一种药物组合物注射液的质量检测方法

一种药物组合物注射液的质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种注射液的质量检测方法，特别涉及本发明药物组合物注射液的指纹 图谱质量检测方法及其注射液中总皂苷和9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含 量测定方法。

背景技术

本发明药物组合物注射液是由黄芪、人参、苦参素3味药物组成、采用现代提取分 离技术精制而成的中药注射剂，具有益气扶正，增强机体免疫功能的功效，在临床上用 于原发性肝癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、妇科肿瘤以及各种原因引起的白细胞低下及减少 症和慢性乙型肝炎的。

高效液相谱(HPLC)技术是构建中药指纹图谱主要的方法，在中药的质量控制中 发挥着重要的作用；但目前中药指纹图谱研究尚处于研究阶段，还存在一些问题需要不 断探索，如指纹图谱研究的规范化、标准化有待加强，由于受所用仪器、谱柱等影响， 指纹图谱的重现性问题尚需提高，指纹图谱分析评价方法还有待完善等。

超高效液相谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)谱理论认为 提高谱柱的效能(efficiency)就能增加仪器的解析度(resolution)，而运用粒径低于2μm 的小颗粒无疑是增加效能的好方法；但减小固定相的粒度以增加谱柱效能一直的谱 仪器科学的瓶颈，因为小颗粒不仅要求系统能承受高于目前极限压力(比如 6000psi/400bar)，需要更小的系统体积(死体积)，并且需要能适应可能只有几秒峰宽的 高速检测器；与传统的高效液相谱(HPLC)相比，UPLC具有高分离度(ultra resolution)、 高速度(ultra speed)、灵敏度(sensitivity)等优势；目前，UPLC多应用于代谢组学分 析及其他一些生化领域，在天然产物的分析方面运用也逐渐兴起，因为在这些领域深入 研究需要更高的分析精度。

发明内容

本发明目的在于提供一种注射液的质量检测方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现：

本发明药物组合物注射液的质量检测方法，包括如下含量测定和/或指纹图谱检测方 法：

A 药物组合物注射液中总皂苷成分的含量测定方法为：对照品溶液制备，精密称取人 参皂苷Rg1标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成0.98～1.10mg/ml的人参皂苷 储备溶液；精密称取黄芪甲苷标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成 1.0～1.2mg/ml的黄芪甲苷储备溶液，将以上两种储备溶液按照1∶1(V/V)的比例混合，制成 浓度为1.0～1.1mg/ml对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液 2～3ml，注入活化后的C18 SPE柱，依次采用水10ml，1％乙酸‑水15ml，水15ml，10％甲醇‑ 水10ml，80％甲醇‑水15ml，洗脱，将80％甲醇‑水洗脱部分蒸干，取甲醇适量定容于2ml 容量瓶，制成供试品溶液；精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入 香草醛0.2ml，高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴 冷却1min，以空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷 的量，即得；

B 药物组合物注射液中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量测定方法为： 对照品溶液制备，称取9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品，配制为15.0～16.5 μg/ml的对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴 蒸干，残渣加入1％冰醋酸水溶液1～3ml使溶解，上C‑18，500mg固相萃取柱，使用前先用 无水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗分离，以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗 脱，然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱， 收集80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μL分析；液相条件：Agilent Eclipse XDB‑C18 (150×4.6mm，5μm)，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱： 15％A(0min)，25％A(30min)，40％A(40min)，检测波长207nm，柱温30℃，流速0.8ml/min； 精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml，高氯酸0.8ml 混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以空白溶液作 参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

C 药物组合物注射液指纹图谱检测方法为：谱条件，分析谱柱Agilent XDB‑C18  150×4.6mm 5μm，检测波长205nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，理论板数按人参皂苷 Rf峰计算应不低于200000，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱： 15％A(0min)，19％A(20min)，25.5％A(36min)，50％A(50min)，70％A(65min)， 70％A(85min)；质谱条件：电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；气帘气温度(Gas temp) 350℃；气帘气流速(Gas flow)8 L/min；辅助气压力(Nebulizer)为30psi；毛细管电压 (Vcap)：4000V；四级杆‑飞行时间串联质谱仪条件(MS QTOF conditions)：碎裂电压 (Fragmentor)：175V；截取锥电压(Skimmer)：65V；第一重八级杆的射频电压(OCT1 RF  Vpp)750V；供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残 渣加入1％冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg，活化步骤：使用前先 用无水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml 水洗脱，然后以8％～12％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以75％～85％甲醇18ml 溶液洗脱，收集75％～85％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中， 加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；对10％和100％甲醇洗脱 液进行HPLC分析，在对应的保留时间没有皂苷类和黄酮类谱峰；本发明药物组合物注 射液指纹图谱共有15个指纹峰，共有指纹峰的相对保留时间分别为：0.712±0.071，0.740 ±0.074，0.749±0.075，0.769±0.077，0.834±0.083，1.000±0.000，1.019±0.102， 1.031±0.103，1.038±0.104，1.045±0.105，1.059±0.106，1.072±0.107，1.173±0.117， 1.191±0.119，1.204±0.120；相对保留峰面积分别为：1.616±0.161，2.631±0.263， 2.036±0.204，12.671±1.267，3.346±0.335，1.000±0.000，0.868±0.087，0.428±0.043， 0.566±0.057，0.854±0.085，0.633±0.063，0.402±0.040，0.417±0.042，0.295±0.030， 0.461±0.046。

本发明药物组合物注射液的质量检测方法，优选如下含量测定和/或指纹图谱检测方 法：

A 药物组合物注射液中总皂苷成分的含量测定方法为：对照品溶液制备，精密称取人 参皂苷Rg1标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成0.999mg/ml的人参皂苷储备 溶液；精密称取黄芪甲苷标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成1.100mg/ml 的黄芪甲苷储备溶液，将以上两种储备溶液按照1∶1(V/V)的比例混合，制成浓度为 1.050mg/ml对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液2.5ml，注 入活化后的C18 SPE柱，依次采用水10ml，1％乙酸‑水15ml，水15ml，10％甲醇‑水10ml， 80％甲醇‑水15ml，洗脱，将80％甲醇‑水洗脱部分蒸干，取甲醇适量定容于2ml容量瓶， 制成供试品溶液；精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml， 高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以 空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

B 药物组合物注射液中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量测定方法为： 对照品溶液制备，称取9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品，配制为15.9μ g/ml的对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸 干，残渣加入1％冰醋酸水溶液2ml使溶解，上C‑18，500mg固相萃取柱，使用前先用无水 甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗分离，以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗脱， 然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱，收集 80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μL分析；液相条件：Agilent Eclipse XDB‑C18(150× 4.6mm，5μm)，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱：15％A(0min)， 25％A(30min)，40％A(40min)，检测波长207nm，柱温30℃，流速0.8ml/min；精密吸取 供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml，高氯酸0.8ml混匀，于60 ℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以空白溶液作参比，在552nm 波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

