减少蛋白的三硫化物水平的方法

减少蛋白的三硫化物水平的方法

本发明涉及磺基半胱氨酸和其衍生物作为细胞培养添加剂来减少细胞培养中产生的蛋白(例如IgG)的三硫化物水平的用途。

重组蛋白，特别是单克隆抗体(mAb)，已成为一类重要的性化合物，用于广泛的疾病。

这样的生物分子，例如性蛋白(包括抗体)的高效和经济的大规模生产对于生物技术和制药工业而言是越来越重要的考虑。通常，蛋白使用细胞培养方法生产，例如，使用经重组工程改造以生产目的蛋白的哺乳动物或细菌细胞系。

然而，这样的重组生产的蛋白显示明显的异质性。这样的异质性可由化学引起的修饰例如氧化、脱酰胺和糖化，以及翻译后修饰例如蛋白水解成熟、蛋白折叠、糖基化、磷酸化和二硫键形成导致。分子异质性是不需要的，特别是如果性蛋白意图用于人，和必须被监管机构例如食品和药品管理局(FDA)批准。

一种已受到特别关注的分子异质性是三硫化物键的形成。

抗体(或免疫球蛋白)由四个多肽链组成：两个轻链多肽(LC)和两个重链多肽(HC)。四个链通常通过在重链和轻链中存在的半胱氨酸残基之间形成的二硫键以"Y"构型连接。这些二硫键决定天然HC2LC2四聚体的总体结构。通常，抗体含有四个链间二硫键，包括两个连接H链的铰链区二硫化物，和在每个重链H和轻链L之间的一个二硫键。此外，十二个链内二硫键可涉及分子中存在的每个剩余的半胱氨酸残基。不完全的二硫键形成，或通过氧化或β-消除导致的键断裂接着二硫化物混杂，全都是抗体异质性的潜在来源。此外，最近报道了其它类型的修饰，即三硫化物(-CH-S-S-S-CH-)键形成。关于三硫化物键形成的其它信息可见于Pristatsky等, Anal. Chem. 81: 6148 (2009)。

Rashmi Kshirsagar等, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, No.10, 2012年10月, 第2523-2532页建议修改和特别是减少细胞培养基中的半胱氨酸含量，因为他们发现半胱氨酸含量和三硫化物键形成之间的关系。

WO 2011 041721公开了通过使溶液中的蛋白接触和缔合固体载体，然后将所述蛋白暴露于包含还原剂的溶液，将蛋白中的三硫化物键转化为二硫键的方法。

WO2012158551公开了在大规模生产期间减少蛋白中的三硫化物键形成的方法，包括在有效量的半胱氨酸降解抑制剂，例如谷胱甘肽、丙酮酸盐等的存在下培养表达所述蛋白的细胞。

发现减少蛋白中的三硫化物水平的其它较不复杂和/或更高效的方法，将是有利的。

已发现，如果细胞培养基中的半胱氨酸被S-磺基半胱氨酸和/或其盐替换，在所述细胞培养基中产生的蛋白的三硫化物键的量与包含半胱氨酸的相同细胞培养基相比降低。

本发明因此涉及减少蛋白中的三硫化物键形成的方法，包括培养表达所述蛋白的细胞，其中在细胞培养期间一次或多次将进料培养基加入细胞培养物，所述进料培养基不含有任何显著量的半胱氨酸或胱氨酸，但包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐，其中相对于在其中进料培养基的半胱氨酸和/或胱氨酸未被S-磺基半胱氨酸和/或其盐部分或优选完全替换的细胞培养基中培养的细胞，所述蛋白中的三硫化物连键形成减少。

在优选的实施方案中，S-磺基半胱氨酸和/或其盐是S-磺基半胱氨酸钠盐。

在优选的实施方案中，包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐的进料的pH介于6.8和7.5之间。

在另一优选的实施方案中，S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐以使得其在细胞培养物中的浓度介于0.4和50 mM之间的量加入。

在一个实施方案中，细胞在至少包含一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲剂组分、一种或多种辅因子和一种或多种核酸组分的细胞培养基中培养。

