主菌

(1)苹果酸合酶A基因aceB的敲除。

a.首先制备含有大肠杆菌基因片段的P1噬菌体，所含有的基因片段具有aceB敲除性状。

含有aceB敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株JW3974，该菌株为含有aceB敲除性状的W3110系列菌株，购自日本国立遗传学研究所(NIG，Japan)，其中的编码苹果酸合酶A的基因aceB替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因，约1300bp，从而将aceB基因敲除(Baba T,Ara T,et al.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol.Syst.Biol.2006；2:2006.0008.)。P1噬菌体制备过程如下：将JW3974菌株37℃过夜培养后转接于含5mmol/LCaCl2和0.1％葡萄糖的LB培养基中，37℃培养1h，然后，加入野生型P1噬菌体继续培养1-3h。加200μL氯仿再培养10min，离心取上清即得到含有片段的噬菌体P1virDaceB。

b.利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌菌株GC01-Kan，具体步骤如下：过夜培养的受体菌XY24，1.5mL菌8000rpm离心3min后，用0.75mL的P1盐溶液重悬XY24菌体细胞，将100mL噬菌体P1virDaceB与100mL XY24细胞悬浮液混和，37℃孵育30min。然后，加入1mL的LB培养基和200mL的1mol/L柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集菌体，用100mL的LB培养基重悬后，涂布含50mg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜后，挑选克隆，用aceB-F/aceB-R引物PCR扩增鉴定，扩增出1900bp目的带为阳性，挑选阳性克隆命名为GC01-Kan。前述P1盐溶液溶质为10mM CaCl2和5mM MgSO4，溶剂为水。

C.抗性的消除：将pCP20质粒，购自Clontech公司，通过氯化钙转化法转化至GC01-Kan，在含有氨苄青霉素的LB平板30℃过夜培养后挑选克隆，得到含有质粒pCP20的重组大肠杆菌GC01-Kan/pCP20。在含有氨苄青霉素抗性的LB培养基30℃培养后，涂布于无抗性LB平板上42℃培养过夜，挑选克隆，用aceB-F/aceB-R引物PCR扩增鉴定，扩增出600bp目的带为阳性，挑选阳性克隆命名为GC01。

(2)乙醛酸途径转录抑制因子基因iclR的敲除。

从重组菌GC01出发，使用步骤(1)敲除方法，将乙醛酸途径转录抑制因子基因iclR敲除，获得重组大肠杆菌GC02。其中与步骤(1)中使用菌株、引物区别在于：含有iclR敲除性状的大肠杆菌菌株变为JW3978，对应引物的名称中由aceB变为iclR。

(3)苹果酸合酶G基因glcB的敲除。

从重组菌GC02出发，使用步骤(1)敲除方法，将苹果酸合酶G基因glcB敲除，获得大肠杆菌GC03。其中与步骤(1)中使用菌株、引物名称区别在于：含有glcB敲除性状的大肠杆菌菌株变为JW2943，对应引物的名称中由aceB变为glcB。

(4)苹果酸脱氢酶(需要NAD)基因maeA的敲除。

从重组菌GC03出发，使用步骤(1)敲除方法，将苹果酸脱氢酶(需要NAD)基因maeA敲除，获得大肠杆菌GC04。其中与步骤(1)中使用菌株、引物名称区别在于：含有maeA敲除性状的大肠杆菌菌株变为JW5238，对应引物的名称中由aceB变为maeA。

(5)苹果酸脱氢酶基因maeB的敲除。

从重组菌GC04出发，使用步骤(1)敲除方法，将苹果酸脱氢酶基因maeB敲除，获得大肠杆菌GC05。其中与步骤(1)使用菌株、引物名称区别在于：含有maeB敲除性状的大肠杆菌菌株变为JW2447，对应引物的名称中由aceB变为maeB。

4.基因工程菌的构建

1)重组大肠杆菌GC06的构建。

将菌株GC05制备感受态细胞，将质粒pLB1k-cgaT(Cqu)用CaCl2法转化GC05，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑选克隆，命名为GC06。