C 药物组合物注射液指纹图谱的质量检测方法为，谱条件：分析谱柱：Agilent  XDB‑C18 150×4.6mm 5μm，检测波长：205nm，柱温：30℃，流速：0.8ml/min，理论板数 按人参皂苷Rf峰计算应不低于200000，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B， 进行梯度洗脱：0分钟15％A，20分钟19％A，36分钟25.5％A，50分钟50％A，65分钟70％A， 85分钟70％A；质谱条件：电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；气帘气温度(Gas temp)350 ℃；气帘气流速(Gas flow)8L/min；辅助气压力(Nebulizer)为30psi；毛细管电压 (Vcap)4000V；四级杆‑飞行时间串联质谱仪条件(MS QTOF conditions)：碎裂电压 (Fragmentor)175V；截取锥电压(Skimmer)65V；第一重八级杆的射频电压(OCT1 RF  Vpp)750V；供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残 渣加入1％冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg，活化步骤：使用前 先用无水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以 10ml水洗脱，然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml 溶液洗脱，收集80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加 甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；对10％和100％甲醇洗脱 液进行HPLC分析，在对应的保留时间没有皂苷类和黄酮类谱峰；本发明药物组合物 注射液指纹图谱共有15个指纹峰，共有指纹峰的相对保留时间分别为：0.712，0.740， 0.749，0.769，0.834，1.000，1.019，1.031，1.038，1.045，1.059，1.072，1.173， 1.191，1.204；相对保留峰面积分别为：1.616，2.631，2.036，12.671，3.346，1.000， 0.868，0.428，0.566，0.854，0.633，0.402，0.417，0.295，0.461。

本发明药物组合物注射液的质量检测方法，优选如下含量测定和/或指纹图谱检测方 法：

A 药物组合物注射液中总皂苷成分的含量测定方法为：对照品溶液制备，精密称取人 参皂苷Rg1标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成0.98～1.10mg/ml的人参皂苷 储备溶液；精密称取黄芪甲苷标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成1.0mg/ml 的黄芪甲苷储备溶液，将以上两种储备溶液按照1∶1(V/V)的比例混合，制成浓度为 1.0mg/ml对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液2.1ml，注入 活化后的C18 SPE柱，依次采用水10ml，1％乙酸‑水15ml，水15ml，10％甲醇‑水10ml，80％ 甲醇‑水15ml，洗脱，将80％甲醇‑水洗脱部分蒸干，取甲醇适量定容于2ml容量瓶，制成 供试品溶液；精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml， 高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以 空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

B 药物组合物注射液中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量测定方法为： 对照品溶液制备，称取9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品，配制为15.2μ g/ml的对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸 干，残渣加入1％冰醋酸水溶液1～3ml使溶解，上C‑18，500mg固相萃取柱，使用前先用无 水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗分离，以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗脱， 然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱，收集 80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μL分析；液相条件：Agilent Eclipse XDB‑C18(150× 4.6mm，5μm)，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱：15％A(0min)， 25％A(30min)，40％A(40min)，检测波长207nm，柱温30℃，流速0.8ml/min；精密吸 取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml，高氯酸0.8ml混匀，于 60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以空白溶液作参比，在 552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

C 药物组合物注射液指纹图谱检测方法为：谱条件，分析谱柱Agilent XDB‑C18  150×4.6mm 5μm，检测波长205nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，理论板数按人参皂苷Rf 峰计算应不低于200000，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱： 15％A(0min)，19％A(20min)，25.5％A(36min)，50％A(50min)，70％A(65min)， 70％A(85min)；质谱条件：电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；气帘气温度(Gas temp) 350℃；气帘气流速(Gas flow)8L/min；辅助气压力(Nebulizer)为30psi；毛细管电压 (Vcap)：4000V；四级杆‑飞行时间串联质谱仪条件(MS QTOF conditions)：碎裂电压 (Fragmentor)：175V；截取锥电压(Skimmer)：65V；第一重八级杆的射频电压(OCT1 RF  Vpp)750V；供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残 渣加入1％冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg，活化步骤：使用前先 用无水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml 水洗脱，然后以9％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以78％甲醇18ml溶液洗脱， 收集78％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；对10％和100％甲醇洗脱液进行HPLC分析， 在对应的保留时间没有皂苷类和黄酮类谱峰；本发明药物组合物注射液指纹图谱共有 15个指纹峰，共有指纹峰的相对保留时间分别为：0.781，0.791，0.810，0.830，0.91，1.000， 1.119，1.131，1.138，1.145，1159，1.172，1.273，1.291，1.304；相对保留峰面积分别 为：1.776，2.891，2.236，13.671，3.676，1.000，0.948，0.471，0.616，0.939，0.696， 0.442，0.459，0.325，0.507。

本发明药物组合物注射液的质量检测方法，优选如下含量测定和/或指纹图谱检测方 法：

A 药物组合物注射液中总皂苷成分的含量测定方法为：对照品溶液制备，精密称取人 参皂苷Rg1标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成0.98～1.10mg/ml的人参皂苷 储备溶液；精密称取黄芪甲苷标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成1.18mg/ml 的黄芪甲苷储备溶液，将以上两种储备溶液按照1∶1(V/V)的比例混合，制成浓度为 1.09mg/ml对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液3ml，注入 活化后的C18 SPE柱，依次采用水10ml，1％乙酸‑水15ml，水15ml，10％甲醇‑水10ml，80％ 甲醇‑水15ml，洗脱，将80％甲醇‑水洗脱部分蒸干，取甲醇适量定容于2ml容量瓶，制成 供试品溶液；精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml， 高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以 空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

B 药物组合物注射液中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量测定方法为： 对照品溶液制备，称取9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品，配制为16.3μ g/ml的对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸 干，残渣加入1％冰醋酸水溶液3ml使溶解，上C‑18，500mg固相萃取柱，使用前先用无水 甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗分离，以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗脱， 然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱，收集 80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μL分析；液相条件：Agilent Eclipse XDB‑C18(150× 4.6mm，5μm)，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱：15％A(0min)， 25％A(30min)，40％A(40min)，检测波长207nm，柱温30℃，流速0.8ml/min；精密吸 取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml，高氯酸0.8ml混匀，于 60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以空白溶液作参比，在 552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