在一个实施方案中，相对于在其中进料培养基的半胱氨酸和/或胱氨酸未被S-磺基半胱氨酸和/或其盐替换的细胞培养基中培养的细胞，所述蛋白的轻链和重链之间的三硫化物连键形成减少。

在一个实施方案中，本发明的方法通过以下进行：

- 向生物反应器中填充细胞和液体细胞培养基；

- 在生物反应器中孵育细胞；

- 在生物反应器中的细胞的整个孵育时间内连续地，或在所述孵育时间内一次或数次，向生物反应器加入细胞培养基，在此情况下所述细胞培养基是进料培养基，

其中进料培养基包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐，和不包含显著量的半胱氨酸和/或胱氨酸。当然可能的是，还添加不包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐的其它进料培养基。优选地，不添加含有半胱氨酸和/或胱氨酸的进料培养基。

优选地，进料培养基包含浓度介于1和100 mmol/l之间、优选地介于5和20 mmol/l之间的S-磺基半胱氨酸和/或S-磺基半胱氨酸盐。

优选地，在生物反应器中的细胞的整个孵育时间内，不添加含有半胱氨酸和/或胱氨酸的进料培养基。

图1显示用于监测IgG的三硫化物水平的策略。其它细节可见于实施例。

图2-5显示在FB过程的第13天和第18天在合并的Lys-C/胰蛋白酶消化液中的三硫化物连接的肽的相对定量。其它细节可见于实施例。

图6显示提取的离子谱图的叠加，其表明具有二硫化物桥的LC-HC连接和具有三硫化物桥的LC-HC连接之间的关系。其它细节可见于实施例。

"三硫化物键"通过将另外的硫原子插入二硫键，从而导致三个连续硫原子的共价键合来产生。三硫化物是一种翻译后修饰。三硫化物键可在蛋白的半胱氨酸残基之间形成，和可在分子内(即，在相同的蛋白的两个半胱氨酸之间)或在分子间(即，在分开的蛋白的两个半胱氨酸之间)形成。三硫化物例如，在链间连键中，主要在轻链-重链连键中检出。

三硫化物键的存在可使用例如，肽作图检测，和可基于由于额外硫原子(32Da)导致的完整蛋白质量的增加而检测。三硫化物键可因此使用质谱或通过高压液相谱和质谱(利用LC-MS系统的肽作图)检测。图1显示可如何进行这样的分析的一般流程。进一步的细节可见于实施例。

“蛋白”是由一个或多个氨基酸残基链组成的大分子。寡肽和优选多肽包括在蛋白的定义内。蛋白在活的生物体内执行大量功能，包括催化代谢反应，DNA复制，响应刺激和从一个位置运输分子至另一个位置。蛋白主要在其氨基酸序列方面而彼此不同。大多数蛋白折叠成独特的三维结构。蛋白可以是例如，天然存在的蛋白，或优选地，重组产生的蛋白。蛋白的实例是酶，或优选抗体。作为本发明的蛋白，还包括前述蛋白的片段、衍生物、类似物或变体，和其任何组合。

术语"抗体"是指具有特异性结合抗原的能力的蛋白。通常，抗体具有由两个重链和两个轻链组成的基本四-多肽链结构，所述链例如通过链间二硫键稳定。抗体可以是单克隆或多克隆的，和可以单体或多聚体的形式存在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体，和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。抗体还可包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们保留，或经修饰以包含，配体特异性结合结构域。术语"片段"是指抗体或抗体链的一部分或部分，其包含少于完整或完全抗体或抗体链的氨基酸残基。片段可通过完整或完全抗体或抗体链的化学或酶处理获得。片段也可通过重组方式获得。当重组产生时，片段可单独或作为称为融合蛋白的较大蛋白的一部分表达。示例性的片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fc和/或Fv片段。示例性的融合蛋白包括Fc融合蛋白。根据本发明，融合蛋白也被术语“抗体”所包括。

S-磺基半胱氨酸，亦称为(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基丙酸，是一种产物，例如通过硫酸与半胱氨酸缩合可获得的产物。合适的盐是碱金属或碱土金属盐，例如锂盐、钠盐、钾盐、钙盐或镁盐，或其混合物。优选的是钠盐、钾盐、钙盐和镁盐，最优选的是钠盐，特别是钠盐。

