灭活ASFV作为复合疫苗的免疫攻毒保护成分的用途

本发明公开了灭活ASFV作为复合疫苗的免疫攻毒保护成分的用途；涉及非洲猪瘟基因工程重组活载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗的免疫攻毒保护成分，即灭活的非洲猪瘟病毒或灭活的非洲猪瘟病毒与多糖等佐剂的混合物。灭活的非洲猪瘟病毒或灭活的非洲猪瘟病毒与多糖等佐剂的混合物能够提高非洲猪瘟基因工程重组活载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗的免疫攻毒保护效果，实现100%保护；同时本发明还提供了由该免疫攻毒保护成分和基因工程重组活载体疫苗或亚单位疫苗或核酸疫苗联合制备的复合疫苗；属于兽用生物制品技术领域。

非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine FeverVirus，ASFV）感染引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，家猪病死率可高达100%。

ASFV结构复杂，病毒感染和免疫机制不清，尽管针对ASF疫苗的研究起始于20世纪60年代末，近年来报道也很多，种类主要包括弱毒活疫苗、灭活疫苗、基因工程重组活疫苗等，但均因各自的缺陷而尚未成功应用于实际。其中，对于弱毒活疫苗，无论是人工基因缺失弱毒株还是自然分离的弱毒株，猪免疫后虽然能产生一定的攻毒保护，但会出现剂量依赖性副反应，包括精神沉郁，食欲降低，发热、病毒血症、高丙球蛋白血症、肺炎、关节肿胀、跛行、慢性病变和僵猪等，且会造成病毒的进一步扩散流行，并有毒力返强的潜在风险（Manso Ribeiro J 等，1963；Leitao, A 等，2001）。灭活疫苗和基因工程重组活载体疫苗或亚单位疫苗等，虽然相对安全，但免疫攻毒保护效果不理想，如采用多种传统方法制备的ASF灭活疫苗分别与新型高效的佐剂如PolygenTM或Emulsigen®配合使用，免疫两次，虽然使用安全，均可产生高水平的抗体，但当以ASFV街毒株进行攻毒后猪全部死亡（Blome S 等，2014）；而新型基因工程疫苗如核酸疫苗、亚单位疫苗和基因工程重组活载体疫苗配合BioMize 0226或ZTS-01等免疫佐剂使用，同灭活疫苗类似，虽然具有很好的安全性，也能诱导产生大量的抗体、IFNγ和CTL反应（Lokhandwala 等, 2016；Lokhandwala 等，2017），但免疫攻毒保护效果不理想，不产生免疫攻毒保护或仅有20-60%的保护率（Lokhandwala 等，2019）。总之，虽然相对于弱毒活疫苗而言，灭活疫苗和重组基因工程载体疫苗虽然对猪非常安全，配合佐剂使用也都能产生很好的体液免疫应答和细胞免疫应答，但均不能产生很好的免疫攻毒保护效果。

本发明公开了一类灭活ASFV作为免疫攻毒保护成分在复合疫苗制备中的用途，提供了灭活ASFV的一种新用途。

本发明进一步提供了一类以灭活ASFV为免疫攻毒保护成分的复合疫苗制备方法，显著提高了这些基因工程载体疫苗的免疫攻毒保护效果。

本发明公开了以灭活ASFV作为免疫攻毒保护成分在复合疫苗制备中的用途。

本发明所述的一类以灭活ASFV为免疫攻毒保护成分的复合疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）ASFV的灭活：