C 药物组合物注射液指纹图谱检测方法为：谱条件，分析谱柱Agilent XDB‑C18  150×4.6mm 5μm，检测波长205nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，理论板数按人参皂苷Rf 峰计算应不低于200000，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱： 15％A(0min)，19％A(20min)，25.5％A(36min)，50％A(50min)，70％A(65min)， 70％A(85min)；质谱条件：电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；气帘气温度(Gas temp) 350℃；气帘气流速(Gas flow)8L/min；辅助气压力(Nebulizer)为30psi；毛细管电压 (Vcap)：4000V；四级杆‑飞行时间串联质谱仪条件(MS QTOF conditions)：碎裂电压 (Fragmentor)：175V；截取锥电压(Skimmer)：65V；第一重八级杆的射频电压(OCT1 RF  Vpp)750V；供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残 渣加入1％冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg，活化步骤：使用前先 用无水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml 水洗脱，然后以11％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以82％甲醇18ml溶液洗脱， 收集82％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；对10％和100％甲醇洗脱液进行HPLC分析， 在对应的保留时间没有皂苷类和黄酮类谱峰；本发明药物组合物注射液指纹图谱共有 15个指纹峰，共有指纹峰的相对保留时间分别为：0.642，0.670，0.679，0.700，0.75，1.000， 1.009，1.008，1.008，1.005，1.009，1.007，1156，1.072，1.084；相对保留峰面积分别 为：1.455，2.368，1.832，11.404，3.311，1.000，0.781，0.385，0.509，0.769，0.570， 0.362，0.375，0.265，0.415。

上述本发明药物组合物注射液的原料药组成为：黄芪25‑35重量份、人参8‑12重量 份、苦参素0.5‑1.5重量份；本发明药物组合物注射液的制备方法为：以上三味药，人参 用60‑80％的乙醇，回流提取1‑3次，每次1‑2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度 为65℃1.10～1.20的清膏，备用；黄芪加水煎煮1‑3次，每次1‑3小时，滤过，合并滤 液，减压浓缩至相对密度为65℃1.10～1.20的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量 达75％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置10‑18小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩 至相对密度为65℃1.10～1.15的清膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至 6～7，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值 至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量， 搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7， 100‑‑120℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加注射用水至规定 量，滤过，灌装，即得。

上述本发明药物组合物注射液的原料药组成为：黄芪30重量份、人参10重量份、 苦参素1重量份；本发明药物组合物注射液的制备方法为：以上三味药，人参用75％的乙 醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20(65℃) 的清膏，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密 度为1.10～1.20(65℃)的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化 钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～ 1.15(65℃)的清膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置，滤 过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃ 灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15 分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟， 冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加注射用水至规定量，滤过，灌装，即得。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明药物组合物注射液含量测定方法，更加明确了产品的有效成分及其含量测定 方法，能更好的控制产品质量，保证产品更安全、有效；

本发明使用指纹图谱技术有效的控制了本发明药物组合物注射液的质量；通过实验 证明本发明指纹图谱测定方法精密度良好，重现性较好，供试品溶液在24h内稳定性良 好；

本发明通过高分辨质谱对化学成分的鉴定，实验依据更加充分和考靠；所鉴定的 谱峰经过该谱峰(TIC)保留时间区域的质谱图比较，证明该谱峰显示了单一的化合 物；本发明药物组合物注射液谱指纹图谱(除苦参素外)中共鉴定了16个化学成分， 以上化学成分进一步经过高分辨质谱进行了结构确认；四个化学成分来源于药材黄芪， 分别为(6aR，11aR)‑3‑hydroxy‑9，10‑dimethoxypterocarpan‑3‑O‑β‑D‑sambubioside，9，10‑二 甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、2’‑羟基‑3’，4’‑二甲氧基异黄烷‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和 黄芪甲苷；十二个化学成分来源于药材人参，其中8个化学成分(人参皂苷Re，Rg1，Rf， Rb1，Rc，Rg2，Rb2和Rd)来源于人参药材中的原型成分，4个化学成分来源于人参药材 中含量高的原型成分在生产和制剂工艺中(药材提取溶液的酸性环境、较高温度加热80 度，制剂灭菌100度加热)特定工艺条件下分解产生的次级人参皂苷，但本身也是活性 化学成分。

附图：

1.未进行固相萃取处理的本发明药物组合物注射液供试品

2.氧化苦参碱的ESI(+)MS的质谱图

3.氧化苦参碱为UV 205nm检测1

4.氧化苦参碱为UV 205nm检测2

5.本发明药物组合物注射液中化学成分低分辨LC‑MS鉴定

6.本发明药物组合物注射液中化学成分低分辨LC‑MS鉴定人参皂苷Rg1

7.本发明药物组合物注射液中化学成分低分辨LC‑MS鉴定人参皂苷Re

8.9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(No.4)

9.2’‑羟基‑3’，4’‑二甲氧基异黄烷‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(No.5)

10.人参皂苷Rf(No.6)

11.人参皂苷Rb1(No.7)

12.人参皂苷Rc(No.8)

13.人参皂苷Rg2(No.9)

14.人参皂苷Rb2(No.10)

15.人参皂苷Rh1(No.11)

16.黄芪甲苷(No.12)

17.人参皂苷Rd(No.13)

18.人参皂苷Rg5，Rg6，RK1，F4

19.人参皂苷Rh4或Rk3(No.15)

20.人参皂苷Rk3或Rh4(No.16)

21‑1.ESI(‑)负离子的总离子流图(TIC)

21‑2.DAD检测器图谱(205nm)

22.本发明药物组合物注射液组分高分辨LC‑MS鉴定(No.1)

23.人参皂苷Rg1(No.2)

24.人参皂苷Re(No.3)

25.9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(No.4)

26.2’‑羟基‑3’，4’‑二甲氧基异黄烷‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(No.5)

27.人参皂苷Rf(No.6)

28.人参皂苷Rb1(No.7)

29.人参皂苷Rc(No.8)

30.人参皂苷Rg2(No.9)

31.人参皂苷Rb2(No.10)

32.人参皂苷Rh1(No.11)

33.黄芪甲苷(No.12)

34.人参皂苷Rd(No.13)

35.人参皂苷Rg5、F4、Rk1或Rg6(No.14)

36.人参皂苷Rh4或Rk3(No.15)

37.人参皂苷Rk3或Rh4(No.16)

38.本发明药物组合物注射液150min图谱

39.空白梯度图谱

40.本发明药物组合物注射液指纹图谱

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明；本发明实验例中药物组合物 注射液均由实施例1方法制备。

实验例1 HPLC‑ESI‑Iontrap分析鉴定本发明药物组合物注射液中的化学成分

1仪器与谱质谱条件

1.1仪器与材料

高效液相谱‑质谱联用仪：

高效液相：Agilent 1200 series；质谱：Bruker HCT Iontrap(三维离子阱质谱仪)