S-磺基半胱氨酸和其盐也可通过下式I表示：

　　　　　I

其中R是

和X是H、Li、Na、K、½ Ca、½ Mg，优选地H、Na、K。术语丙酸(propanoic acid)还可代替术语丙酸(propionic acid)使用。

2-氨基-3-磺基硫烷基-丙酸，亦称为(S)-2-氨基-3-磺基硫烷基-丙酸、S-磺基-半胱氨酸或半胱氨酸-S-硫酸和其盐的合成公开于例如I.H.Segel和M.J.Johnson,Analytical Biochemistry 5 (1963), 330-337和J.S. Church, D.J. Evans,Spectrochimica Acta Part A 69 (2008) 256-262。S-磺基-半胱氨酸可市售获自Sigma-Aldrich, US。钠盐另外可市售获自Bachem, Switzerland。

细胞培养是其中细胞被培养的任何设置。细胞培养例如用于生产目标分子，例如药物，特别是重组蛋白例如抗体。

细胞培养基是维持和/或支持细胞的体外生长的任何组分混合物。其可能是复合培养基或化学成分确定的培养基。细胞培养基可包含维持和/或支持细胞的体外生长所必需的所有组分，或仅一些组分，使得单独添加另外的组分。细胞培养基的实例是完全培养基，其包含维持和/或支持细胞的体外生长所必需的所有组分，以及培养基补充物或进料。完全培养基，亦称为基础培养基，通常具有介于6.8和7.8之间的pH。进料培养基优选地具有低于8.5的pH。根据本发明使用的细胞培养基优选地是化学成分确定的细胞培养基。

通常，根据本发明的细胞培养基用于维持和/或支持在生物反应器中的细胞生长和支持所述细胞的IgG产生。

一些细胞培养基作为无菌水性液体提供。液体细胞培养基的缺点是它们减少的保存期限以及运输和贮存困难。因而，目前许多细胞培养基作为细磨干粉混合物提供。它们为在水和/或水性溶液中溶解的目的而制造，并且在溶解状态下经设计，通常与其它补充物一起，为细胞提供重要的生长营养基础和/或从所述细胞产生生物药物。

大多数生物药物产生平台基于分批进料细胞培养方案。目的通常是开发高效价细胞培养过程以满足日益增加的市场需求和减少制造成本。除了使用高效重组细胞系之外，需要细胞培养基和过程参数的改进以实现最大生产潜能。

在分批进料过程中，基础培养基支持初始生长和生产，和进料培养基防止营养物耗尽和维持生产阶段。选择培养基以适应在不同的生产阶段期间的不同的代谢需求。过程参数设定 — 包括进料策略和控制参数 — 定义了适合于细胞生长和蛋白产生的化学和物理环境。

进料或进料培养基是这样的细胞培养基，其不是在细胞培养中支持初始生长和生产的基础培养基，而是在后面的时期加入以防止营养物耗尽和维持生产阶段的培养基。与基础培养基相比，进料培养基可具有更高浓度的一些组分。例如，一些组分，例如营养物，包括氨基酸或碳水化合物，可以基础培养基中浓度的约5X、6X、7X、8X、9X、10X、12X、14X、16X、20X、30X、50X、100x、200X、400X、600X、800X或甚至约1000X存在于进料培养基中。

根据本发明，不含有任何显著量的半胱氨酸和/或胱氨酸但作为代替而含有S-磺基半胱氨酸和/或其盐的进料培养基是含有少于S-磺基半胱氨酸和/或其盐的量的5% (w/w)、优选少于1 % (w/w)的量的半胱氨酸和/或胱氨酸的任何培养基，最优选其不含有半胱氨酸和/或胱氨酸，而仅包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐以及并非半胱氨酸和/或胱氨酸的潜在其它进料组分。

哺乳动物细胞培养基是维持和/或支持哺乳动物细胞的体外生长的组分的混合物。哺乳动物细胞的实例是人或动物细胞，优选地CHO细胞、COS细胞、I VERO细胞、BHK细胞、AK-1细胞、SP2/0细胞、L5.1细胞、杂交瘤细胞或人细胞。