取ASFV培养物进行病毒灭活；

2）免疫攻毒保护成分的制备：

将步骤1）灭活的ASFV培养物与生理盐水或佐剂进行混合，制成免疫攻毒保护成分；

3）ASF基因工程多抗原疫苗的制备：

将多个分别表达的ASF基因工程抗原进行等体积混合得ASF基因工程多抗原疫苗；

4）含免疫攻毒保护成分的ASF复合疫苗的制备：

将步骤2）制备的免疫攻毒保护成分与步骤3）制备的ASF基因工程多抗原疫苗进行混合，即得本发明复合疫苗。

本发明所述的制备方法，其特征在于：

步骤1）ASFV的选自：ASFV细胞培养物或ASFV感染的病料组织；

ASFV基因型包括：I、II、III、…XXIV等共24个基因型；

ASFV是指未经任何基因重组技术改造的或经基因工程技术突变、缺失或插入标记的ASFV重组病毒。

本发明所述的制备方法，其特征在于：

步骤2）涉及的ASFV培养物与生理盐水或佐剂混合比例为1：（0.05~1）；

本发明所述的制备方法，其特征在于：

步骤3）涉及的ASF基因工程多抗原选自：A104R、A151R、B438L、B602L、B646L、CP204L、CP530R、D117L、E120R、E183L、E199L、EP364R、EP402R、F317L、H108R、061R中的任意3种组合或3种组合以上；

步骤3）涉及的ASF基因工程疫苗选自：腺病毒或疱疹病毒、杆状病毒、痘病毒、副粘病毒、大肠杆菌、酵母、RNA复制子等载体构建的表达ASFV抗原的重组活载体疫苗，表达ASFV抗原的核酸疫苗或哺乳动物细胞表达的ASFV亚单位疫苗等。

本发明所述的制备方法，其特征在于：

步骤4）所述的免疫攻毒保护成分与ASF基因工程多抗原疫苗为等体积混合。

本发明提供了一种增强ASF基因工程重组活载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗的免疫攻毒保护效果的成分，即灭活的ASFV或灭活的ASFV与多糖等佐剂的混合物，能够将ASF基因工程重组活载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗的免疫攻毒保护效果提高到100%。

本发明进一步提供了由上述免疫攻毒保护成分即灭活的ASFV或灭活的ASFV与多糖等佐剂的混合物制备的复合疫苗，即含有灭活的ASFV或灭活的ASFV与多糖等佐剂的混合物和多抗原（3种及以上抗原）ASF基因工程疫苗混合制备的复合疫苗。

本发明制备的含有3种及以上ASF抗原(多抗原）的基因工程多抗原疫苗在不能达到完全免疫攻毒保护的情况下，加入免疫攻毒保护成分即灭活的ASFV或灭活的ASFV与多糖等佐剂的混合物后，制成复合疫苗，可产生完全（100%）的免疫攻毒保护。

本发明的积极效果在于：

本发明公开了灭活ASFV作为免疫攻毒保护成分在复合疫苗制备中的用途。通过将灭活ASFV或其与佐剂的混合物作为免疫攻毒保护成分与ASF基因工程重组活载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗配合使用，显著提高了这些基因工程载体疫苗的免疫攻毒保护效果，对于ASF的防控具有重要的实际意义，是未来非洲猪瘟疫苗研究的重要方向。

本发明中涉及到的免疫攻毒保护成分即灭活的ASFV或灭活的ASFV与多糖等佐剂的混合物本身对猪没有免疫攻毒保护效果，本发明中涉及到的ASF基因工程多抗原疫苗对猪也完全没有免疫攻毒保护效果或免疫攻毒保护效果仅有20%左右。但在本发明中，通过将二者配合使用，即将灭活的ASFV或其与佐剂的混合物与ASF基因工程疫苗（包括活载体疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等）混合后接种猪，能够提供完全的（100%）免疫攻毒保护，而灭活的ASFV与多糖等佐剂混合后作为免疫攻毒保护成分，与ASF基因工程多抗原疫苗混合后接种猪，则能够延长对猪的完全保护期，攻毒后试验猪在观察期2-5个月乃至更长时间内没有任何ASF症状。