2)重组大肠杆菌GC07的构建。

将菌株GC06制备感受态细胞，将质粒pSB1a-mtk-mcl-aceAK用CaCl2法转化GC06，涂布于含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑选克隆，命名为GC07。

3)重组大肠杆菌GC00的构建。

将菌株GC05制备感受态细胞，将质粒pLB1K和pSB1a用CaCl2法转化GC05。涂布于含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑选克隆，命名为GC00。

以上具体实施例所用引物见表1，以上具体实施例宿主菌及其性状见表2。

表1引物序列列表

表2.宿主菌及其性状列表

注：*：构建过程见Piao XY,Wang L,Lin BX,Chen H,Liu WF*,Tao Y*.Metabolicengineering of Escherichia coli for production of L-aspartate and itsderivativeβ-alanine with high stoichiometric yield.MetabolicEngineering.2019；54:244-254。

本发明同时提供了一种利用上述工程菌株，以葡萄糖为原料合成甘氨酸的方法。该方法在工业生产中能够以葡萄糖为原料进行发酵、转化，同时固碳途径和反向乙醛酸途径的引入使葡萄糖具有更高的转化率，使甘氨酸的产量提高。

实施例2利用重组大肠杆菌菌株GC00和GC07以葡萄糖为原料生产甘氨酸。

大肠杆菌重组菌以葡萄糖为原料先后经过糖酵解，乙醛酸途径和反向乙醛酸途径合成甘氨酸，中间有“固碳”的步骤，其转化率能高达1.67g/g，代谢途径见图1。总反应式：1Glc+2CO2+4NADPH+2ATP→2NADH+2FADH+4Glycine

具体生产步骤如下：

(1)菌体的培养和酶的诱导

将过夜培养的工程菌株GC00和GC07按1％接种量，转接于含50mL ZYM自诱导培养基的摇瓶中，加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖，再加入卡那霉素和氨苄青霉素，使终浓度分别为50μg/mL和100μg/mL，30℃诱导培养16h，测定O.D.600光吸收值，并收集1.5×1011菌体，按照O.D.600＝1时菌浓度为1×109/mL计算。

(2)全细胞催化进行转化

将上述收集的1.5×1011菌体，4℃，5000rpm离心10min后取沉淀，用0.85％生理盐水洗涤两次，弃上清后，将菌体用5mL转化液重悬，转移到试管，使最终菌浓度为3×1010/mL，全细胞转化生成甘氨酸，全细胞转化体系中含有终浓度50mM的葡萄糖及1×PBS，37℃、200rpm进行转化，转化4h、6h、8h后分别取样测试。

(3)高效液相谱法检测甘氨酸

将样品在4℃，13000rpm离心10min，取上清，使用2，4-二硝基氟苯(DNFB)进行氨基酸衍生，吸取100μL离心后上清液，加入0.5M NaHCO3、1％DNFB、乙腈各100μL混合，于避光条件下60℃水浴衍生处理1h，衍生反应结束后，加入700μL 0.01M KH2PO4(PH7.0)，用0.22μm微孔滤膜过滤制样，并进行HPLC氨基酸检测，实验设置三次重复，结果取平均值。高效液相谱检测仪器及检测条件如下：

HPLC氨基酸定性分析：仪器使用岛津LC-20AT 220V(SHIMADZU，Japan)，谱柱使用Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为A:pH 7.0、0.01M KH2PO4；B:乙腈-甲醇-水混合液(体积比9：9：2)；流动相使用0.45μm水系/有机滤膜过滤，超声脱气20min至无明显气泡。流速1mL/min，柱温40℃，进样量1μL，PDA检测波长360nm，参比波长600nm，数据采集时间35min。梯度洗脱，方法程序(B泵)：1-2.5min，12％；2.5-13min，16-36％；13-28min，38-100％；28-35，10％。

参照标品出峰时间和峰面积，制定标准曲线，再根据样品的峰面积，计算样品中甘氨酸的含量。结果如图2，转化4小时后，GC00菌株没有甘氨酸积累，GC07的甘氨酸产量为0.35g/L。