化学成分确定的细胞培养基是不包含任何化学不确定的物质的细胞培养基。这意味着培养基中使用的所有化学品的化学组成是已知的。化学成分确定的培养基不包含任何酵母、动物或植物组织；它们不包含饲养细胞、血清、提取物、水解产物或消化物或其它化学确定不清的组分。化学不确定或确定不清的化学组分是化学组成和结构是未知的，以变化的组成存在或仅以大量实验工作才能确定的那些 – 与蛋白质例如白蛋白或酪蛋白的化学组成和结构的评价相当。

粉状的细胞培养基或干粉培养基是通常自研磨过程或冻干过程产生的细胞培养基。这意味着粉状的细胞培养基是粒状的颗粒培养基 – 不是液体培养基。术语"干粉"可与术语"粉末"互换使用；然而，本文使用的"干粉"仅指粒状材料的总体外观，且不意味着该材料完全不含复合或聚集的溶剂，除非另外指明。粉状的细胞培养基也可是粒状的细胞培养基，例如通过碾压干燥成粒。

粉状的细胞培养基优选地通过混合所有组分和研磨它们来产生。组分的混合是通过研磨生产干粉细胞培养基的领域的技术人员已知的。优选地，所有组分充分混合，以致混合物的所有部分具有几乎相同的组成。组成的均匀性越高，在同质细胞生长方面，得到的培养基的质量越好。

研磨可用适合于生产粉状的细胞培养基的任何类型的研磨机进行。典型的实例是球磨机、针磨机、fitz磨机或喷射磨机。优选的是针磨机、fitz磨机或喷射磨机，非常优选针磨机。

本领域技术人员知道如何运行这样的研磨机。

对于研磨的粉状培养基的使用，将溶剂，优选地水(最特别是蒸馏和/或去离子水或净化水或注射用水)或水性缓冲剂加入培养基，和将组分混合，直至培养基全部溶于溶剂中。

溶剂还可包含盐水、可溶性酸或碱离子(提供合适的pH范围(通常在pH 1.0-pH10.0的范围内))、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和醇或其它极性有机溶剂。

还可能添加另外的物质，例如用于调节pH的缓冲物质、胎牛血清、糖等至细胞培养基和溶剂的混合物。得到的液体细胞培养基然后与待生长或维持的细胞接触。

用本发明的方法处理的细胞可以是正常细胞、永生细胞、患病细胞、转化细胞、突变细胞、体细胞、生殖细胞、干细胞、前体细胞或胚胎细胞，其中的任一种可以是建立的或转化的细胞系，或获自天然来源。优选地，细胞是哺乳动物细胞，更优选BHK、VERO、HEK或CHO细胞，最优选是CHO-S、CHO dhfr- (DG44和Duxb11)、CHO-M和CHOK1细胞。

细胞培养基，特别是完全培养基，通常至少包含一种或多种糖组分、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素或维生素前体、一种或多种盐、一种或多种缓冲剂组分、一种或多种辅因子和一种或多种核酸组分。

培养基还可包含丙酮酸钠、胰岛素、植物蛋白、脂肪酸和/或脂肪酸衍生物和/或普卢兰尼克酸和/或表面活性组分例如化学制备的非离子表面活性剂。合适的非离子表面活性剂的一个实例是以伯羟基封端的双官能嵌段共聚物表面活性剂，亦称为泊洛沙姆，例如可以商品名pluronic ®从BASF, Germany获得。

糖组分全部是单糖或二糖，例如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖(单糖的实例)或蔗糖、乳糖或麦芽糖(二糖的实例)。

根据本发明的氨基酸的实例是酪氨酸，蛋白质性氨基酸，特别是必需氨基酸，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、氨酸和缬氨酸，以及非蛋白质性氨基酸，例如D-氨基酸。