本发明通过单独灭活的ASFV或将灭活的ASFV与佐剂混合后作为一种新的ASF多抗原基因工程疫苗的免疫攻毒保护成分，能够增强ASF多抗原基因工程多抗原疫苗免疫攻毒保护效果；解决了单独使用灭活疫苗或单独使用多抗原基因工程疫苗不能提供完全的免疫攻毒保护或免疫攻毒保护效果不良的缺欠；本发明提供的由上述免疫攻毒保护成分制备的复合疫苗，为含有多抗原（3种以上抗原）ASF基因工程多抗原疫苗混合制备的复合疫苗，免疫攻毒保护率可高达100%；由于不含ASFV活病毒，具有安全性好；稳定性高（可以室温保存，保存期长）、便于大规模生产（ASFV可使用细胞系适应株，不仅仅依赖于原代巨噬细胞的培养）、对生物安全等级要求低（ASFV可使用能够在P2级实验室操作的没有毒力的基因缺失毒株）。本发明对于ASF的防控具有重大应用价值。

图1 为本发明中ASFV灭活效果的检测结果。

以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但不得以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。同时本发明所用实验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

一．ASFV的灭活

实施例1

取ASFV细胞培养物（107TCID50/mL），加入灭活剂BEI，使其终浓度为6mmol/L，37℃作用24h，期间轻轻混匀3-4次，24h后，加入终止液NaS2O3，使其终浓度为10mmol/L，混匀，37℃放置1h，即可完成灭活。

实施例2

取ASFV培养物（107TCID50/mL），加入1‰体积的β-丙内酯进行灭活，4℃作用24h，期间轻轻混匀3-4次，24h后，37℃放置1h终止反应，即可完成灭活。

实施例3

取ASFV感染的病料组织匀浆液（107TCID50/mL），加入灭活剂BEI，使其终浓度为6mmol/L，37℃作用24h，期间轻轻混匀3-4次，24h后，加入终止液NaS2O3，使其终浓度为6mmol/L，混匀，37℃放置1h，即可完成灭活。

实施例4

取ASFV细胞培养物（105TCID50/mL），加入灭活剂BEI，使其终浓度为6mmol/L，37℃作用24h，期间轻轻混匀3-4次，24h后，加入终止液NaS2O3，使其终浓度为10mmol/L，混匀，37℃放置1h，即可完成灭活。

实施例1~实施例4的ASFV灭活效果的检测结果参见图1，其中，M为5000marker；1为ASFV核酸阳性对照；2为阴性对照（H2O）；3为ASFV细胞培养物阳性对照；4为ASFV组织病料阳性对照；5-8分别为实施例1-4中的灭活产物；阳性条带为600bp。结论：2种灭活剂对不同剂量和不同形式的ASFV均有很好的灭活效果。

二、ASF基因工程多抗原疫苗用免疫攻毒保护成分的制备

实施例5

免疫攻毒保护成分的制备：取灭活的ASFV（107TCID50/mL），与无菌生理盐水进行混合，混合比例为1:1，混合后进行分装，2mL/头份，然后置于4℃进行保存，备用，记为免疫攻毒保护成分A。

实施例6

免疫攻毒保护成分的制备：取灭活的ASFV（107TCID50/mL）、无菌黄精多糖佐剂和生理盐水进行混合，混合比例为10:2:8。将混合液进行分装，2mL/头份，然后置于4℃进行保存，备用，记为免疫攻毒保护成分B。

实施例7

免疫攻毒保护成分的制备：取灭活的ASFV（105TCID50/mL）、无菌黄精多糖佐剂和生理盐水进行混合，混合比例为10:2:8。将混合液进行分装，2mL/头份，然后置于4℃进行保存，备用，记为免疫攻毒保护成分C。

实施例8

免疫攻毒保护成分的制备：取灭活的ASFVΔMGF/CD2v（107TCID50/mL）与生理盐水进行混合，混合比例为1:1。将混合液进行分装，2mL/头份，然后置于4℃进行保存，备用，记为免疫攻毒保护成分D。

实施例9

免疫攻毒保护成分的制备：取灭活的ASFVΔMGF/CD2v（107TCID50/mL）与黄精多糖佐剂与生理盐水进行混合，混合比例为10:2:8。将混合液进行分装，2mL/头份，然后置于4℃进行保存，备用，记为免疫攻毒保护成分E。