(5)上述重组大肠杆菌菌株以葡萄糖为原料生产甘氨酸所用培养基如下：

a)LB培养基配方：

酵母粉：5g/L

蛋白胨：10g/L

NaCl：10g/L

b)ZYM自诱导培养基配方：

100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度)；

A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％L-阿拉伯糖；

D.500×MgSO4：1M MgSO4

E.1000×微量元素：50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2Mo4、Na2SeO3和H3BO3各2mM。

c)转化液配方：

葡萄糖50mM、NH4HCO3 100mM、KH2PO4/K2HPO4buffer 100mM。

序列表

<110> 南京盛德生物科技研究院有限公司

<120> 用葡萄糖合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌的构建及应用

<130> 2019

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atgagcaagg gtctggacta cgaaggcctg aacgagaacg tgaagaaatg ccaatacgcg 60

gttcgtggtg agctgtatct gcgtgcgagc gaactgcaga aagagggtaa gaagatcatt 120

ttcaccaacg tgggtaaccc gcacgcgctg ggtcaaaaac cgctgacctt tccgcgtcag 180

gtggttgcgc tgtgccaagc gccgttcctg ctggacgatc cgaacgtggg tattgttttt 240

ccggcggatg cgattgcgcg tgcgaagcac tatctgagca tgaccagcgg tggcctgggt 300

gcgtatagcg atagccgtgg cattccgggt gttcgtaaag agattgcgga attcatcgag 360

cgtcgtgacg gttacccgag cgatccggaa ctgatctttc tgaccgacgg tgcgagcaaa 420

ggcgtgatgc aaattctgaa cgcggttatc ggtggccaga gcgatggcat tctggtgccg 480

gttccgcagt acccgctgta tagcgcgagc atcagcctgc tgggtggcag cctggtgccg 540

tactatctgg aggaaaccgc gaactggggt ctggacatta acaacctgcg tgatgcgatc 600

cagcaagcga ccttcaaggg cattaaagtg cgtgcgatgg ttatcattaa cccgggtaac 660

ccgaccggcc agtgcctgag cgtggcgaac ctgcaagaaa ttgttaactt ctgcatccag 720

gagaagctgg tgctgctggc ggacgaagtt taccagcaaa acatctatca agatgagcgt 780

ccgtttgtga gcgcgcgtaa ggttctgatg gacatgggtc cgccgatgaa caaagatctg 840

cagctggtta gcttccacac cgttagcaaa ggctactggg gtgagtgcgg ccaacgtggt 900

ggctattttg aaatgaccaa catcccgcag aagagcgttg atgagatcta caaaattgcg 960

agcattgcgc tgagcccgaa cgtgccgggt caaattttcc tgggcctgat ggttaacccg 1020

ccgaagccgg gtgacatcag ctatctgcgt tttgagcagg aaagcaaggg cattctggaa 1080

agcctgcgta aacgtgcgcg tatcatgacc gatggtttca acagctgccg taacgtggtt 1140

tgcaacttca ccgagggcgc gatgtacagc tttccgcaga tttgcctgcc gccgaaagcg 1200

gtggaagcgg cgaagaacgc gggtaaacac ccggacgtgt tctactgcct gaagctgctg 1260

gaggcgaccg gtatcagcac cgtgccgggt agcggcttcg gtcaaaaaga aggcgttttt 1320

cacatgcgta ccaccattct gccggcggag gaagatatgc cggcgatcat ggaaagcttc 1380

aagaaattta acgacgcgtt catggaacac tacgaggatc agcgtgcggg ttatagccgt 1440

atgtaa 1446

<210> 2

<211> 3241

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac tccgtcaagc 60

cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca ttcacttttt 120

cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta aatacccgcg 180

agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata ggcatccggg 240

tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag cttaagacgc 300

taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag caaacatgct 360

gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg tactgacaag 420

cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct tccatgcgcc 480

gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc ccttcccctt 540

gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt cgctgaaatg cggctggtgc gcttcatccg 600

ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg acggccagtt aagccattca tgccagtagg 660

cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat accattcgcg agcctccgga tgacgaccgt 720

agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca aaatatcacc cggtcggcaa acaaattctc 780

gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc gaatggtgag attgagaata taacctttca 840

ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc ggcgttaaac 900

ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc ccggcagcag gggatcattt tgcgcttcag 960

ccatactttt catactcccg ccattcagag aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac 1020

attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct tctcgctaac caaaccggta accccgctta 1080

ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg 1140

tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg 1200

ccatagcatt tttatccata agattagcgg atcctacctg acgcttttta tcgcaactct 1260

ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc taacaggagg aattaaccat gggtacctct 1320

catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagcctcga gggtagatct 1380

ggtactagtg gtgaattcgg tgagctcggt ctgcagctgg tgccgcgcgg cagccaccac 1440

caccaccacc actaatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt 1500

tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 1560

gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 1620

caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gtcgacgcga gcggtatcag 1680

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 1740

tccatgtcag ccgttaagtg ttcctgtgtc actgaaaatt gctttgagag gctctaaggg 1800

cttctcagtg cgttacatcc ctggcttgtt gtccacaacc gttaaacctt aaaagcttta 1860

aaagccttat atattctttt ttttcttata aaacttaaaa ccttagaggc tatttaagtt 1920

gctgatttat attaatttta ttgttcaaac atgagagctt agtacgtgaa acatgagagc 1980

ttagtacgtt agccatgaga gcttagtacg ttagccatga gggtttagtt cgttaaacat 2040

gagagcttag tacgttaaac atgagagctt agtacgtgaa acatgagagc ttagtacgta 2100

ctatcaacag gttgaactgc ggatcttgct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 2160

gggattttgg gcggccgccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 2220

ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagc 2280

catattcaac gggaaacgtc ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat 2340

ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga 2400

ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc 2460

aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg 2520

accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc 2580

gggaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat 2640

gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac 2700

agcgaccgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat 2760

gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg 2820

cataaacttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat 2880

aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc 2940

gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca 3000

ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag 3060

tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga 3120

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccact 3180

tgcggagacc cggtcgtcag cttgtcgtcg gttcagggca gggtcgttaa atagcgcatg 3240

c 3241

<210> 3

<211> 3061

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

atgaacattc acgagtacca ggcgaaggaa ctgctgaaaa cctatggcgt gccggttccg 60

gatggtgcgg tggcgtacag cgatgcgcag gcggcgagcg ttgcggagga aattggtggc 120

agccgttggg tggttaaggc gcaaattcat gcgggtggcc gtggcaaggc gggtggcgtg 180

aaagttgcgc acagcatcga ggaagtgcgt cagtatgcgg acgcgatgct gggcagccac 240

ctggttaccc atcaaaccgg tccgggtggc agcctggtgc agcgtctgtg ggttgagcaa 300

gcgagccaca ttaagaaaga atactatctg ggcttcgtga tcgatcgtgg taaccaacgt 360

atcaccctga ttgcgagcag cgagggtggc atggaaatcg aggaagtggc gaaggagacc 420

ccggaaaaga ttgttaaaga ggtggttgac ccggcgatcg gcctgctgga ttttcagtgc 480

cgtaaagtgg cgaccgcgat tggcctgaag ggtaaactga tgccgcaagc ggttcgtctg 540

atgaaggcga tctaccgttg catgcgtgac aaagatgcgc tgcaagcgga gattaacccg 600

ctggcgatcg tgggcgagag cgacgaaagc ctgatggttc tggatgcgaa gttcaacttt 660

gacgataacg cgctgtaccg tcaacgtacc attaccgaaa tgcgtgacct ggcggaggaa 720

gatccgaaag aggtggaagc gagcggccac ggtctgaact atattgcgct ggacggcaac 780

atcggttgca ttgttaacgg tgcgggtctg gcgatggcga gcctggacgc gatcaccctg 840

cacggtggcc gtccggcgaa cttcctggat gtgggtggcg gtgcgagccc ggagaaggtg 900

accaacgcgt gccgtatcgt tctggaagac ccgaacgtgc gttgcatcct ggttaacatt 960

tttgcgggca tcaaccgttg cgactggatt gcgaagggtc tgatccaggc gtgcgatagc 1020

ctgcaaatta aagtgccgct gatcgttcgt ctggcgggca ccaacgttga tgagggtcgt 1080

aaaattctgg cggaaagcgg cctgagcttc atcaccgcgg aaaacctgga cgatgctgcg 1140

gcgaaggcgg tggcgatcgt taaaggttaa cagtcaggag atataatgag cgtgttcgtt 1200

aacaagcaca gcaaagttat cttccagggt tttaccggcg agcacgcgac ctttcacgcg 1260

aaggacgcga tgcgtatggg cacccgtgtg gttggtggcg tgaccccggg taaaggtggc 1320

acccgtcacc cggacccgga gctggcgcac ctgccggtgt tcgataccgt tgcggaagcg 1380

gtggcggcga ccggtgcgga tgttagcgcg gtgtttgtgc cgccgccgtt taacgcggat 1440

gcgctgatgg aggcgatcga tgcgggtatt cgtgtggcgg ttaccatcgc ggacggcatt 1500

ccggttcacg atatgatccg tctgcaacgt taccgtgttg gcaaggacag catcgtgatt 1560

ggtccgaaca ccccgggcat cattaccccg ggtgaatgca aagtgggcat catgccgagc 1620

cacatttaca agaaaggtaa cgttggcatc gttagccgta gcggcaccct gaactatgag 1680

gcgaccgaac agatggcggc gctgggtctg ggcattacca ccagcgttgg tatcggtggc 1740

gacccgatta acggcaccga tttcgtgacc gttctgcgtg cgtttgaggc ggacccggag 1800

accgaaatcg tggttatgat cggcgagatt ggtggcccgc aagaagtggc tgcggcgcgt 1860

tgggcgaagg aaaacatgac caaaccggtt attggttttg tggcgggtct ggcggcgccg 1920

accggccgtc gtatgggtca cgcgggcgcg atcattagca gcgaggcgga caccgcgggt 1980

gcgaagatgg atgcgatgga agcgctgggc ctgtatgttg cgcgtaaccc ggcgcagatc 2040