酪氨酸意指L-或D-酪氨酸，优选地L-酪氨酸。

半胱氨酸意指L-或D-半胱氨酸，优选地L-半胱氨酸。

维生素的实例是维生素A (视黄醇、视黄醛、各种类视素和四种类胡萝卜素)、维生素B (硫胺素)、维生素B (核黄素)、维生素B (烟酸、烟酰胺)、维生素B (泛酸)、维生素B (吡哆醇、吡多胺、吡哆醛)、维生素B (生物素)、维生素B (叶酸、亚叶酸)、维生素B(氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺)、维生素C (抗坏血酸)、维生素D (麦角钙化醇、胆钙化醇)、维生素E (生育酚、生育三烯酚)和维生素K (叶绿醌、甲萘醌)。还包括维生素前体。

盐的实例是包含无机离子例如碳酸氢根、钙、氯离子、镁、磷酸根、钾和钠或微量元素例如Co、Cu、F、Fe、Mn、Mo、Ni、Se、Si、Ni、Bi、V和Zn的组分。实例是五水合硫酸铜(II)(CuSO5HO)、氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2HO)、氯化钾(KCl)、硫酸铁(II)、无水单碱式磷酸钠(NaHPO)、无水硫酸镁(MgSO)、无水二碱式磷酸钠(NaHPO)、六水合氯化镁(MgCl6HO)、七水合硫酸锌。

缓冲剂的实例是CO/HCO (碳酸盐)、磷酸盐、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS和TRIS。

辅因子的实例是硫胺素衍生物、生物素、维生素C、NAD/NADP、钴胺素、黄素单核苷酸和衍生物、谷胱甘肽、血红素、磷酸核苷酸和衍生物。

根据本发明的核酸组分是核碱基，例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶；核苷，例如胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷和胸苷；和核苷酸，例如腺苷单磷酸或腺苷二磷酸或腺苷三磷酸。

与完全培养基相比，进料培养基可具有不同的组成。它们通常包含氨基酸、微量元素和维生素。它们还可包含糖组分，但有时为生产原因，糖组分在单独的进料中添加。

除了S-磺基半胱氨酸之外，根据本发明的方法使用的合适的进料培养基还可例如包含一种或多种以下化合物，但不包含半胱氨酸或胱氨酸：

本发明的主旨在于通过用S-磺基半胱氨酸和/或其盐替换半胱氨酸和/或胱氨酸，减少细胞培养中产生的蛋白(或优选地，IgG)中存在的三硫化物键的量。

已发现，与未用S-磺基半胱氨酸和/或其盐替换进料中的半胱氨酸和/或胱氨酸的细胞培养相比，在所述蛋白(特别是抗体)的轻链和重链之间的三硫化物连键形成被有效减少，通常超过75%。

令人惊讶的是，发现另一种三硫化物形成减少。在所述蛋白(特别是抗体)中发现在重链的半胱氨酸259和半胱氨酸319之间的连键中的三硫化物形成，和其也可用本发明的方法减少。

用根据本发明的包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐代替半胱氨酸和/或胱氨酸的进料培养基处理的细胞通常是为生物药物生产目的而在生物反应器中培养的细胞。

S-磺基半胱氨酸和/或其盐可在细胞培养的任何时期加入细胞，与半胱氨酸和/或胱氨酸的添加类似。其可在开始细胞培养时加入。在此情况下，S-磺基半胱氨酸和/或其盐优选地与用于开始细胞培养的基础培养基的其它成分混合和研磨。这种包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐的干粉混合物然后通过混合粉末和溶剂溶于合适的溶剂，使得粉末溶解和产生具有需要的和均一的浓度的培养基组分的液体细胞培养基。

S-磺基半胱氨酸和/或其盐也可在细胞培养期间一次或多次加入。细胞培养通常进行1-3周。在此期间，持续或一次或多次加入进料培养基。S-磺基半胱氨酸和/或其盐可与其它进料培养基成分一起在进料培养基中加入培养物，或其可在仅包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐的单独进料中加入。另外，进料通常是液体，使得进料的所有组分在加入细胞培养物之前溶于合适的溶剂。

在优选的实施方案中，细胞培养用包含半胱氨酸和/或胱氨酸但不包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐的基础培养基开始，和S-磺基半胱氨酸和/或其盐作为进料添加。其优选地在细胞培养期间添加至少4次，优选地4-6次。在一个实施方案中，S-磺基半胱氨酸和/或其盐每隔一天至每隔三天添加。