实施例10

免疫攻毒保护成分的制备：取灭活的ASFV（107TCID50/mL）、无菌水包油佐剂和生理盐水进行混合，混合比例为10:2:8。将混合液进行分装，2mL/头份，然后置于4℃进行保存，备用，记为免疫攻毒保护成分F。

表1 各种免疫保护攻毒成分组分

病毒 剂量 佐剂 免疫攻毒保护成分A ASFV 10⁷TCID₅₀/mL — 免疫攻毒保护成分B ASFV 10⁷TCID₅₀/mL 黄精多糖 免疫攻毒保护成分C ASFV 10⁵TCID₅₀/mL 黄精多糖 免疫攻毒保护成分D ASFVΔMGF/CD2v 10⁷TCID₅₀/mL — 免疫攻毒保护成分E ASFVΔMGF/CD2v 10⁷TCID₅₀/mL 黄精多糖 免疫攻毒保护成分F ASFV 10⁷TCID₅₀/mL 水包油佐剂

三、ASF基因工程多抗原疫苗的制备。

实施例11

ASF基因工程多抗原疫苗的制备：将提取的分别表达A104R、A151R、B438L、B602L、B646L、CP204L、CP530R、D117L、E120R、E183L、E199L、EP364R、EP402R、F317L、H108R和061R的16种重组DNA进行浓度测定后，统一稀释到160μg/mL，等体积进行混合。混匀后，分装，2mL/头份（每种抗原重组DNA的使用剂量是20μg），备用，记为多抗原疫苗A。

实施例12

ASF基因工程多抗原疫苗的制备：将培养的分别表达EP402R、E183L 和EP364R 蛋白的3种重组腺病毒进行滴度测定后，统一稀释到1.5×108TCID50/mL，等体积进行混合。混匀后，分装，2mL/头份（每种抗原重组病毒的使用剂量是108TCID50），备用，记为多抗原疫苗B。

实施例13

ASF基因工程多抗原疫苗的制备：将16种分别表达A104R、A151R、B438L、B602L、B646L、CP204L、CP530R、D117L、E120R、E183L、E199L、EP364R、EP402R、F317L、H108R和061R的293AD细胞系产生蛋白分别进行定量后，统一稀释到240μg/mL，等体积进行混合。混匀后，分装，2mL/头份（每种亚单位蛋白的使用剂量是30μg），备用，记为多抗原疫苗C。

实施例14

ASF基因工程多抗原疫苗的制备：将培养的分别表达A104R、A151R、B438L、B602L、B646L、CP204L、CP530R、D117L、E120R、E183L、E199L和EP364R蛋白的12种重组杆状病毒进行滴度测定后，统一稀释到6×108TCID50/mL，等体积进行混合。混匀后，分装，2mL/头份（每种抗原重组病毒的使用剂量是108TCID50），备用，记为多抗原疫苗D。

实施例15

ASF基因工程多抗原疫苗的制备：将提取的分别表达A104R、A151R、B438L、B602L、B646L、CP204L、CP530R、D117L、E120R、E183L、E199L、EP364R、EP402R、F317L、H108R和061R的16种重组腺病毒进行滴度测定后，统一稀释到8×108TCID50/mL，等体积进行混合。混匀后，分装，2mL/头份（每种抗原重组病毒的使用剂量是108TCID50），备用，记为多抗原疫苗E。

表2 多抗原疫苗组分和剂量

疫苗种类 蛋白种类 每种蛋白剂量 多抗原疫苗A 核酸疫苗 16 20μg 多抗原疫苗B 腺病毒活载体疫苗 3 10⁸TCID₅₀ 多抗原疫苗C 亚单位疫苗 16 30μg 多抗原疫苗D 杆状病毒活载体疫苗 12 10⁸TCID₅₀ 多抗原疫苗E 腺病毒活载体疫苗 16 10⁸TCID₅₀

四、含免疫攻毒保护成分的ASF复合疫苗的制备

实施例16

将1头份“免疫攻毒保护成分A”（含107TCID50的灭活ASFV）与1头份“多抗原疫苗E”（含表达16种ASFV蛋白的重组腺病毒）混合，混匀后，即为1头份的复合疫苗A。4℃保存，备用。

