一种酶法生产羟脯氨酸过程中三废的处理方法

一种酶法生产羟脯氨酸过程中三废的处理方法

技术领域

本发明涉及一种酶法生产羟脯氨酸过程中三废的处理方法。

背景技术

羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸羟基化后的产物，其分子式为C5H9NO3。羟脯氨酸呈白片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274℃，易溶于水，微溶于乙醇。根据羟脯氨酸羟基化位置的不同，可分为3-羟脯氨酸(3-Hyp)或4-羟脯氨酸(4-Hyp)。因羟脯氨酸有两个不对称碳原子，所以有4种立体异构体，自然界中反式-4-羟基脯氨酸较为常见，反式-4-羟脯氨酸最早发现于动物胶原蛋白中。

国内外氨基酸的生产方法主要有发酵法、酶法、蛋白水解提取法、化学合成法。羟脯氨酸主要采用蛋白水解提取法、化学合成法、脯氨酸羟化酶转化法、直接发酵法四种。

蛋白水解提取法主要采用以骨胶、明胶、鱼鳞、猪皮为原材料提取羟脯氨酸，收率一般在4％-7％，且环境、设备、人员损害都比较大。

化学合成法，兰州晨曦生物科技有限责任公司申报的专利(专利申请号201110192951.X，申请日：2011.07.12)中提供一种(2S，4S)-4-羟脯氨酸的合成方法。该发明只是涉及到了羟脯氨酸不同构型的转化，而不是从头完全合成，对我公司开发该产品的参考价值不大。

脯氨酸羟化酶转化法(以脯氨酸为底物)

A、从动物内脏提取脯氨酸羟化酶，位于动物体内许多组织(皮肤、肾、肝、肺、心和骨骼肌)微粒体中的原胶原脯氨酸羟基化酶PPH(Protocollagen Proline Hydroxylase)，在Fe2+、α-酮戊二酸和还原剂如抗坏血酸盐(缺乏VC导致胶原羟化不完全，血管壁易破裂，发生坏血病。所以VC又叫抗坏血酸)等存在的条件下,可以把以肽链形式结合存在的L-脯氨酸转化4-L-羟基脯氨酸，这个肽链的结构为(X-Pro-Gly)n,其中X除了甘氨酸外、可以是脯氨酸、丙氨酸和其它的氨基酸；Pro代表脯氨酸；Gly代表甘氨酸。而三肽结构(Gly-Pro-Pro)中的脯氨酸和游离的L-脯氨酸曾被认为是不能被原胶原脯氨酸羟基化酶转化为L-羟脯氨酸的。

尾崎明夫等人的发明专利，用一种带有重组DNA而且能使L-脯氨酸生物合成系统的活性增强的转化体，其中的重组DNA是通过将含有编码具有L-脯氨酸-4-羟化酶活性的蛋白质的基因的DNA片段重组到载体中得到的，该酶在2-酮戊二酸和二价铁离子存在下作用于游离的L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸；转化体在培养基上培养,将得到的培养物、菌体或它们的处理物作为酶源。

杨阳等人曾尝试以猪肺为原料，提取到能把游离的L-脯氨酸羟化为L-羟脯氨酸的羟基化酶。其方法是:把新鲜猪肺在提取液中低温高速匀浆，然后用4000r/min离心分离20min，取上清液进一步用8000r/min高速离心后，分别用盐析和有机溶剂的方法提取羟基化酶。结果不同的方法都得到棕的固体，经电泳测定该固体纯度高，溶于水中后能把游离的L-脯氨酸羟化为L-羟脯氨酸。测定其分子量约为66,000；等电点约为4。该方法提取羟基化酶工艺流程简单、高效、实用，且猪肺便宜、易得，适合较大规模的制备。

B、利用基因工程重组菌生产脯氨酸羟化酶

日本协和发酵工业株式会社在多国(含中国)申请相关专利共七篇。均是通过发酵在微生物细胞表达脯氨酸羟化酶，再通过收集活菌体或提取脯氨酸羟化酶用于羟脯氨酸的生产，生产的羟脯氨酸产品包括3-羟脯氨酸，4-羟脯氨酸的不同构型，其中生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量最高可达63g/L。该工艺生产羟脯氨酸与我公司丝氨酸生产工艺类似，生产设备亦基本一致，并且其专利权即将过期(2014年9月4号)，其采用的工艺路线很值得我公司借鉴，酶法生产羟脯氨酸的核心技术菌体的培养和优化，一旦公司成功研发后，结合现有的酶法生产工艺，可利用现有的生产设备即可进行规模生产。