包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐的进料的pH通常介于5和7.5之间，优选地介于6.8和7.5之间，最优选介于6.8和7.1之间。

通常，细胞培养通过以下进行：

a) 提供生物反应器

b) 将待培养的细胞与液体细胞培养基在生物反应器中混合

c) 孵育步骤b)的混合物一定的时间，其中包含S-磺基半胱氨酸，但不包含显著量的胱氨酸或半胱氨酸，优选不包含胱氨酸或半胱氨酸的进料培养基在该时间期间被加入至少一次。

生物反应器是其中可培养细胞的任何容器、袋、器皿或池。进行细胞培养是本领域技术人员已知的。这通常通过在合适的条件(例如pH、渗透压、温度、搅拌、通气(氧气/CO)等)下孵育生物反应器中的细胞，和任选在细胞培养期间一次或数次添加进料培养基进行。优选地，细胞培养作为分批进料细胞培养进行。

分批进料培养是其中在细胞培养期间一种或多种营养物(底物)被进料(提供)至生物反应器和其中产物保留在生物反应器中直至运行结束的细胞培养过程。该方法的可选描述是其中基础培养基支持初始细胞培养和添加进料培养基以阻止营养物耗尽的培养。分批进料培养的优点是可以随意需要的水平控制在培养液体中的进料底物的浓度。

一般而言，当控制一种或多种营养物的浓度影响所需代谢物的同质性或收率时，在此情况下例如S-磺基半胱氨酸和/或其盐，分批进料培养优于常规分批培养。

因此，优选地，本发明通过以下进行：

- 向生物反应器中填充细胞和液体细胞培养基

- 孵育生物反应器中的细胞

- 在生物反应器中的细胞的整个孵育时间内连续地，或在所述孵育时间内一次或数次，向生物反应器加入细胞培养基，在此情况下所述细胞培养基为进料培养基，

其中进料培养基包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐，但不包含显著量的半胱氨酸和/或胱氨酸，优选不包含半胱氨酸和/或胱氨酸，和优选具有介于6.8和7.5之间的pH。

已发现，如果细胞培养物包含尽可能较少的半胱氨酸和/或胱氨酸，减少三硫化物键的量是特别有效的。因此，如果细胞能够用单独的S-磺基半胱氨酸和/或其盐生长，优选地，细胞培养物不包含任何半胱氨酸和/或胱氨酸。对于一些细胞，基础培养基需要包含半胱氨酸和/或胱氨酸，因为它们在包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐但不含有任何半胱氨酸和/或胱氨酸的培养基中不显示足够的性能和/或生长。在该情况下，优选地，基础培养基包含半胱氨酸和/或胱氨酸，和在培养期间加入的进料培养基不包含任何另外的半胱氨酸和/或胱氨酸。

本领域技术人员显而易见的是，一个或数个类型的进料培养基可加入细胞培养物。如果使用单一进料策略，仅一个类型的进料培养基在细胞培养期间连续地或一次或数次加入细胞培养物。根据本发明的方法，这种单一进料培养基不含有任何显著量的半胱氨酸和/或胱氨酸，但作为替换，含有S-磺基半胱氨酸和/或其盐。如果数种不同的进料培养基加入细胞培养物，根据本发明的方法，优选这些进料培养基均不含有半胱氨酸和/或胱氨酸。不需要所有的进料培养基含有S-磺基半胱氨酸和/或其盐。例如，添加包含维生素、微量元素和氨基酸以及S-磺基半胱氨酸和/或其盐的进料和在其它时间添加第二进料可能是有利的，其中第二进料是例如，碳水化合物进料，其优选不包含任何S-磺基半胱氨酸和/或其盐。在任何情况下，在细胞培养期间至少一次添加进料，所述进料不含有任何显著量的半胱氨酸和/或胱氨酸，或优选地不含有半胱氨酸和/或胱氨酸，但包含S-磺基半胱氨酸和/或其盐。

已发现，用本发明的方法，可有效减少三硫化物的量。优选地，在轻链和重链之间的三硫化物形成可被减少。与其中进料培养基中的胱氨酸和/或半胱氨酸未被S-磺基半胱氨酸和/或其盐替换的细胞培养过程相比，这种三硫化物形成可减少超过75%，优选超过85%。

