落新妇苷在制备或预防糖尿病合并中风药物中的应用

落新妇苷在制备或预防糖尿病合并中风药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种药物新用途，具体地涉及落新妇苷在制备或预防糖尿病合并中风的 药物中的应用。

背景技术

中风是严重危害人类健康的重大疾病之一，全世界六分之一的人在其生命过程会至少遭遇 一次中风，是成人死亡和致残的一个重要原因。糖尿病是是第一次发生中风的患者一种特别 高的危险因素，尤其对于2型糖尿病患者发生中风的可能性比非2型糖尿病患者高2-5倍 【Zafar A，Shahid SK，Siddiqui M，Khan FS.Pattern of stroke in type 2diabetic subjects versus non diabetic subjects.J Ayub Med Coll Abbottabad.2007；19(4)：64-67.】，而其中最近一次发生 中风的70％患者有明显的糖尿病或糖尿病前期，包括空腹血糖受损(IFG)和葡萄糖耐量减 退(IGT)[Kernan WN，Inzucchi SE.Type 2diabetes mellitus and insulin resistance：stroke prevention and management.Curr Treat Options Neurol 2004；6：443-450]，所以2型糖尿病合并 中风造成的危害比单纯非糖尿病原性中风要大得多，尤其最近随着人民生活水平和生活方式 的改变，我国2型糖尿病患者呈爆炸式增长，接诊的急性糖尿病并发症住院率比美国高出三 倍。“【Alcorn T，Ouyang Y.Diabetes saps health and wealth from China′s rise.Lancet.2012； 379(9833)：2227-2278.】，所以对2型糖尿病原性中风的显得尤为重要。

土茯苓为百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎。分布长江流域以南等地， 土茯苓性味甘淡，平。无毒。归肝、胃经。具有除湿，解毒，通利关节等功效，用于梅毒及 汞中毒所致的肢体拘挛、筋骨疼痛，湿热淋虫，带下，痈肿，疥癣，瘰疬，疥癣。《本草纲目》 又曰其“健脾胃，强筋骨，去风湿，利关节，止泄泻。治拘挛骨痛，恶疮痈肿。解汞粉、银朱 毒”。近年来临床上各医家活用土茯苓多种病证获得良效。其中在肾病方面的获得 良好的临床效果，如土茯苓具有显著利尿作用，服用后多见尿量增加而显示消肿之效。《中药 辞典》|《中药辞典》上海科技出版社，1986年5月第1版]载急慢性肾炎，每日3两(90g)， 水煎分3次服，服后小便增加，退肿作用较好。另外尚可用于肾盂肾炎、肾结核[王洪然，土 茯苓在临床的应用。中国民族民间医药，2009，7，79.]。落新妇苷土茯苓中提取，分离得到 的有效成分。落新妇苷具有多种生物活性，如落新妇苷具有杀虫[Luciane G Batista Pereira， Fernando Petacci，B Fernandes，Arlene GPaulo C Vieira，M Fátima G F da Silva and Osmar Malaspina.Biological activity of astilbin from Dimorphandra mollis against Anticarsia gemmatalis and Spodoptera frugiperda.Pest Management Science，58(5)，2002：503-507.]、抑制辅 酶A还原酶[Chen TH，Liu JC，Chang J，Tsai MF，Hsieh MH，Chan P.The in vitro inhibitory effect of flavonoid astilbin on 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase on Vero cells.Zhonghua Yi Xue Za Zhi(Taipei)2001；64：382-387]、抑制醛糖还原酶 [Haraguchi，H.，Ohmi，I.，Fukuda，A.，Tamura，Y.，Mizutani，K.，Tanaka.O.，Chou，W.-H.Inhibition of aldose reductase and sorbitol accumulation by astilbin and taxifolin dihydroflavonols in Engelhardtia chrysolepis.Biosci.Biotechnol.Biochem.1997，61，651-654.]、肝保护[Closa D， Torres M，Hotter G，Bioque G，Leon OS，Gelpi E，et al.Prostanoids and free radicals in CCl4-induced hepatotoxicity in rats：effect of astilbin.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 1997；56：331-334]、镇痛、抗水肿、抗氧化等活性[Cechinel-Filho V，Vaz ZR，Zunino L，Calixto JB， Yunes RA.Antinociceptive and anti-oedematogenic properties of astilbin，taxifolin and some related compounds.zneimittelforschung.2000；50(3)：281-285.；Igarashi K，Uchida Y，Murakami N， Mizutani K，Masuda H.Effect of astilbin in tea processed from leaves of Engelhardtia chrysolepis on the serum and liver lipid concentrations and on the erythrocyte and liver antioxidative enzyme activities of rats.Biosci Biotechnol Biochem 1996；60：513-515]，落新妇苷还能显著改善免疫性 肝损伤[Xu Q，Wu FH，Cao JS，Chen T，Jiang JY，Saiki I.Astilbin selectively induces dysfunction of liver-infiltrating cells：novel protection from liver damage.Eur J Pharmacol 1999；377：93-100.； Wang J，Zhao Y，Xu Q.Astilbin prevents concanavalin A-induced liver injury by reducing TNF-α production and T lymphocytes adhesion.J Pharm Pharmacol 2004；56：495-502]，但落新妇苷在制 备或预防糖尿病合并中风的药理作用未见报道，本发明人通过大量的实验研究，发现了 落新妇苷在制备或预防糖尿病原性中风的药物中的应用。