谱纯乙腈(Acetonitrile)：HPLC grade，Fisher Scientific

谱纯甲醇(Methanol)：HPLC grade，Tianjin Jizhun Chemicals

超纯水(Water)：ultra‑pure water

固相萃取柱(SPE)：Tianjin Shuangji chromatography scientific

1.2谱条件

分析谱柱：Agilent XDB‑C18 150×4.6mm 5μm

检测波长：205nm，柱温：30℃，流速：0.8ml/min

理论板数按人参皂苷Rf峰计算应不低于200000

Timetable：

1.3质谱条件

ESI conditions：

Gas Temp：350℃

Drying Gas：8L/min

Nebulizer：30psi

Vcap：4000V

MS Iontrap conditions：

Capillary Exit：145V

Skimmer：40V

1.4工作站

Bruker ESI Compass 1.3 for HCT/Esquire

Data Analysis version 4.0

2供试品溶液制备

2.1样品前处理

本发明药物组合物注射液中(实施例1制备)含有大量的苦参素(10mg/mL)，而苦参 素是氧化苦参碱(Oxymatrine)与极少量氧化槐果碱(Oxysophocarpine)的混合碱，本实验 以液质联用(LC‑MS)方法鉴定了大量氧化苦参碱的存在；

HPLC‑ESI‑MS分析：

在谱指纹图谱开始2‑5min出现一很大的谱峰(图1)，经HPLC‑ESI‑MS鉴定为 苦参素；氧化苦参碱的分子量为264.4，质谱图中的265.1为氧化苦参碱的[M+H]⁺峰， 529.2为氧化苦参碱的[2M+H]⁺峰(图2)；

为了避免大量苦参素的存在对人参和黄芪化学成分分析的干扰，我们采用固相萃取 方法除去大量的苦参素。

2.2样品前处理实验步骤：

精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残渣加入1％冰醋酸水溶液2ml 使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg；活化步骤：使用前先用无水甲醇5ml、再用5ml 双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗脱，然后以10％甲 醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱，收集80％甲醇洗 脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm 微孔滤膜过滤，进样10μl分析；

备注：利用薄层谱法(TLC)鉴定酸水洗脱液、水洗脱液含有大量苦参素，10％ 甲醇洗脱液中含有极少量的苦参素，80％甲醇洗脱液未见苦参素斑点，而显示紫红皂 苷的斑点；100％甲醇洗脱液未见明显斑点；

进一步对10％和100％甲醇洗脱液进行HPLC分析，在对应的保留时间没有皂苷类和 黄酮类谱峰。

氧化苦参碱的结构式

3实验结果

3.1本发明药物组合物注射液HPLC‑ESI‑Iontrap分析图谱

图2为ESI(+)正离子的总离子流图(TIC)，图3、图4为UV 205nm检测；

3.2各谱峰(UV图)的化合物结构鉴定

4本发明药物组合物注射液中化学成分低分辨LC‑MS鉴定

4.1(6aR，11aR)‑3‑hydroxy‑9，10‑dimethoxypterocarpan‑3‑O‑β‑D‑sambubioside(No.1) (见图5)

(6aR，11aR)‑3‑hydroxy‑9，10‑dimethoxypterocarpan‑3‑O‑B‑D‑ sambubioside

4.2人参皂苷Rg1(No.2)(见图6)

  分子式   离子化形式   测定值  鉴定

  C ₄₂H ₇₂O ₁₄   [M+Na] ⁺   823.6  人参皂苷Rg1

化学结构：

4.3人参皂苷Re(No.3)(见图7)

  分子式   离子化形式   测定值   鉴定

  C ₄₈H ₈₂O ₁₈   [M+Na] ⁺   969.6   人参皂苷Re

化学结构：

4.4 9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(No.4)(见图8)

化学结构：

9，10‑Dimethoxypterocarpan‑3‑O‑B‑D‑glucoside

4.5 2’‑羟基‑3’，4’‑二甲氧基异黄烷‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(No.5)(见图9)

化学结构：

6号谱峰

经本发明药物组合物注射液、人参药材、黄芪药材的谱指纹图谱比较，该谱峰 不是原来药材中含有的化学成分，应该是在生产和制剂工艺中产生的分解产物，经质谱 分析不纯，含有少量皂苷化合物和其他杂质；而且在多批次的本发明药物组合物注射液 分析中峰面积变化大，所以不作为指纹图谱共有峰。

4.6人参皂苷Rf(No.6)(见图10)

 分子式   离子化形式   测定值   鉴定

 C ₄₂H ₇₂O ₁₄   [M+Na] ⁺   823.6   人参皂苷Rf

化学结构：

4.7人参皂苷Rb1(No.7)(见图11)

 分子式   离子化形式   测定值  鉴定

 C ₅₄H ₉₂O ₂₃   [M+Na] ⁺   1131.6  人参皂苷Rb1

化学结构：

4.8人参皂苷Rc(No.8)(见图12)

 分子式   离子化形式   测定值   鉴定

 C ₅₃H ₉₀O ₂₂   [M+Na] ⁺   1101.6   人参皂苷Rc

化学结构：

4.9人参皂苷Rg2(No.9)(见图13)

 分子式   离子化形式   测定值   鉴定

 C ₄₂H ₇₂O ₁₃   [M+Na] ⁺   807.6   Ginsenoside‑Rg2

化学结构：

4.10人参皂苷Rb2(No.10)(见图14)

 分子式   离子化形式   测定值  鉴定

 C ₅₃H ₉₀O ₂₂   [M+Na] ⁺   1101.6  人参皂苷Rb2

化学结构：

4.11人参皂苷Rh1(No.11)(见图15)

  分子式   离子化形式   测定值  鉴定

  C ₃₆H ₆₂O ₉   [M+Na] ⁺   661.5  人参皂苷Rh1

化学结构：

4.12黄芪甲苷(No.12)(见图16)

 分子式   离子化形式   测定值   鉴定

 C ₄₁H ₆₈O ₁₄   [M+Na] ⁺   807.6   黄芪甲苷

化学结构：

4.13人参皂苷Rd(No.13)(见图17)

 分子式   离子化形式   测定值   鉴定

 C ₄₈H ₈₂O ₁₈   [M+Na] ⁺   969.6   人参皂苷Rd

化学结构：

4.14 14号谱峰：

鉴定为分子量和分子式相同的以下四个化合物之一：人参皂苷Rg5，Rg6，RK1，F4； (见图18)

由于是生产和制剂过程中产生的分解产物‑次级人参皂苷，没有进一步确认具体化合 物；

 分子式   离子化形式   测定值   鉴定

 C ₄₂H ₇₀O ₁₂   [M+Na] ⁺   789.6   人参皂苷Rg5 Rg6，RK1，或

  F4；

化学结构：

4.15人参皂苷Rh4或Rk3(No.15)(见图19)

注：结构式见4.16项下；

4.16人参皂苷Rk3或Rh4(No.16)(见图20)

化学结构：

实验例2 UHPLC‑ESI‑QTOF分析鉴定本发明药物组合物注射液中的化学成分

1仪器与谱质谱条件

1.1仪器

超高压高效液相谱仪(UHPLC)：Agilent 1290 series‑DAD UV‑Detection

质谱：Agilent 6520 QTOF(四极杆‑飞行时间串联质谱仪)