ggtcaaaccg tgctgcgtgc ggcgcaggaa catggcattc gtttttaaag aggagaaagg 2100

taccatgagc tttcgtctgc aaccggctcc gccggcgcgt ccgaaccgtt gccaactgtt 2160

tggtccgggc agccgtccgg cgctgtttga gaaaatggcg gcgagcgcgg cggacgtgat 2220

caacctggac ctggaagata gcgttgcgcc ggatgataaa gcgcaggcgc gtgcgaacat 2280

cattgaggcg atcaacggtc tggactgggg ccgtaagtac ctgagcgtgc gtattaacgg 2340

tctggatacc ccgttttggt atcgtgacgt ggttgatctg ctggagcagg cgggtgaccg 2400

tctggatcaa atcatgattc cgaaagtggg ttgcgcggcg gacgtgtatg cggttgatgc 2460

gctggttacc gcgatcgaac gtgcgaaggg tcgtaccaaa ccgctgagct tcgaggtgat 2520

cattgaaagc gcggcgggca tcgcgcacgt tgaggaaatt gcggcgagca gcccgcgtct 2580

gcaagcgatg agcctgggtg cggcggattt tgcggcgagc atgggtatgc agaccaccgg 2640

cattggtggc acccaagaga actactatat gctgcacgac ggccagaaac actggagcga 2700

tccgtggcac tgggcgcaag cggcgattgt ggcggcgtgc cgtacccacg gtattctgcc 2760

ggttgacggt ccgttcggcg attttagcga cgatgaaggt tttcgtgcgc aggcgcgtcg 2820

tagcgcgacc ctgggtatgg tgggcaagtg ggcgatccac ccgaaacaag tggcgctggc 2880

gaacgaggtt tttaccccga gcgaaaccgc ggttaccgag gcgcgtgaaa ttctggcggc 2940

gatggacgcg gcgaaggcgc gtggtgaagg tgcgaccgtg tataaaggtc gtctggttga 3000

tatcgcgagc attaagcagg cggaagtgat cgttcgtcaa gcggaaatga ttagcgcgta 3060

a 3061

<210> 4

<211> 4792

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac tccgtcaagc 60

cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca ttcacttttt 120

cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta aatacccgcg 180

agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata ggcatccggg 240

tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag cttaagacgc 300

taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag caaacatgct 360

gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg tactgacaag 420

cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct tccatgcgcc 480

gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc ccttcccctt 540

gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt cgctgaaatg cggctggtgc gcttcatccg 600

ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg acggccagtt aagccattca tgccagtagg 660

cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat accattcgcg agcctccgga tgacgaccgt 720

agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca aaatatcacc cggtcggcaa acaaattctc 780

gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc gaatggtgag attgagaata taacctttca 840

ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc ggcgttaaac 900

ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc ccggcagcag gggatcattt tgcgcttcag 960

ccatactttt catactcccg ccattcagag aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac 1020

attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct tctcgctaac caaaccggta accccgctta 1080

ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg 1140

tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg 1200

ccatagcatt tttatccata agattagcgg atcctacctg acgcttttta tcgcaactct 1260

ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc taacaggagg aattaaccat gggtacctct 1320

catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagcctcga gggtagatct 1380

ggtactagtg gtgaattcgg tgagctcggt ctgcagctgg tgccgcgcgg cagccaccac 1440

caccaccacc actaatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt 1500

tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 1560

gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 1620

caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gtcgaccaga cccgccataa 1680