实施例17

将1头份“免疫攻毒保护成分B” （含107TCID50的灭活ASFV+黄精多糖佐剂）与1头份“多抗原疫苗E” （含表达16种ASFV蛋白的重组腺病毒）混合，混匀后，即为1头份的复合疫苗B。4℃保存，备用。

实施例18

将1头份“免疫攻毒保护成分C”（含105TCID50的灭活ASFV+黄精多糖佐剂）与1头份“多抗原疫苗E”（含表达16种ASFV蛋白的重组腺病毒）混合，混匀后，即为1头份的复合疫苗C。4℃保存，备用。

实施例19

将1头份“免疫攻毒保护成分D”（含107TCID50的灭活ASFVΔMGF/CD2v）与1头份“多抗原疫苗E”（含表达16种ASFV蛋白的重组腺病毒）混合，混匀后，即为1头份的复合疫苗D。4℃保存，备用。

实施例20

将1头份“免疫攻毒保护成分E”（含107TCID50的灭活ASFVΔMGF/CD2v +黄精多糖佐剂）与1头份“多抗原疫苗E”（含表达16种ASFV蛋白的重组腺病毒）混合，混匀后，即为1头份的复合疫苗E。4℃保存，备用。

实施例21

将1头份“免疫攻毒保护成分F” （含107TCID50的灭活的ASFV+水包油佐剂）与1头份“多抗原疫苗E”（含表达16种ASFV蛋白的重组腺病毒）混合，混匀后，即为1头份的复合疫苗F。4℃保存，备用。

实施例22

将1头份“免疫攻毒保护成分E”（含107TCID50的灭活ASFVΔMGF/CD2v +黄精多糖佐剂）与1头份“多抗原疫苗A”（含表达16种ASFV蛋白的重组核酸疫苗）混合，混匀后，即为1头份的复合疫苗G。4℃保存，备用。

实施例23

将1头份“免疫攻毒保护成分E”（含107TCID50的灭活ASFVΔMGF/CD2v +黄精多糖佐剂）与1头份“多抗原疫苗C”（含表达16种ASFV蛋白的亚单位疫苗）混合，混匀后，即为1头份的复合疫苗H。4℃保存，备用。

实施例24

将1头份“免疫攻毒保护成分B”（含107TCID50的灭活的ASFV+黄精多糖佐剂）与1头份“多抗原疫苗B”（含表达3种ASFV蛋白的重组腺病毒）混合，混匀后，即为1头份的复合疫苗I。4℃保存，备用。

表3 复合疫苗组分和剂量

五、含免疫攻毒保护成分的ASF复合疫苗在猪中的应用试验

本实验例用来说明不同形式的灭活ASFV对不同形式的基因工程多抗原疫苗的免疫增强作用，以及佐剂的加入对这种免疫增强作用的进一步提高作用。

将80只1月龄ASFV抗原抗体双阴性家猪随机均分为16组。组1试验组，每只接种1头份“复合疫苗A”；组2试验组，每只接种1头份“复合疫苗B”；组3试验组，每只接种1头份“复合疫苗C”； 组4为对照组，每只接种1头份“免疫攻毒保护成分A”；组5为对照组，每只接种1头份“免疫攻毒保护成分B”；组6为对照组，每只接种1头份“多抗原疫苗E”；组7为对照组，每只接种4mL“多抗原疫苗E”和黄精多糖与生理盐水的混合物，混合比例为10:1:9；组8为试验组，每只接种1头份“复合疫苗G”；组9为对照组，每只接种1头份“多抗原疫苗A”；组10为试验组，每只接种1头份“复合疫苗H”；组11为对照组，每只接种1头份“多抗原疫苗C”；组12为试验组，每只接种1头份“复合疫苗F”；组13为对照组，每只接种4mL “多抗原疫苗E”和水包油佐剂与生理盐水的混合物，混合比例为10:1:9；组14为试验组，每只接种1头份“复合疫苗I”；组15为对照组，每只接种4mL“多抗原疫苗B”和黄精多糖与生理盐水的混合物，混合比例为10:1:9；组16为攻毒对照组，每只接种4mL生理盐水。14dpi时各组均进行加强免疫，28dpi时进行ASFV野毒攻毒试验，攻毒剂量为103TCID50/mL，攻毒方式为口服，攻毒后观察5个月。具体分组情况和免疫攻毒保护结果见表4。