乙腈(Acetonitrile)：HPLC grade，Fisher Scientific

甲醇(Methanol)：HPLC grade，Tianjin Jizhun Chemicals

超纯水(ultra‑pure water)

固相萃取柱(SPE)：Tianjin Shuangji chromatography scientific

1.2谱条件

Analytical column：Agilent XDB‑C18 150×4.6mm 5μm(为了与上面离子阱质谱分析 的谱图对应，选用同一根谱柱，以分流方式进质谱检测器分析)，检测波长：205nm， 柱温：30℃，流速：0.8ml/min，理论版数按Rf峰计算应不低于200000；

Timetable：

1.3质谱条件

ESI conditions：

Gas Temp：350℃；Drying Gas：8L/min；Nebulizer：30psi；Vcap：4000V

MS QTOF conditions：

Fragmentor：175V；Skimmer：65V；OCT1 RF Vpp：750V

1.4工作站

Agilent MassHunter Workstation Qualitative Analysis

Version B.03.01 Build 3.1.346.0，Agilent Technologies Inc.2003‑2009

2供试品溶液制备

同“实验例1，2项”下

3实验结果

3.1本发明药物组合物注射液UHPLC‑ESI‑QTOF分析图谱(见图21)

3.2鉴定结构

为了谱峰号与液相‑低分辨质谱联用分析结果相对应，采用了与实验例1项下图谱 相同的谱峰编号；

^*分子式和分子量一样的化合物鉴定是结合化学对照品的谱保留时间确定化合物归属；

4本发明药物组合物注射液组分高分辨LC‑MS鉴定

4.1(6aR，11aR)‑3‑hydroxy‑9，10‑dimethoxypterocarpan‑3‑O‑β‑D‑sambubioside(No.1) (见图22)

4.2人参皂苷Rg1(No.2)(见图23)

化学结构：

4.3人参皂苷Re(No.3)(见图24)

化学结构：

4.4 9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(No.4)(见图25)

化学结构：

4.5 2’‑羟基‑3’，4’‑二甲氧基异黄烷‑7‑O‑β‑D‑葡萄糖苷(No.5)(见图26)

化学结构：

4.6人参皂苷Rf(No.6)(见图27)

化学结构：

4.7人参皂苷Rb1(No.7)(见图28)

 分子式   分子离子   计算值   测定值  误差(ppm)  鉴定

 C ₅₄H ₉₂O ₂₃   [M‑H] ^‑   1107.5957   1107.5960  ‑0.39  人参皂苷Rb1

化学结构：

4.8人参皂苷Rc(No.8)(见图29)

 分子式   分子离子   计算值   测定值  误差(ppm)   鉴定

 C ₅₃H ₉₀O ₂₂   [M‑H] ^‑   1077.5851   1077.5853  ‑0.27   人参皂苷Rc

化学结构：

4.9人参皂苷Rg2(No.9)(见图30)

化学结构：

4.10人参皂苷Rb2(No.10)(见图31)

 分子式   分子离子   计算值   测定值  误差(ppm)  鉴定

 C ₅₃H ₉₀O ₂₂   [M‑H] ^‑   1077.5851   1077.5855  ‑0.24  人参皂苷Rb2

化学结构：

4.11人参皂苷Rh1(No.11)(见图32)

  分子式   分子离子   计算值   测定值  误差(ppm)  鉴定

  C ₃₆H ₆₂O ₉   [M+HCOO] ^‑   683.4376   683.4383  ‑1.12  人参皂苷Rh1

化学结构：

4.12黄芪甲苷(No.12)(见图33)

 分子式   分子离子   计算值   测定值  误差(ppm)   鉴定

 C ₄₁H ₆₈O ₁₄   [M+HCOO] ^‑   829.4591   829.4587   0.61   黄芪甲苷

化学结构：

4.13人参皂苷Rd(No.13)(见图34)

  分子式   分子离子   计算值   测定值  误差(ppm)   鉴定

  C ₄₈H ₈₂O ₁₈   [M‑H] ^‑   945.5428   945.5422  0.85   人参皂苷Rd

  [M+HCOO] ^‑   991.5483   991.5466  1.89

化学结构：

4.14人参皂苷Rg5、F4、Rk1或Rg6(No.14)(见图35)

化学结构：

4.15人参皂苷Rh4或Rk3(No.15)(见图36)

化学结构见4.16

4.16人参皂苷Rk3或Rh4(No.16)(见图37)

化学结构：

实验例3 精密度实验

仪器与材料：高效液相：Agilent 1200 series，谱纯乙腈(Acetonitrile)：HPLC grade， Fisher Scientific，谱纯甲醇(Methanol)：HPLC grade，Tianjin Jizhun Chemicals，超纯水 (Water)：ultra‑pure water，固相萃取柱(SPE)：Tianjin Shuangji chromatography scientific

谱条件：分析谱柱：Agilent XDB‑C18 150×4.6mm 5μm，检测波长：205nm，柱温： 30℃，流速：0.8ml/min，理论板数按人参皂苷Rf峰计算应不低于200000

Timetable：

供试液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残渣加入1％冰 醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg；活化步骤：使用前先用无水甲 醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗 脱，然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱， 收集80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；

取上述同一供试液，连续进样6次，按上述谱条件测定，选择15个共有峰进行比 较，结果(见表1、2)表明各共有峰相对保留时间RSD≤0.099％，各共有峰相对峰面积 RSD≤2.962％，表明精密度良好。

表1精密度实验结果(相对保留时间)

表2精密度实验结果(相对保留面积)

实验例4重现性实验

按照实验例4的制备方法操作制备6份供试液，按上述谱条件测定，结果(见表3、 4)表明各共有峰相对保留时间RSD≤0.145％，各共有峰相对峰面积RSD≤2.806％；表 明其重现性较好。

表3重现性实验结果(相对保留时间)

表4重现性实验结果(相对保留面积)

实验例5稳定性实验

按照实验例4的制备方法操作制备供试液，取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8， 12，24h按上述谱条件测定，结果(见表5、6)各共有峰相对保留时间RSD≤0.029％， 各共有峰相对峰面积RSD≤2.352％；表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

表5稳定性实验结果(相对保留时间)

表6稳定性实验结果(相对保留面积)