发明内容：

本发明提供了由落新妇苷在制备或预防糖尿病合并中风的药物中的应用。

本发明提供的落新妇苷纯度大于等于90％小于100％。

本发明提供了以落新妇苷为活性成分的药物组合物在制备或预防糖尿病合并中风的 药物中的应用。

本发明提供了以落新妇苷为活性成分的药物组合物在制备或预防糖尿病合并中风急 性发作期药物中的应用。

本发明提供了以落新妇苷为活性成分的药物组合物在制备或预防糖尿病合并中风恢 复期药物中的应用。

本发明提供的药物组合物在用于糖尿病原合并中风疾病时，口服时使用剂量范围是25 mg～1000mg；优选50～500mg。

本发明提供的药物以制剂形式存在时，其有效成分的含量为25～100mg。

本发明提供的药物组合物可以根据制剂需要，加入相应辅料，以片剂、丸剂、颗粒剂、 胶囊、糖浆、软胶囊等形式存在，优选为胶囊及片剂。本发明提供的各种剂型均可以采用药 学常规方法制备而成。

本发明人进行了下列试验来证实或预防糖尿病合并中风的药物中的应用。(下面的实 施例用来更详细的说明本发明，但并不意味着本发明仅限于此)。

具体实施方式：

制备例1落新妇苷片剂的制备

处方：

操作：称取处方量的落新妇苷、糖粉、乳糖和羧甲基淀粉钠充分混合均匀后过100目筛，加 入3％PVP_K30水溶液适量制软材，20目筛制粒，60℃干燥3小时，18目筛整粒，加入处方量的 硬脂酸镁，混合均匀后压片，每片约200mg，即得。

制备例2落新妇苷胶囊的制备

处方：

操作：称取处方量的落新妇苷加羧甲基淀粉钠充分混合均匀后制软胶囊，每粒约200mg，即 得。

试验例1落新妇苷对2型糖尿病模型小鼠急性脑缺血的影响

1.1材料

实验动物：Jackson Lab实验室db/db糖尿病小鼠(购于南京模式动物研究所，种属： db/db小鼠；品系：BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J；动物等级：SPF)。