已根据本发明的方法处理和三硫化物键形成已被减少的蛋白可用于诊断测定法、免疫测定法和/或药物组合物。

在一些实施方案中，与未处理的对照相比，用本发明的方法处理的蛋白，例如抗体，具有增加的贮存稳定性。在另一个实施方案中，与未处理的对照相比，用本发明的方法处理的蛋白，例如抗体，具有减少的聚集趋势。在又一个实施方案中，与未处理的对照相比，用本发明的方法处理蛋白，例如抗体，导致氧化(例如，甲硫氨酸氧化)减少。

因此，本发明还提供减少蛋白(例如抗体)组合物中的蛋白氧化，例如甲硫氨酸氧化的方法，包括减少蛋白组合物中的三硫化物的水平。另一个实施方案提供减少蛋白(例如，抗体)组合物中蛋白聚集的方法，包括减少蛋白组合物中的三硫化物的水平。另一个实施方案提供增加蛋白(例如，抗体)组合物中的蛋白稳定性的方法，包括减少所述蛋白的组合物中三硫化物的水平。

另一个实施方案提供通过执行上述方法步骤，转化抗体中的三硫化物键为二硫键，增加或提高长期蛋白和抗体贮存稳定性的方法。

本发明通过以下附图和实施例进一步说明，然而不限于此。

上文和下文引用的所有申请、专利和出版物，以及2016年4月28日提交的相应专利申请EP 16167461.9的整个公开内容，通过引用结合到本文中。

实施例

以下实施例代表本发明的实际应用。

1.

a.

表达IgG1的重组CHO细胞在含有1.5mM半胱氨酸的完全化学成分确定的基础培养基(Cellvento ® CHO 220)中生长。在第3、5、7、10、14天，加入含有半胱氨酸或S-磺基半胱氨酸的进料。

对于对照条件，主进料包括维生素、微量元素和除了半胱氨酸(因为该氨基酸的低稳定性)之外的氨基酸。将150mM的半胱氨酸溶于pH 11的单独进料。分别在第3、5、7、10和14天，主进料以3%、6%、6%、6%和6% (v/v)加入，而半胱氨酸以0.3%、0.6%、0.6%、0.6%和0.6%加入。

对于SSC条件，主进料包括相同的维生素、微量元素和氨基酸和进一步补充有15mM的S-磺基半胱氨酸二钠盐。主进料在第3、5、7、10和14天分别以3%、6%、6%、6%和6% (v/v)加入，导致当与对照条件相比相同量的半胱氨酸来源。

每日监测两种条件的葡萄糖和使用400 g/L溶液调节至6g/L。

该过程在1.2L生物反应器中在37℃、pH 7.0、50%溶解氧、140 rpm搅拌下进行。

在第13天和第18天从生物反应器获得样品用于三硫化物分析。取样后，以1500rpm将细胞培养上清液离心5 min，使用自动化浊度测量方法(Cedex bioHT)将IgG浓度量化，和冷冻用于进一步处理。

b.

使用蛋白A结合(Phytips方法)，将IgG从冷冻样品纯化，和在200mM NaHPO; 140 mMNaCl和96mM Tris HCl中洗脱，和再次量化。

c.

首先，在暗处通过加入N-乙基马来酰亚胺(10 mM溶液，在0.1 M乙酸钠缓冲液pH 5.0中)将样品中的游离半胱氨酸烷基化30 min。

对于用Lys-C消化，将55 μL消化缓冲液(8 M尿素，0.1 M Tris, pH 7)和15 μLLys-C酶(Promega, V1671)加入，和在37℃下将样品孵育4小时。随后，通过加入468 μl消化缓冲液将样品稀释至1 M尿素，和在37℃下通过加入12 μL胰蛋白酶消化过夜。最终抗体浓度是50 mg/L。对于二硫化物和三硫化物键的分析，样品用10 %甲酸(4.4 μL)处理以停止消化，和通过LC-MS分析。

d.