实验例6本发明药物组合物注射液指纹图谱的建立

1 HPLC指纹图谱的建立及共有指纹峰的标定

以《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》建立本发明药物组合物注射液 HPLC/UV指纹图谱；通过记录150min图谱(见图38)，可以看到80min后再无谱峰出 现，从而确定指纹图谱的采集时间为80min，而且其中前2min内的两个峰分别为溶剂峰 和苦参素峰，68min左右为流动相梯度洗脱引起的溶剂峰，空白图谱也可证明此峰为溶 剂峰(见图39)；按照供试品溶液制备方法操作，制备10批康艾注射液供试品溶液，通 过比较10批供试品HPLC谱图的分析检测结果，结合《康艾注射液中成分分析鉴定》 研究鉴定的各谱峰的化学成分归属，选定其中15个共有的谱峰为共有指纹峰，建立 了康艾注射液的HPLC谱指纹图谱(见图40)；

指纹图谱中6号谱峰经质谱解析、化学对照品分析对比，鉴定为人参皂苷Rf，其 峰面积约占总峰面积的4％，比较稳定，因此选其为参照峰，标为S，将各谱峰保留时 间与同一图谱中参照峰的保留时间比较，其比值为各谱峰的相对保留时间，将各谱 峰峰面积与同一图谱中参照峰的峰面积比较，其比值为各谱峰的相对峰面积；

2各谱峰的化学成分归属

各共有峰的鉴定是以化学对照品的HPLC保留时间分析对比结合高分辨及低分辨 LC‑MS，再结合比较课题组前期化学成分研究结果而最后确定了以下15个共有谱峰的 化学成分归属；

*6号峰Ginsenoside‑Rf稳定，分离度等谱行为较好，故将其作为参照峰；

**由于Ginsenoside‑Rh1和astragaloside IV两个谱峰不能达到基线分离，故以其 总峰面积计算，进行方法学评价。

实验例7本发明药物组合物注射液中总皂苷成分含量测定

本发明药物组合物注射液中皂苷类成分主要包括人参皂苷和黄芪皂苷，其中人参皂 苷为人参皂苷Re，、Rg1、Rf、Rb1、Rc，、Rg2、Rb2、Rd、Rh1、Rg5、Rh4和Rk3， 黄芪皂苷是以黄芪甲苷为主要成分的黄芪皂苷类成分；制定本发明药物组合物注射液总 皂苷测定的方法：配制混合对照品后在相同条件下测定人参皂苷和黄芪皂苷的总含量；

对照品溶液制备：精密称取人参皂苷Rg1标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容， 配制成0.999mg/ml的人参皂苷储备溶液；精密称取黄芪甲苷标准品，置于容量瓶中，甲 醇溶解并定容，配制成1.100mg/ml的黄芪甲苷储备溶液，将以上两种储备溶液按照 1∶1(V/V)的比例混合，制成浓度为1.050mg/ml对照品溶液；

供试品溶液：精密量取本发明药物组合物注射液2.5ml，注入活化后的C18 SPE柱， 依次采用水10ml，1％乙酸‑水15ml，水15ml，10％甲醇‑水10ml，80％甲醇‑水15ml，洗 脱；将80％甲醇‑水洗脱部分蒸干，取甲醇适量定容于2ml容量瓶，制成供试品溶液；

测定方法：精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml， 高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min； 以空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量；

人参和黄芪总皂苷测定：取批号为110440、110441、110445共3批本发明药物组合 物注射液，按上述方法制备供试品溶液，在上述条件下取样分析，记录吸光度，计算含 量，结果见表7。

表7总皂苷的含量测定结果(n＝3)

实验例8 本发明药物组合物注射液中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷含量测 定

对照品溶液制备：称取9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品，配制为15.9 μg/ml的对照品溶液

供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残渣加入1％ 冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg；活化步骤：使用前先用无水 甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水 洗脱，然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗 脱，收集80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至 刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；

液相条件：Agilent Eclipse XDB‑C18(150×4.6mm，5μm)，流动相为

检测波长207nm，柱温30℃，流速0.8ml/min

含量测定：精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml， 高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min； 以空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，结 果列于表8。

表8 9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量测定结果(n＝3)

本发明药物组合物注射液中有效成分含量分析：注射液中苦参素的加入含量为 10mg/ml；本发明药物组合物注射液有效成分包括苦参素、人参和黄芪总皂苷和黄酮类成 分；批号为110440康艾注射液中每10ml总固体质量为104.9mg，苦参素含量为 97mg/10ml，总皂苷含量为4.83mg/10ml，黄酮中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷 含量为0.13mg/10ml；所以本发明药物组合物注射液中有效成分占总总固体的97.19％， 符合中药注射液相关标准。

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

实施例1 UHPLC‑ESI‑QTOF本发明药物组合物注射液薄层鉴别方法

本发明药物组合物注射液的制备方法为：黄芪28kg、人参12kg、苦参素0.9kg，人 参用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10 (65℃)的清膏，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至 相对密度为1.20(65℃)的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化钠 调PH值至6，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10(65℃)的 清膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6，静置，滤过，滤液回收乙醇至 无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤； 用氢氧化钠调PH值至6，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参 素溶解，用稀盐酸调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并， 混匀，加注射用水至规定量，滤过，灌装，即得；谱条件：分析谱柱：Agilent XDB‑C18 150×4.6mm 5μm，检测波长：205nm，柱温：30℃，流速：0.8ml/min，理论板数按人参皂 苷Rf峰计算应不低于200000，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗 脱：15％A(0min)，19％A(20min)，25.5％A(36min)，50％A(50min)，70％A(65min)， 70％A(85min)；

质谱条件：电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；气帘气温度(Gas temp)350℃；气 帘气流速(Gas flow)8L/min；辅助气压力(Nebulizer)为30psi；Vcap(毛细管电压)：4000V； MS QTOF conditions(四级杆‑飞行时间串联质谱仪条件)：Fragmentor(碎裂电压)：175V； Skimmer(截取锥电压)：65V；OCT1 RF Vpp(第一重八级杆的射频电压)：750V；

供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残渣加入1％ 冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg，活化步骤：使用前先用无水甲 醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗脱， 然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱，收集 80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；对10％和100％甲醇洗脱液进行HPLC分析，在对 应的保留时间没有皂苷类和黄酮类谱峰；

本发明药物组合物注射液指纹图谱共有15个指纹峰，共有指纹峰的相对保留时间分 别为：0.712，0.740，0.749，0.769，0.834，1.000，1.019，1.031，1.038，1.045， 1.059，1.072，1.173，1.191，1.204；相对保留峰面积分别为：1.616，2.631，2.036， 12.671，3.346，1.000，0.868，0.428，0.566，0.854，0.633，0.402，0.417，0.295， 0.461。

(结果见附图40)

实施例2 本发明药物组合物注射液质量检测方法

A 药物组合物注射液中总皂苷成分的含量测定方法为：对照品溶液制备，精密称取人 参皂苷Rg1标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成0.999mg/ml的人参皂苷储备 溶液；精密称取黄芪甲苷标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成1.100mg/ml 的黄芪甲苷储备溶液，将以上两种储备溶液按照1∶1(V/V)的比例混合，制成浓度为 1.050mg/ml对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液2.5ml，注 入活化后的C18 SPE柱，依次采用水10ml，1％乙酸‑水15ml，水15ml，10％甲醇‑水10ml， 80％甲醇‑水15ml，洗脱，将80％甲醇‑水洗脱部分蒸干，取甲醇适量定容于2ml容量瓶， 制成供试品溶液；精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml， 高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以 空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