药物：落新妇苷，山东省天然药物工程技术研究中心，含量99％，批号：080210；

红四氮唑：美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。

1.2试验方法与结果

(2)方法与结果：

70只db/db糖尿病小鼠随机分为模型对照组(生理盐水)、依达拉奉静脉给药组(ED，5 mg/kg)、落新妇苷灌胃给药组1(5mg/kg)、落新妇苷灌胃给药组2(10mg/kg)、落新妇苷 灌胃给药组3(20mg/kg)、落新妇苷灌胃给药组4(50mg/kg)、落新妇苷灌胃给药组5(100 mg/kg)。每组10只，落新妇苷灌胃给药连续给药3天，第2次给药后8小时禁食，禁食16 小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动 脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线 (选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插 入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成右侧大 脑中动脉缺血模型；对照组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均 在23℃～25℃进行)。依达拉奉静脉给药组造模后2小时静脉给药，其余操作同上述各组。 24小时后按文献【刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的小鼠脑中动脉模型，药学学 报，1995，30：662】所述方法及标准观察并记录小鼠的行为障碍：(A)提鼠尾观察前肢屈 曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲 计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动 物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分， 如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和 3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者 计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一 侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。

行为评分后处死小鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四 氮唑(TTC)染，正常组织经染后呈红，梗塞组织呈白，染后照相，用中国航空 航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据以表示，缺血面以组间比较采用SAS9.0 进行单因素方差分析，神经行为缺陷组间比较采用非参数检验，P＜0.05表示差异具有显著 性意义。

结果如表1所示，缺血24小时后，db/db糖尿病模型组小鼠表现出明显的行为障碍，脑 组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑30％左右。落新妇苷灌胃给药组1(5mg/kg)、落新 妇苷灌胃给药组2(10mg/kg)、落新妇苷灌胃给药组3(20mg/kg)、落新妇苷灌胃给药组4 (50mg/kg)、落新妇苷灌胃给药组5(100mg/kg)显著改善小鼠行为障碍、减少缺血面积(与 模型组比较，p＜0.05或p＜0.01)，落新妇苷灌胃给药组4(50mg/kg)与落新妇苷灌胃给药组 5(100mg/kg)比较，对改善小鼠行为障碍、减少缺血面积无明显差异(p＞0.05)。

表1落新妇苷对小鼠脑缺血损伤的影响(n＝10)

^*，p＜0.05，^**，p＜0.01，与模型组比较

试验2落新妇苷对2型糖尿病模型小鼠脑缺血长期功能恢复的影响

2.1材料

实验动物：Jackson Lab实验室db/db糖尿病鼠(购于南京模式动物研究所，种属：db/db 小鼠；品系：BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J；动物等级：SPF)。

药物：落新妇苷，山东省天然药物工程技术研究中心，含量99％，批号：080210；

生物素抗小鼠的IgG(二抗，福州迈新生物技术中国公司)；抗NeuN血清(北京博奥森生 物技术公司)

2.2试验方法与结果

50只db/db糖尿病小鼠，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭 颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内 动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内， 遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒 缝合伤口，造成右侧大脑中动脉缺血模型；对照组10只动物仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、 颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。动物脑缺血24小时后40只模型动物分 为模型对照组(生理盐水)、落新妇苷灌胃给药组1(5mg/kg)、落新妇苷灌胃给药组2(20 mg/kg)、落新妇苷灌胃给药组3(100mg/kg)。再灌14天后，动物评价给药3、7和14天神 经行为缺陷，末次给药处死小鼠，取脑，免疫组化测定微血管密度(MVD)和进行NeuN染 ，评价2型糖尿病模型小鼠给药14天对脑缺血长期功能的恢复情况。

评价神经行为缺陷包括前爪功能缺损测定实验、横木行走实验和胶布粘贴实验。前爪功 能缺损测定根据【De Ryck M，Van Reempts J，Borgers M，Wauquier A，Janssen PAJ. Photochemical stroke model：flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats.Stroke，1989，20(10)：1383-1390.】检测悬挂鼠尾时小鼠身体上部的姿势；在爪功能缺 损测试中，首先提起左前爪或右前爪，对侧前爪或后爪伸向身体侧，根据每一个爪重新伸直 所需时间的不同记分为：0(＜1s)，1(＞2s)，2(不能伸直)。以缺血后7d和14d为观察时 间点分别进行检测。