注入获得的肽混合物和使用反相HPLC分离(RSLC3000 nano LC, Thermo ScientificDionex, Idstein, Germany)。带有柱体(PM100, C18, 5 μm, 0,3x5 mm, ThermoScientific Dionex, Idstein, Germany)的nanoLC柱(Acquity UPLC M-Class HSS T3,1.8 μm, 75 μm x 150 mm, Waters)用于样品的预浓缩和分离。在连续样品运行内进行空白运行和柱洗涤运行。

在50℃应用具有变化斜率的优化26-分钟线性梯度，如下(分钟/%B)：0/2, 0.25/2, 8/16, 20/29, 26.25/45, 27.25/99, 30.25/99 31.25/20 32.25/20, 33.25/99,34.25/99, 35.25/2, 38/2。注入量为5-7 μL (约0.35 μg)。以流速120 μL/min加载样品到柱体上，持续0.25分钟。对于加载，使用包含97.95 %水、2%乙腈和0.05% TFA的洗脱液。随后，切换阀门，将样品转移至分析型柱和使用流速0.6 μL/min分离。HPLC洗出液直接注入QExactive plus质谱仪(Thermo scientific, Bremen, Germany)。质谱仪以阳离子模式操作，喷射电压为1.9 kV，毛细管温度为275℃和S-Lens RF电压为55 V。对于MS/MS产物离子扫描，激活类型是碰撞诱导解离(CID)，默认电荷态是2。应用的4-扫描-事件QExactive方法由以下组成：以m/z 200-2000和70 000的分辨能力(RP)的完全MS测量扫描，接着对前三个最强离子的三个循环的数据依赖性MS/MS扫描。启用动态排除功能(dynamic exclusionfunction)，和参数如下：10 sec的动态排除，2 m/z的分离窗，17 500的分辨率，AGC靶3e6，250 msec的最大注入时间，25的标准化碰撞能量，0.1 %的不满率，1.2e4的强度阈值。对于MS/MS触发，未分配的电荷态和电荷态≥8被排除，和含有聚硅氧烷离子的排除质量列表(reject mass list)启用。动态排除为10 s。用和不用电荷态+1排除，进行重复运行。对于数据处理，基于分别含有分析的抗体的轻链和重链序列的内部蛋白数据库，使用Mascot2.3耐误差检索(Matrix Science London, UK)。MS/MS光谱使用MS2处理器进行电荷去卷积，然后数据库检索和Mascot设置适用于允许鉴定小肽：检索中测试和报告中显示的最短的肽设定为4个氨基酸。Mascot检索参数为：酶是胰蛋白酶，允许2次无效裂解，对于胰蛋白酶消化的固定修饰脲基甲基化，肽耐受性：6 ppm，MS/MS耐受性：0.05 Da，肽电荷+2, +3, +4，耐误差检索激活，最小离子评分15。

2. 结果

图2 – 5显示分别在第13天和第18天，IgG的轻链和重链之间(LC-HC)以及HC的2个半胱氨酸残基之间(HC_cys259-Cys319)的三硫化物形成的定量结果。

三硫化物连接的肽的相对百分比通过将三硫化物连接的肽的面积除以三硫化物和二硫化物连接的肽的面积总和计算。

结果表明，在单独进料中使用半胱氨酸产生的对照样品中，对于LC-HC连接的肽发现最大量的三硫化物。在使用SSC进料产生的样品中三硫化物的量降低。当使用SSC时，与对照条件相比，三硫化物的平均减少为在第13天93.3 %和在第18天92.4 %。

降低三个数量级，我们发现在重链的半胱氨酸259和半胱氨酸319之间的连键中三硫化物形成的证据。尽管相对量极低，但数据高度一致，和证实对在LC-HC连键之间三硫化物形成观察到的趋势。三硫化物的量在使用SSC进料产生的样品中降低。当使用SSC时，与对照条件相比，三硫化物的平均减少是在第13天46.7 %和在第18天25.9 %。

图6显示提取的离子谱图的叠加，表明具有二硫化物桥的LC-HC连接和具有三硫化物桥的LC-HC连接之间的关系。

图6说明，当与在单独的进料中使用半胱氨酸在对照FB中LC-HC连键相比(浅灰)，相对于二硫化物连接的肽，使用SSC在FB中在LC-HC连键中三硫化物形成的相对减少(深灰)。