B 药物组合物注射液中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量测定方法为： 对照品溶液制备，称取9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品，配制为15.9μ g/ml的对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸 干，残渣加入1％冰醋酸水溶液2ml使溶解，上C‑18，500mg固相萃取柱，使用前先用无水 甲醇5ml、再用5ml)双蒸水冲洗分离，以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗脱， 然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱，收集 80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μL分析；液相条件：Agilent Eclipse XDB‑C18(150× 4.6mm，5μm)，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱：15％A(0min)， 25％A(30min)，40％A(40min)检测波长207nm，柱温30℃，流速0.8ml/min；精密吸取 供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml，高氯酸0.8ml混匀，于60 ℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以空白溶液作参比，在552nm 波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

C 药物组合物注射液指纹图谱的质量检测方法为，谱条件：分析谱柱：Agilent  XDB‑C18 150×4.6mm 5μm，检测波长：205nm，柱温：30℃，流速：0.8ml/min，理论板数 按人参皂苷Rf峰计算应不低于200000，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进 行梯度洗脱：15％A(0min)，19％A(20min)，25.5％A(36min)，50％A(50min)，70％A (65min)，70％A(85min)；质谱条件：电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；气帘气温度 (Gas temp)350℃；气帘气流速(Gas flow)8L/min；辅助气压力(Nebulizer)为30psi；Vcap(毛 细管电压)：4000V；MS QTOF conditions(四级杆‑飞行时间串联质谱仪条件)：Fragmentor (碎裂电压)：175V；Skimmer(截取锥电压)：65V；OCT1 RF Vpp(第一重八级杆的射频 电压)：750V；供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残 渣加入1％冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg，活化步骤：使用前先 用无水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml 水洗脱，然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗 脱，收集80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻 度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；对10％和100％甲醇洗脱液进行HPLC 分析，在对应的保留时间没有皂苷类和黄酮类谱峰；

本发明药物组合物注射液指纹图谱共有15个指纹峰，共有指纹峰的相对保留时间分 别为：0.712，0.740，0.749，0.769，0.834，1.000，1.019，1.031，1.038，1.045， 1.059，1.072，1.173，1.191，1.204；相对保留峰面积分别为：1.616，2.631，2.036， 12.671，3.346，1.000，0.868，0.428，0.566，0.854，0.633，0.402，0.417，0.295， 0.461；

本发明药物组合物注射液的制备方法为：黄芪28kg、人参12kg、苦参素0.9kg，人 参用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10 (65℃)的清膏，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩 至相对密度为1.20(65℃)的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧 化钠调PH值至6，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10(65℃) 的清膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6，静置，滤过，滤液回收乙 醇至无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏， 抽滤；用氢氧化钠调PH值至6，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用； 另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的 药液合并，混匀，加注射用水至规定量，滤过，灌装，即得。

实施例3 本发明药物组合物注射液中总皂苷成分含量测定

本发明药物组合物注射液的制备方法为：黄芪28kg、人参12kg、苦参素0.9kg，人 参用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10 (65℃)的清膏，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩 至相对密度为1.20(65℃)的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧 化钠调PH值至6，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10(65℃) 的清膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6，静置，滤过，滤液回收乙 醇至无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏， 抽滤；用氢氧化钠调PH值至6，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用； 另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的 药液合并，混匀，加注射用水至规定量，滤过，灌装，即得；

对照品溶液制备：精密称取人参皂苷Rg1标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容， 配制成0.999mg/ml的人参皂苷储备溶液；精密称取黄芪甲苷标准品，置于容量瓶中，甲 醇溶解并定容，配制成1.100mg/ml的黄芪甲苷储备溶液，将以上两种储备溶液按照 1∶1(V/V)的比例混合，制成浓度为1.050mg/ml对照品溶液；

供试品溶液：精密量取本发明药物组合物注射液2.5ml，注入活化后的C18 SPE柱， 依次采用水10ml，1％乙酸‑水15ml，水15ml，10％甲醇‑水10ml，80％甲醇‑水15ml，洗 脱；将80％甲醇‑水洗脱部分蒸干，取甲醇适量定容于2ml容量瓶，制成供试品溶液；

测定方法：精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml， 高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min， 以空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即 得。

实施例4 本发明药物组合物注射液中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷含量测定

对照品溶液制备：称取9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品，配制为15.9 μg/ml的对照品溶液

供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残渣加入1％ 冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg；活化步骤：使用前先用无水 甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水 洗脱，然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗 脱，收集80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至 刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；

液相条件：Agilent Eclipse XDB‑C18(150×4.6mm，5μm)，流动相：以乙腈为流动 相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱：15％A(0min)，25％A(30min)，40％A(40min) 检测波长207nm，柱温30℃，流速0.8ml/min

含量测定：精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml， 高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min； 以空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即 得；

本发明药物组合物注射液的制备方法为：黄芪30kg、人参10kg、苦参素1kg，人参 用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.15 (65℃)的清膏，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩 至相对密度为1.15(65℃)的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧 化钠调PH值至7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.12(65℃) 的清膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至7，静置，滤过，滤液回收乙 醇至无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至7，100℃灭菌30分钟，冷藏， 抽滤；用氢氧化钠调PH值至7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用； 另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的 药液合并，混匀，加注射用水至规定量，滤过，灌装，即得。

实施例5 本发明药物组合物注射液薄层鉴别方法

本发明药物组合物注射液的制备方法为：黄芪28kg、人参12kg、苦参素0.9kg，人参 用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10(65℃) 的清膏，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度 为1.20(65℃)的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化钠调PH值至 6，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10(65℃)的清膏；再 加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味， 加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化 钠调PH值至6，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解， 用稀盐酸调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加 注射用水至规定量，滤过，灌装，即得；A药物组合物注射液中总皂苷成分的含量测定方 法为：对照品溶液制备，精密称取人参皂苷Rg1标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容， 配制成0.98～1.10mg/ml的人参皂苷储备溶液；精密称取黄芪甲苷标准品，置于容量瓶中， 甲醇溶解并定容，配制成1.0mg/ml的黄芪甲苷储备溶液，将以上两种储备溶液按照1∶1(V/V) 的比例混合，制成浓度为1.0mg/ml对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物 组合物注射液2.1ml，注入活化后的C18 SPE柱，依次采用水10ml，1％乙酸‑水15ml，水15ml， 10％甲醇‑水10ml，80％甲醇‑水15ml，洗脱，将80％甲醇‑水洗脱部分蒸干，取甲醇适量定 容于2ml容量瓶，制成供试品溶液；精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干， 加入香草醛0.2ml，高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀， 冰浴冷却1min，以空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总 皂苷的量，即得；