表4实施例中各组的免疫成分和免疫攻毒保护效果

结论：实验例中结果显示，组16全部死亡，说明攻毒对照组成立；

组1、组4和组6对比结果显示，灭活的ASFV本身（组4）或多抗原重组腺病毒本身（组6）免疫后，保护时间小于30天，而将二者结合（组1）后，免疫保护时间可以延长到94天，保护率为100%；

对比组1、组2、组5和组7结果显示，灭活的ASFV与多糖佐剂混合后，再与多抗原腺病毒活载体疫苗配合使用（组2）的免疫保护时间在观察期5个月结束时，完全没有任何症状，保护时间较不加佐剂组（组1）更好，且比“灭活ASFV+多糖佐剂配合使用组（组5）”和“重组腺病毒疫苗+多糖佐剂组（组7）”2个对照组的免疫保护时间和保护率都显著升高，说明佐剂的加入能够辅助灭活ASFV进一步提高重组腺病毒疫苗的免疫攻毒保护作用；

对比组8、组9和组1 的结果显示，双基因缺失毒株ASFVΔMGF/CD2v与全病毒颗粒一样，灭活后能显著提高腺病毒重组多抗原疫苗的免疫保护时间；

对比组8和组9、组10和组11结果显示，灭活的ASFV对多抗原核酸疫苗和亚单位疫苗同样有增强免疫保护效果的作用；

对比组12、组13和组1、组2结果显示，水包油佐剂同多糖佐剂一样，都能够辅助灭活ASFV进一步提高重组腺病毒疫苗的免疫攻毒保护作用；

对比组14、组15结果显示，本发明中的免疫攻毒保护成分（灭活ASFV+多糖佐剂）对于只表达3种抗原的多抗原疫苗的免疫保护效果也有显著的提高作用。

综上所述，灭活的ASFV病毒全颗粒和ASFV基因缺失毒株能够显著提高基因工程多抗原疫苗、核酸疫苗或亚单位疫苗的免疫攻毒保护效果到完全保护水平（100%），而在此基础上添加多糖或水包油等佐剂则能使免疫保护期显著延长到5个月以上，灭活ASFV的剂量与免疫保护增强效果相关，每头份107TCID50的效果优于105TCID50。

结论：

通过上述结果可以看出，本发明通过采用不同剂量的ASFV全病毒或基因缺失病毒灭活产物均能够有效提高表达不同蛋白组合的ASFV基因工程疫苗的免疫攻毒保护效果。

虽然已有研究和本发明中的实验结果都表明，本发明中的免疫攻毒保护成分本身（灭活ASFV或灭活ASFV与佐剂混合物）和基因工程多抗原疫苗单独免疫后均不能起到免疫攻毒保护作用或免疫攻毒保护作用极低，但通过本发明将前者作为免疫攻毒保护成分加入到后者中，能够显著提高后者的免疫攻毒保护作用，包括免疫保护时间和免疫攻毒保护率（参见“含免疫攻毒保护成分的ASF复合疫苗在猪中的应用试验”实施例中组1、组2、组3与组4、组5、组6、组7的对比结果）。且该方法制备的复合疫苗相对于ASF基因缺失疫苗株而言，不含活的ASFV颗粒，对靶动物和非靶动物都绝对安全。此外，该类免疫攻毒保护成分中使用的ASFV可以是原代细胞培养的ASFV，也可以是经过基因改造的减毒株，还可以是细胞系适应毒株，因此可以实现在非P3实验室大规模生产的目的。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。