横木行走实验根据参考文献【Feeney DM，Gonzalez A，Law WA.Amphetamine，haloperidol and experience interact to affect the rate of recovery after motor cortex injuries.Science，1982， 217(4562)：855-857.】进行，横木宽为2.0cm，长为120cm，厚度为1cm，横木距离地面为 80cm，横木水平悬空放置，横木一端连接一个暗盒(长40cm，宽22cm，高20cm)，用强光 刺激促使小鼠通过横木走进暗盒。评分标准：0分，小鼠不能停留在横木上，直接掉下来；1 分，小鼠可以停留在横木上，但不能走动；2分，小鼠试图通过横木，但在走动过程中从横 木摔下；3分，小鼠可以走上横木，但受损伤的后肢滑落的次数超过一半；4分，小鼠可以走 过横木，后肢滑落的次数超过1次但不到一半；5分，小鼠可以走过横木，仅从横木摔下1 次；6分，小鼠可以顺利走过横木。动物在缺血前训练2d，让受训小鼠学会可以顺利走过横 木。以缺血后7d、14d为时间观察点分别对各组缺血小鼠进行横木行走实验。

胶布粘贴实验根据【Schallert T，Upchurch M，Lobaugh N，Farrar SB，Spirduso WW， Gilliam P，Vaughn D，Wilcox RE.Tactile extinction：distinguishing between sensorimotor and motor asymmetries in rats with unilateral nigrostriatal damage.Pharmacol Biochem Behav，1982， 16(3)：445-462.】，以0.7×0.7cm大小的医用胶布贴在缺血小鼠的左前肢腕部腹侧面作为触觉 刺激，小鼠不舒服想法揭除胶布，记录缺血小鼠揭除胶布的潜伏期。术前训练2d，1次/天， 使受训小鼠能够在20s内完成揭除胶布的动作，20s内不能完成揭除胶布动作的小鼠剔除。 以缺血后7d、14d为时间观察点分别进行胶布粘贴实验检测。评分标准：1分，揭除胶布时间 ＜10s；2分，揭除胶布时间为10-19s；3分，揭除胶布时间为20-29s；4分，揭除胶布时 间为30-39s；5分，揭除胶布时间为40-49s；6分，揭除胶布时间为50-59s；7分，揭 除胶布时间＞60s。

MVD的测定方法按Weidner等【Weidner N，Semple JP，Welch WR，Folkman J.Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinomas.N Engl J Med，1991， 324(1)：1-8.】提供的方法进行测定，凡是被染成棕黄的单个的内皮细胞或内皮细胞簇则作 为一个血管计数，而不是以出现血管腔为唯一计数标准，统计出每个视野内微血管的数量， 然后取3个视野的均值作为测定MVD的结果。

NeuN染方法按[Jiang WL，Zhang SP，Fu FH，Zhu HB，Hou J.Inhibition of nuclear factor-κB by 6-O-acetyl shanzhiside methyl ester protects brain against injury in a rat model of ischemia and reperfusion.J Neuroinflammation.2010；7：55]：冠状切片(5μM)通过孵化进行 NeuN染，具有抗NeuN染血清和3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)。首先，冠状切 片在室温下TBS缓冲溶液(0.15M氯化钠，0.1米的Tris-HCl，pH值7.5)洗两次，每次20分钟。 其次在TBS-BSA的培养液[TBS的含1％(W/V)BSA和3％正常山羊血清(NGS)]温孵30分 钟阻止非特异性抗体结合。切片在1∶500抗NeuN血清(北京博奥森生物技术公司)过夜，在4℃ 1％NGS稀释，经过三次10分钟1％NGS的TBS稀释冲洗，切片与1∶250生物素抗小鼠的IgG(二 抗，福州迈新生物技术中国公司)在1％NGS的TBS溶液温孵，NeuN染以计算脑梗死体积 计算。

表2落新妇苷对2型糖尿病模型脑缺血后神经行为缺陷的影响

注：与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表3落新妇苷对2型糖尿病模型脑缺血后14天MVD和梗死面积的影响