aacgccctga gaagcccgtg acgggctttt cttgtattat gggtagtttc cttgcatgaa 1740

tccataaaag gcgcctgtag tgccatttac ccccattcac tgccagagcc gtgagcgcag 1800

cgaactgaat gtcacgaaaa agacagcgac tcaggtgcct gatggtcgga gacaaaagga 1860

atattcagcg atttgcccga gcttgcgagg gtgctactta agcctttagg gttttaaggt 1920

ctgttttgta gaggagcaaa cagcgtttgc gacatccttt tgtaatactg cggaactgac 1980

taaagtagtg agttatacac agggctggga tctattcttt ttatcttttt ttattctttc 2040

tttattctat aaattataac cacttgaata taaacaaaaa aaacacacaa aggtctagcg 2100

gaatttacag agggtctagc agaatttaca agttttccag caaaggtcta gcagaattta 2160

cagataccca caactcaaag gaaaaggtct agtaattatc attgactagc ccatctcaat 2220

tggtatagtg attaaaatca cctagaccaa ttgagatgta tgtctgaatt agttgttttc 2280

aaagcaaatg aactagcgat tagtcgctat gacttaacgg agcatgaaac caagctaatt 2340

ttatgctgtg tggcactact caaccccacg attgaaaacc ctacaaggaa agaacggacg 2400

gtatcgttca cttataacca atacgctcag atgatgaaca tcagtaggga aaatgcttat 2460

ggtgtattag ctaaagcaac cagagagctg atgacgagaa ctgtggaaat caggaatcct 2520

ttggttaaag gctttgagat tttccagtgg acaaactatg ccaagttctc aagcgaaaaa 2580

ttagaattag tttttagtga agagatattg ccttatcttt tccagttaaa aaaattcata 2640

aaatataatc tggaacatgt taagtctttt gaaaacaaat actctatgag gatttatgag 2700

tggttattaa aagaactaac acaaaagaaa actcacaagg caaatataga gattagcctt 2760

gatgaattta agttcatgtt aatgcttgaa aataactacc atgagtttaa aaggcttaac 2820

caatgggttt tgaaaccaat aagtaaagat ttaaacactt acagcaatat gaaattggtg 2880

gttgataagc gaggccgccc gactgatacg ttgattttcc aagttgaact agatagacaa 2940

atggatctcg taaccgaact tgagaacaac cagataaaaa tgaatggtga caaaatacca 3000

acaaccatta catcagattc ctacctacgt aacggactaa gaaaaacact acacgatgct 3060

ttaactgcaa aaattcagct caccagtttt gaggcaaaat ttttgagtga catgcaaagt 3120

aagcatgatc tcaatggttc gttctcatgg ctcacgcaaa aacaacgaac cacactagag 3180

aacatactgg ctaaatacgg aaggatctga ggttcttatg gctcttgtat ctatcagtga 3240

agcatcaaga ctaacaaaca aaagtagaac aactgttcac cgttagatat caaagggaaa 3300

actgtcgata tgcacagatg aaaacggtgt aaaaaagata gatacatcag agcttttacg 3360

agtttttggt gcatttaaag ctgttcacca tgaacagatc gacaatgtaa cagatgaaca 3420

gcatgtaaca cctaatagaa caggtgaaac cagtaaaaca aagcaactag aacatgaaat 3480

tgaacacctg agacaacttg ttacagctca acagtcacac atagacagcc tgaaacaggc 3540

gatgctgctt atcgaatcaa agctgccgac aacacgggag ccagtgacgc ctcccgtggg 3600

gaaaaaatca tggcaattct ggaagaaata gcgctttcag ccggcaaacc tgaagccgga 3660

tctgcgattc tgataacaaa ctagcaacac cagaacagcc cgtttgcggg cagcaaaacc 3720

cgcggccgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 3780

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 3840

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 3900

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 3960

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 4020

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtgata cactattatc ccgtattgac 4080