直接发酵法

日本科学家TAKESHI SHIBASAKI等人通过基因工程技术将脯氨酸合成的酶系和脯氨酸羟化酶导入大肠杆菌菌株W1485putA(该菌株putA基因已突变，不能分解L-脯氨酸)中，构建了一株能直接发酵生产羟脯氨酸的工程菌。该菌株可以在不添加L-脯氨酸的培养基中，以简单的营养成分生产羟脯氨酸，96小时后发酵水平可达25g/L，具有工业化大规模发酵生产羟脯氨酸的潜力。其基因工程菌构建的过程如下：

a、将质粒pPRO1(带有大肠杆菌菌株FERMBP-2807的proB基因(该基因编码的酶酶活受L-脯氨酸反馈抑制)和proA基因)用限制性内切酶EcoRV消化，得到一条带proB基因的DNA片段(长约1kbp)，再将该片段插入pUC19质粒的SmaI位点，即得到质粒pBAB5。

b、通过定点突变技术将质粒pBAB5上的proB基因突变为proB74基因(该基因编码的酶具有L-脯氨酸反馈抑制抗性，即其酶活不受或不完全受L-脯氨酸的反馈抑制)，用proB74基因片段换下pPRO1质粒上的proB基因，得到带有proB74基因和proA基因的质粒pPRO74。

c、以质粒pWHF1(带有脯氨酸-4-羟化酶基因)为模版，扩增出脯氨酸-4-羟化酶基因片段，并将其连接到质粒pBluescriptⅡKS(+)中，得到质粒pBII-40H。以质粒pPRO74为模板扩增出带有proB74基因和proA基因的DNA片段，并将其插入到质粒pBII-40H中，得到质粒pBII-40HBA。

d、限制性内切酶消化质粒pBII-40HBA，得到带有脯氨酸-4-羟化酶基因、proB74基因和proA基因的DNA片段，并用该片段替换下质粒pWFH1的脯氨酸-4-羟化酶基因片段，即可得到质粒pWFP1。

e、将质粒pWFP1导入大肠杆菌菌株W1485putA(该菌株putA基因已突变，不能分解L-脯氨酸)即得到产羟脯氨酸的基因工程菌E.coli W1485putA/pWFPl，该菌株在简单营养成分培养基中发酵96小时，培养基中积累的羟脯氨酸浓度可达25g/L。

综上所述，采用酶技术生产羟脯氨酸主要竞争对手是日本协和发酵工业株式会社，国内天津大港化工二厂，上海东海制药厂，河北省冀荣氨基酸有限公司三家，都是采用蛋白水解法生产，因环保问题都几乎停产。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种酶法生产羟脯氨酸过程中三废的处理方法。

本发明的技术方案是：一种酶法生产羟脯氨酸过程中三废的处理方法，其特征在于含有以下步骤：

(1)工艺废气：本发明主要废气污染源为生产过程中干燥、打包工段产生的含粉尘废气，原料处理含尘废气采用静电除尘后经15m高排气筒高空排放，其除尘效率>99％，排放粉尘浓度满足《大气污染物综合排放标准》的要求；

(2)废水处理：生活、生产污水排水经厂区污水处理站处理后达到《提取类制药工业水污染物排放标准》(GB 21905-2008)通过污水管网排入河体，污水处理站采用涡凹气浮+A2/O工艺；

(3)固体废物：本发明固体废物主要为生产过程中的脱过滤、反冲洗工序产生的废活性炭渣，废包装材料、机修废油、空调过滤器更换废滤布、生活垃圾等，根据本发明固体废物种类、数量、处置方式可知，可全部得到综合利用或处置，不排放。

本发明一种酶法生产羟脯氨酸过程中三废的处理方法的有益效果是：本发明的生产工艺及生产过程控制方面，均较好的按照清洁生产的要求进行了设计，在能耗、物耗、水耗指标，污染物排放量控制等方面都设置了节能环保措施。本发明较好的符合了清洁生产要求，属于国内先进水平。本发明的循环经济水平较高，在水、气、固体废物等方面都在一定程度上综合利用，但从发明生产的实际情况以及区域环境功能的要求考虑，发明的循环经济水平还可以进一步提高，从而不断完善企业和区域内循环经济的发展。本发明污染治理措施的污染防治对策措施情况下，废气、废水中的污染物排放浓度和排放量均可达到国家排放标准的要求；固体废物得到合理利用或处置；发明建成投产后，评价区域内的环境空气、地表水及声环境质量可控制在相应的环境质量标准内。环境风险在可接受范围内。发明的清洁生产水平整体属于国内先进水平。在严格落实各项环境保护措施及事故风险防范措施，加强企业环境管理，杜绝污染事故发生的情况下，从环境保护的角度而言，发明建设可行。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明：

实施例1：一种酶法生产羟脯氨酸过程中三废的处理方法，其特征在于含有以下步骤：

(1)工艺废气：本发明主要废气污染源为生产过程中干燥、打包工段产生的含粉尘废气，原料处理含尘废气采用静电除尘后经15m高排气筒高空排放，其除尘效率>99％，排放粉尘浓度满足《大气污染物综合排放标准》的要求；

(2)废水处理：生活、生产污水排水经厂区污水处理站处理后达到《提取类制药工业水污染物排放标准》(GB 21905-2008)通过污水管网排入河体，污水处理站采用涡凹气浮+A2/O工艺；

(3)固体废物：本发明固体废物主要为生产过程中的脱过滤、反冲洗工序产生的废活性炭渣，废包装材料、机修废油、空调过滤器更换废滤布、生活垃圾等，根据本发明固体废物种类、数量、处置方式可知，可全部得到综合利用或处置，不排放。