一种半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品

所属领域：本发明属于医药范畴，更确切说是一种半乳甘露聚糖肽的制取 方法及产品。

背景技术：经初步检索，未查到以冬虫夏草或发酵法制得的冬虫夏草菌丝 体(以下统称“虫草原料”)为原料，采用乙醇分级沉淀、离子交换柱层析和分 子筛层析相结合的复合分离纯化技术，分离得到层析纯和电泳纯半乳甘露聚糖 肽的制取方法及产品。

发明内容：本发明是一种以“虫草原料”为原料，采用乙醇分级沉淀、离 子交换柱层析和分子筛层析相结合的复合纯化技术，分离得到层析纯和电泳纯 半乳甘露聚糖肽的制取方法及产品。本发明的产品是一种肿瘤的注射用药 物。现参照说明书附图将本发明内容叙述如下：

一、原料准备：

(1)、虫草原料：要求无杂质，水份含量≤8％，虫草多糖含量≥6.0％。

(2)、水：蒸馏水，无离子水。

(3)、乙醇：无水乙醇，95％乙醇。

(4)、丙酮：分析纯或分析纯以上。

二、虫草多糖I的制取：

将合格的“虫草原料”装入提取装置中，然后再按虫草原料∶水＝1∶10-20 之比例(重量比)往提取设备中加入蒸馏水。料加完，安装好设备，将原料置 于80°-100℃和有搅拌的条件下进行蒸馏提取1-2小时，停止提取。料温降至40 ℃以下时，将提取物料进行过滤，滤液保存。残渣可按上述方法再提取1次后 再弃掉残渣。将两次提取液统一装入一个蒸馏设备中，在减压下，温度在60 o ±5℃下进行浓缩。当提取液内的固形物≥10％时，在浓缩液中加入相当浓缩液 3倍体积的95％乙醇，搅拌10分钟后静置沉淀4小时以上，再进行离心分离后 收集沉淀物。在沉淀物中加入丙酮脱水，然后再进行离心分离，分离出的沉淀 物在45℃-60℃的温度下进行干燥，干燥后的产品即是虫草多糖I。虫草多糖I 的质量要求：糖含量≥32.5％，蛋白含量≥45.2％。

三、虫草多糖II的制取：

将合格的“虫草多糖I”放入容器中，加入无离子水并搅拌，至虫草多糖 I的浓度达4-6％时，在常温(15℃-30℃)下向已配制好的含5％虫草多糖I的 溶液中加入无水乙醇，同时搅拌，至乙醇在溶液中含量≥40％时止，稍静置后进 行分离，去掉沉淀。在分离后的溶液中再加入无水乙醇，至乙醇在溶液中含量 达63-67％时止，同时搅拌，当沉淀析出完全后进行分离，收集沉淀。在沉淀物 中加入丙酮进行脱水干燥，得到地产品是虫草多糖II。虫草多糖II的质量要求： 糖含量≥49.3％，蛋白含量≥23.9％。

四、半乳甘露聚糖肽的制取：

将符合质量要求的“虫草多糖II”置于容器中，在常温和搅拌下加入无离 子水，将其配成0.8-1.2％浓度的水溶液。对上述0.8-1.2％虫草多糖II溶液进行 DEAE-SaphedexG-50柱层析，然后进行洗脱，即：(1)、第一次洗脱用无离 子水洗脱，至无紫外吸收峰出现止。(2)、第二次洗脱用0.1MNaCL溶液洗脱至 没有紫外吸收峰出现止。洗脱完毕将洗脱物收集一起并放入浓缩装置中进行浓 缩，至固形物含量≥10％时，再进行saphedexG-50柱层析，以280nm波长检 测流出物。这时得到两个洗脱峰，收集前一个洗脱峰进行冷冻干燥，得到半乳 甘露聚糖肽干粉。产品的质量标准：(1)、糖含量：45-48％，(2)、蛋白含量： 48-46％，(3)、水分：7-6％，(4)、甘露糖∶半乳糖(摩尔比)＝1∶0.73。

五、半乳甘露聚糖肽的应用实验：该产品在动物试验中，对试验小鼠具有 免疫调节作用，对小鼠S180肉瘤的抑瘤率为51％。由动物实验证明：本发明的产 品是一种可用于肿瘤病的注射用药物。

本发明的优点：

(1)、本发明是以“虫草原料”为原料制取半乳甘露聚糖肽，这为生产半 乳甘露聚糖肽增加了另一种原料，也为“虫草原料”的应用开辟了另一条途径。

(2)、本发明以“虫草原料”为原料，经过采用乙醇分级沉淀、离子交换 柱层析和分子筛层析相结合的复合分离纯化方法，分离得到一种层析纯和电泳 纯的半乳甘露聚糖肽，此方法为半乳甘露聚糖肽的制取到了另一种制取方法。

(3)、半乳甘露聚糖肽制品在对小鼠进行试验中证明：(A)、对试验小鼠具 有免疫调节作用；(B)、对小鼠S180肉瘤的抑瘤率达51％。故制成半乳甘露聚糖 肽注射剂后也为医药领域增加了一个新品种。

附图说明：说明书附图是本发明的工艺流程图。

具体实施方式：

例1：

(1)、把符合质量要求，发酵法制得的冬虫夏草菌丝体和其他原料：水、 乙醇、丙酮、全部备齐待用。

(2)、制取虫草多糖I：

(A)、将冬虫夏草菌丝体1公斤置于提取装置内，再加入10公斤蒸馏水， 然后将提取装置安装无误，再在85℃±2℃和搅拌下蒸馏提取1小时停机，常温 下过滤，滤液保留。