B 药物组合物注射液中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量测定方法为： 对照品溶液制备，称取9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品，配制为15.2μ g/ml的对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸 干，残渣加入1％冰醋酸水溶液1～3ml使溶解，上C‑18，500mg固相萃取柱，使用前先用无 水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗分离，以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗脱， 然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱，收集 80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μL分析；液相条件：Agilent Eclipse XDB‑C18(150× 4.6mm，5μm)，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱：15％A(0min)， 25％A(30min)，40％A(40min)，检测波长207nm，柱温30℃，流速0.8ml/min；精密吸 取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml，高氯酸0.8ml混匀，于 60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却lmin，以空白溶液作参比，在 552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

C 药物组合物注射液指纹图谱检测方法为：谱条件，分析谱柱Agilent XDB‑C18  150×4.6mm 5μm，检测波长205nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，理论板数按人参皂苷 Rf峰计算应不低于200000，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱： 15％A(0min)，19％A(20min)，25.5％A(36min)，50％A(50min)，70％A(65min)， 70％A(85min)；质谱条件：电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；气帘气温度(Gas temp) 350℃；气帘气流速(Gas flow)8L/min；辅助气压力(Nebulizer)为30psi；毛细管电压 (Vcap)：4000V；四级杆‑飞行时间串联质谱仪条件(MS QTOF conditions)：碎裂电压 (Fragmentor)：175V；截取锥电压(Skimmer)：65V；第一重八级杆的射频电压(OCT1 RF  Vpp)750V；供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残 渣加入1％冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg，活化步骤：使用前先 用无水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml 水洗脱，然后以9％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以78％甲醇18ml溶液洗脱， 收集78％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；对10％和100％甲醇洗脱液进行HPLC分析， 在对应的保留时间没有皂苷类和黄酮类谱峰；本发明药物组合物注射液指纹图谱共有 15个指纹峰，共有指纹峰的相对保留时间分别为：0.781，0.791，0.810，0.830，0.91，1.000， 1.119，1.131，1.138，1.145，1159，1.172，1.273，1.291，1.304；相对保留峰面积分别 为：1.776，2.891，2.236，13.671，3.676，1.000，0.948，0.471，0.616，0.939，0.696， 0.442，0.459，0.325，0.507。

实施例6 本发明药物组合物注射液薄层鉴别方法

A 药物组合物注射液中总皂苷成分的含量测定方法为：对照品溶液制备，精密称取人 参皂苷Rg1标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成0.98～1.10mg/ml的人参皂苷 储备溶液；精密称取黄芪甲苷标准品，置于容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成1.18mg/ml 的黄芪甲苷储备溶液，将以上两种储备溶液按照1∶1(V/V)的比例混合，制成浓度为 1.09mg/ml对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液3ml，注入 活化后的C18 SPE柱，依次采用水10ml，1％乙酸‑水15ml，水15ml，10％甲醇‑水10ml，80％ 甲醇‑水15ml，洗脱，将80％甲醇‑水洗脱部分蒸干，取甲醇适量定容于2ml容量瓶，制成 供试品溶液；精密吸取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml， 高氯酸0.8ml混匀，于60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以 空白溶液作参比，在552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

B 药物组合物注射液中9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷的含量测定方法为： 对照品溶液制备，称取9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品，配制为16.3μ g/ml的对照品溶液；供试品溶液制备，精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸 干，残渣加入1％冰醋酸水溶液3ml使溶解，上C‑18，500mg固相萃取柱，使用前先用无水 甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗分离，以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml水洗脱， 然后以10％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以80％甲醇18ml溶液洗脱，收集 80％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μL分析；液相条件：Agilent Eclipse XDB‑C18(150× 4.6mm，5μm)，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱：15％A(0min)， 25％A(30min)，40％A(40min)，检测波长207nm，柱温30℃，流速0.8ml/min；精密吸 取供试品溶液200μL，置于试管中，氮气吹干，加入香草醛0.2ml，高氯酸0.8ml混匀，于 60℃进行显反应15min，加入冰醋酸5ml混匀，冰浴冷却1min，以空白溶液作参比，在 552nm波长下，测定吸光度，代入标准曲线计算总皂苷的量，即得；

C 药物组合物注射液指纹图谱检测方法为：谱条件，分析谱柱Agilent XDB‑C18 150×4.6mm 5μm，检测波长205nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，理论板数按人参皂苷 Rf峰计算应不低于200000，流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱： 15％A(0min)，19％A(20min)，25.5％A(36min)，50％A(50min)，70％A(65min)， 70％A(85min)；质谱条件：电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；气帘气温度(Gas temp) 350℃；气帘气流速(Gas flow)8L/min；辅助气压力(Nebulizer)为30psi；毛细管电压 (Vcap)：4000V；四级杆‑飞行时间串联质谱仪条件(MS QTOF conditions)：碎裂电压 (Fragmentor)：175V；截取锥电压(Skimmer)：65V；第一重八级杆的射频电压(OCT1 RF  Vpp)750V；供试品溶液制备：精密量取本发明药物组合物注射液10ml，水浴蒸干，残 渣加入1％冰醋酸水溶液2ml使溶解，上固相萃取柱(C‑18，500mg，活化步骤：使用前先 用无水甲醇5ml、再用5ml双蒸水冲洗)分离，先以15ml 1％冰醋酸水溶液洗脱，再以10ml 水洗脱，然后以11％甲醇水溶液15ml洗脱，弃去上述洗脱液，再以82％甲醇18ml溶液洗脱， 收集82％甲醇洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl分析；对10％和100％甲醇洗脱液进行HPLC分析， 在对应的保留时间没有皂苷类和黄酮类谱峰；本发明药物组合物注射液指纹图谱共有 15个指纹峰，共有指纹峰的相对保留时间分别为：0.642，0.670，0.679，0.700，0.75，1.000， 1.009，1.008，1.008，1.005，1.009，1.007，1156，1.072，1.084；相对保留峰面积分别 为：1.455，2.368，1.832，11.404，3.311，1.000，0.781，0.385，0.509，0.769，0.570， 0.362，0.375，0.265，0.415；

发明药物组合物注射液的制备方法为：黄芪28kg、人参12kg、苦参素0.9kg，人参用75％ 的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10(65℃) 的清膏，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密 度为1.20(65℃)的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化钠调PH 值至6，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10(65℃)的清 膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6，静置，滤过，滤液回收乙醇至 无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽 滤；用氢氧化钠调PH值至6，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另 取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药 液合并，混匀，加注射用水至规定量，滤过，灌装，即得。