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4140

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4200

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4260

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4320

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4380

atgccaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4440

caattaatag actgaatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4500

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4560

attgcagcac tggggccaga tggtaagcgc tcccgtatcg tagttatcta caccacgggg 4620

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4680

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4740

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatcgcat gc 4792

<210> 5

<211> 3224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

atgaaaaccc gtacacaaca aattgaagaa ttacagaaag agtggactca accgcgttgg 60

gaaggcatta ctcgcccata cagtgcggaa gatgtggtga aattacgcgg ttcagtcaat 120

cctgaatgca cgctggcgca actgggcgca gcgaaaatgt ggcgtctgct gcacggtgag 180

tcgaaaaaag gctacatcaa cagcctcggc gcactgactg gcggtcaggc gctgcaacag 240

gcgaaagcgg gtattgaagc agtctatctg tcgggatggc aggtagcggc ggacgctaac 300

ctggcggcca gcatgtatcc ggatcagtcg ctctatccgg caaactcggt gccagctgtg 360

gtggagcgga tcaacaacac cttccgtcgt gccgatcaga tccaatggtc cgcgggcatt 420

gagccgggcg atccgcgcta tgtcgattac ttcctgccga tcgttgccga tgcggaagcc 480

ggttttggcg gtgtcctgaa tgcctttgaa ctgatgaaag cgatgattga agccggtgca 540

gcggcagttc acttcgaaga tcagctggcg tcagtgaaga aatgcggtca catgggcggc 600

aaagttttag tgccaactca ggaagctatt cagaaactgg tcgcggcgcg tctggcagct 660

gacgtgacgg gcgttccaac cctgctggtt gcccgtaccg atgctgatgc ggcggatctg 720

atcacctccg attgcgaccc gtatgacagc gaatttatta ccggcgagcg taccagtgaa 780

ggcttcttcc gtactcatgc gggcattgag caagcgatca gccgtggcct ggcgtatgcg 840

ccatatgctg acctggtctg gtgtgaaacc tccacgccgg atctggaact ggcgcgtcgc 900

tttgcacaag ctatccacgc gaaatatccg ggcaaactgc tggcttataa ctgctcgccg 960

tcgttcaact ggcagaaaaa cctcgacgac aaaactattg ccagcttcca gcagcagctg 1020

tcggatatgg gctacaagtt ccagttcatc accctggcag gtatccacag catgtggttc 1080

aacatgtttg acctggcaaa cgcctatgcc cagggcgagg gtatgaagca ctacgttgag 1140

aaagtgcagc agccggaatt tgccgccgcg aaagatggct ataccttcgt atctcaccag 1200

caggaagtgg gtacaggtta cttcgataaa gtgacgacta ttattcaggg cggcacgtct 1260

tcagtcaccg cgctgaccgg ctccactgaa gaatcgcagt tctaagcaac aacaaccgtt 1320

gctgactgta ggccggataa ggcgttcacg ccgcatccgg caatcggtgc acgatgcctg 1380

atgcgacgct tgcgcgtctt atcatgccta cagccgttgc cgaacgtagg ctggataagg 1440

cgtttacgcc gcatccggca attctctgct cctgatgagg gcgctaaatg ccgcgtggcc 1500

tggaattatt gattgctcaa accattttgc aaggcttcga tgctcagtat ggtcgattcc 1560

tcgaagtgac ctccggtgcg cagcagcgtt tcgaacaggc cgactggcat gctgtccagc 1620

aggcgatgaa aaaccgtatc catctttacg atcatcacgt tggtctggtc gtggagcaac 1680

tgcgctgcat tactaacggc caaagtacgg acgcggcatt tttactacgt gttaaagagc 1740

attacacccg gctgttgccg gattacccgc gcttcgagat tgcggagagc ttttttaact 1800

ccgtgtactg tcggttattt gaccaccgct cgcttactcc cgagcggctt tttatcttta 1860

gctctcagcc agagcgccgc tttcgtacca ttccccgccc gctggcgaaa gactttcacc 1920

ccgatcacgg ctgggaatct ctactgatgc gcgttatcag cgacctaccg ctgcgcctgc 1980

gctggcagaa taaaagccgt gacatccatt acattattcg ccatctgacg gaaacgctgg 2040

ggacagacaa cctcgcggaa agtcatttac aggtggcgaa cgaactgttt taccgcaata 2100

aagccgcctg gctggtaggc aaactgatca caccttccgg cacattgcca tttttgctgc 2160

cgatccacca gacggacgac ggcgagttat ttattgatac ctgcctgacg acgaccgccg 2220

aagcgagcat tgtttttggc tttgcgcgtt cttattttat ggtttatgcg ccgctgcccg 2280

cagcgctggt cgagtggcta cgggaaattc tgccaggtaa aaccaccgct gaattgtata 2340

tggctatcgg ctgccagaag cacgccaaaa ccgaaagcta ccgcgaatat ctcgtttatc 2400

tacagggctg taatgagcag ttcattgaag cgccgggtat tcgtggaatg gtgatgttgg 2460

tgtttacgct gccgggcttt gatcgggtat tcaaagtcat caaagacagg ttcgcgccgc 2520

agaaagagat gtctgccgct cacgttcgtg cctgctatca actggtgaaa gagcacgatc 2580

gcgtgggccg aatggcggac acccaggagt ttgaaaactt tgtgctggag aagcggcata 2640

tttccccggc attaatggaa ttactgcttc aggaagcagc ggaaaaaatc accgatctcg 2700

gcgaacaaat tgtgattcgc catctttata ttgagcggcg gatggtgccg ctcaatatct 2760

ggctggaaca agtggaaggt cagcagttgc gcgacgccat tgaagaatac ggtaacgcta 2820

ttcgccagct tgccgctgct aacattttcc ctggcgacat gctgtttaaa aacttcggtg 2880

tcacccgtca cgggcgtgtg gttttttatg attacgatga aatttgctac atgacggaag 2940

tgaatttccg cgacatcccg ccgccgcgct atccggaaga cgaacttgcc agcgaaccgt 3000

ggtacagcgt ctcgccgggc gatgttttcc cggaagagtt tcgccactgg ctatgcgccg 3060

acccgcgtat tggtccgctg tttgaagaga tgcacgccga cctgttccgc gctgattact 3120

ggcgcgcact acaaaaccgc atacgtgaag ggcatgtgga agatgtttat gcgtatcggc 3180

gcaggcaaag atttagcgta cggtatgggg agatgctttt ttga 3224