(B)、在滤渣中再加入5公斤蒸馏水，在85°±2℃和搅拌下提取1小时， 停止提取，过滤，滤后残渣弃去。本次滤液与上次滤液合并，在60℃±5℃温度 下进行减压浓缩至固形物含量达6.0％时，停止浓缩，在浓缩后的滤液中，按滤 液∶乙醇＝1∶3(体积比)，加入95％乙醇，搅10分钟，静置沉淀5小时，装入 离心机以5000转/分进行离心沉淀10分钟，停机，收集沉淀物。

(C)、在沉淀物中加入分析纯丙酮进行脱水，再离心分离，收集沉淀物在 52℃±2℃下进行干燥，当沉淀物干燥结束时达到：糖33.5％，蛋白45.3％。干 燥后的这物质即为合格的虫草多糖I(共85克)。

(3)、制取虫草多糖II：

(A)、在已制取好的85克虫草多糖I中加入无离子水170ml并搅拌30分 钟，使虫草多糖I溶于水中，然后向虫草多糖I溶液中加1133ml无水乙醇并搅 拌10分钟至均匀，停搅，静置沉淀5小时，放入离心机内以5000转/分进行离 心分离10分钟，停机，收取清液，沉淀弃。

(B)、在分离得到的清液中加入2024ml无水乙醇，搅均，再静置沉淀5小 时后，放入离心机内以5000转/分进行离心分离，收集沉淀物，再在沉淀物中加 入丙酮脱水，再干燥后，当提取物质量达到：糖含量49.3％，蛋白含量23.9％时， 得到55g物质即为虫草多糖II。

(4)、半乳甘露聚糖肽的制取：

(A)、将制得的55克虫草多糖II加入到5445克无离子水中，常温下搅拌 30分钟，制成1％水溶液。

(B)、利用由250克DEAE-SaphedexG-50装成的层析柱进行吸附层析， 用无离子水洗脱，将非吸附物弃去。再用0.1MNaCL溶液将吸附物洗脱，用280nm 紫外吸收检测器检测洗脱物，收集洗脱峰，所得液体在60°±2℃下进行减压浓 缩至500ml，然后将浓缩液分5次进行由200克SaphedexG-50装成的层析柱进 行层析，以280nm紫外吸收检测器检测洗脱物，得到两个洗脱峰，收集第一个 洗脱峰的液体。将5次洗脱的第一个洗脱峰液体合并后，在60°±2℃减压浓缩 至500ml进行冷冻干燥，得到半乳甘露聚糖肽冻干粉1.5克。该产品的质量是： (甲)、糖含量48％，(乙)、蛋白含量46％，(丙)、甘露糖∶半乳糖(摩尔比) ＝1∶0.73，(丁)、水分6％。

(5)、半乳甘露聚糖肽的应用实验：

本产品在动物试验中表明：对试验小鼠具有免疫调节作用；对小鼠S180肉瘤 的抑瘤率为51％。

例2：

(1)、把符合质量标准的冬虫夏草、水、乙醇和丙酮、全部原料备齐待用。

(2)、制取虫草多糖I：称取1公斤冬虫夏草放入提取设备中，再加入20 公斤无离子水，在85℃±2℃和搅拌条件下蒸馏提取2小时，停机过滤，弃去滤 渣。收集滤液于57°±3℃进行减压浓缩至固形物含量达10％，再加入相当浓缩 液3倍体积的95％乙醇，搅拌5分钟，搅均后静置沉淀5小时，弃去上清液， 将沉淀物装入离心机以5000转/分分离，收集的沉淀物为未干燥的虫草多糖I。

(3)、制取虫草多糖II：在未干燥的虫草多糖I中加入1700毫升无离子水， 常温下搅拌溶解30分钟，之后再加入无水乙醇1133毫升，搅拌均匀，静置沉 淀5小时，装入离心机离心沉淀，清液保存待用。在离心得的清液中再加入无 水乙醇1133毫升，搅均后静置沉淀5小时，离心去沉淀，在滤液中再加入2024 毫升无水乙醇，搅均，静置沉淀5小时，倾掉上清液，再以5000转/分进行离心 分离，收集沉淀物为未干燥的虫草鞋多糖II。把分离得的未干燥的虫草多糖II 加入到5000毫升无离子水中，搅拌30分钟，制成溶液备用。

(4)、半乳甘露聚糖肽的制取：利用由10公斤，D301大孔弱碱性苯乙烯 阴离子交换树脂装成的离子交换柱进行吸附配制的虫草多糖II溶夜中的一些成 分。用无离子水洗脱掉未吸咐的成分弃去。然后收集以0.1MNaCL溶液洗脱交 换柱上的吸附物，用280nm紫外吸收检测器检测收集的洗脱物，洗脱物在NaCL 溶液中已溶解，再在60°±2℃下进行减压液缩至500毫升停止。将浓缩液分成 5份，分5次进行由200克SaphedexG-50装成的层析柱进行层析。以280nm 紫外吸收检测器检测洗脱物，得到两个洗脱峰，收集第一个洗脱峰的液体，合 并在一起后，在60°±2℃下进行减压浓缩至500毫升，停止浓缩。将浓缩液进 行冷冻干燥，得到1.65克半乳甘露聚糖肽冻干粉。

该产品的质量为：糖45％，蛋白48％，甘露糖∶半乳糖(摩尔比)＝1∶0.73， 水分7％。

(5)、半乳甘露聚糖肽的应用实验：本次制得的半乳甘露聚糖肽用于试验 小鼠有免疫调节作用；对小鼠S180肉瘤的抑瘤率为51％。