免疫偶联物

免疫偶联物

所提请的发明涉及新型融合蛋白，它含有与肿瘤相关的靶向成 分和一个生物活性配基。前者首选单克隆抗体或其片段。它可以识 别一个优先在人肿瘤细胞如人表皮生长因子受体(EGFR)上表达的 分子；后者从趋化因子蛋白组，最好从C-X-C族中选择。产生的融 合蛋白可以转送生物活性配基到特定的靶细胞或组织中，这个新的 免疫偶联物可被用于肿瘤。

多种概念已被用于对癌症患者的中。过去，临床实验 的进行使用可特异性或选择性识别表达于恶性细胞表面上的分子的 单克隆抗体。这种方法的目的是诱导抗体依赖的细胞毒性(ADCC) 或补体介导的细胞毒性以消除肿瘤细胞。另一种方法是细胞素介导 的免疫应答的激活作用。细胞素诱导的抗肿瘤活性可被如下介导：

(1)细胞素对肿瘤生长的直接的细胞毒性/细胞抑制作用

(2)肿瘤抗原的非特异性机理，例如LAK活性或单核细胞/粒 细胞介导的细胞毒性

(3)由CD-4和CD-8阳性T-细胞介导的肿瘤抗原特异性免疫 应答。

在这种情况下，一种抗肿瘤的系统免疫已在动物模型中观测 到。

然而，高剂量细胞素的细胞毒性及原位存在量的不足引出了靶 向肿瘤的概念。靶向肿瘤的原理是以靶分子，如对肿瘤相 关抗原特异的单克隆抗体与生物活性效应分子的物理结合为基础 的。由靶分子传递地效应分子应增加肿瘤中细胞素浓度并减少所需 最大剂量。在动物模型中，已表明，由瘤内注射或被转染瘤细胞分 泌作用而得到的细胞素在原位的存在可导致肿瘤细胞的消退(见综 述：Colombo and Forni，Inmmunology Today 15：48-51，1994)。在 这些系统中，细胞素不减弱肿瘤的增生，但具有激活一个快速，强 力的抗肿瘤反应的能力。因此，效应分子和靶向成分的物理结合代 表了一种降低生物活性配基的外周存在和增强其瘤内的可利用性的 方式。而且，单个肿瘤细胞或微转移瘤也可被这些分子所定向。

抗体直接导向的生物活性配基应可直接或产生一个靶细胞致死 环境素而诱导对靶细胞的破坏作用。这可由细胞素如IL-1，IL-2， IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-13，IFN_S，TNF_α和CSF_S来完成。这 些细胞因子已被表明可直接或通过激活宿主防御机制间接地引起抗 肿瘤作用(Mire-Sluis，TIBTECH 11：74K—77，1993；Colombo et al.，Cancer Res.52：4853-4857,1992；Thomas & Balkwill，Phar- mac，Ther.52：307-330，1991)。

然而，这些细胞素的绝大多数虽然可激活效应细胞，但对其没 有或只有很弱的趋化活性，因此，当肿瘤组织中缺乏适量的效应细 胞时，抗肿瘤活性会很弱。

然而，趋化因子对许多效应细胞是具趋化活性的，因而会提高 其在肿瘤位点的存在量，其次，它们诱导了大量的效应细胞的功能 (见例：Miller and Krangel，1992)，“Biology and Biochemistry of the Chemokines：A Novel Family of Chemotactic and Inflammato- ry Cytokines”，Critical Reviews in Immunology 12，17)。

IL-8，MIP2α(也称作GRO-β)和MIP2β(GRO-γ)是C-X-C趋 化因子总科的成员。它们作为趋化因子并激活效应细胞的各项功能。 因此可代表最优的效应物。这个C-X-C趋化因子家族是一个最近被 认为是小分子量(8-10KD)的蛋白质组，其氨基酸序列显示出20— 50％的同源性并具有趋化和助类活性。IL-8具有一个极其确定的三 维结构(Clore et al.，Biochemistry 29：1689-1696，1990)并与一些 CXC趋化因子共有一个N-末端ELR基本结构。可以预期，由于 CXC趋化因子中的序列因源性，其三维结构将会是非常相似的，这 已经在MCAF/MCP-1的结构中得到证明(Gronenborn & Clore Prot.Eng.4，263-269，1991)。

在溶液中，IL-8形成稳定的二聚物(Clore et al.，Biochemistry 29：1689-1696，1990)，并且F(ab’)IL-8融合蛋白通过两个IL-8单 体的相互作用而二聚成一个二价的免疫偶联物是可能的。这将增强 融合蛋白与抗原的相互作用。

到目前已描述过的C-X-C组的成员主要作用于嗜中性粒细胞。 基因定位于第四号染体。这一组的成员是PF4，血小板基础蛋白， hIP10，IL-8，MIP2α和MIP2β。这些蛋白在中性粒细胞上的作用是 趋化活性，脱颗粒作用和呼吸性突放(Sherry and Cerami，Current option in Immunology 3：56-60，1991；Oppenheim et al.，Annu. Rev.Immunol.9：617-648，1991；Miller and Krangel，Critical Reviews in Immunology 12：17-46 1992；Clark-Lewis et al.，J.Bi- ol.Chem.266：23128—23134，1991)。

与C-C家族密切相关的趋化因子的成员主要作用于单核细胞。 基因都定位于17号染体。这些蛋白是LD78，Act-2，MCAF， 1309和RANTES。这些分子在单核细胞上显示出强大的趋化活性， (Matsushima et al.，Chem.Immunol.51：236-265，1992；Oppen- heim et al.，Annu.Rev.Immunol.9：617-648，1991)。

表皮生长因子(EGF)是一种致表皮及上皮细胞有丝分裂的多 肽激素。当EGF与敏感细胞相互作用时，它结合于膜受体 (EGFR)。EGFR是一个大约170KD的跨膜糖蛋白，是Cerb-B原癌 基因的基因产物。

鼠的单克隆抗体MAb425用来抗人A431肿瘤细胞系(ATCC CRL 1555)，并发现其结合于EGFR外部功能区的多肽表位。已经 发现，它抑制EGF的结合，体外介导肿瘤细胞毒性，并且体外抑制 上皮及直肠、结肠肿瘤源细胞系的肿瘤细胞的生长。MAb425的人 化或嵌合体的转型从WO 92/15683得知。

因此，本发明的目的之一是制成这样一些抗体及其片段：它包 含有导向肿瘤细胞表面EGFR抗原的表位和对其效应细胞具有高 度趋化活性，并因此导致低毒性靶向肿瘤的生物活性配基。因 此，这种免疫偶联物体现了类似的原有细胞素-抗体免疫偶联物的 改进，在引起肿瘤溶解的能力方面二者具有相似的效果，但由于其 趋化性质，在有效吸引效应细胞到特异性位点的能力方面与原偶联 物不同。

本发明涉及一种融合蛋白，此蛋白把单克隆抗体的一部分，至 少是抗原识别位点或识别EGFR表位的完整单克隆抗体和生物活 性配基连接起来，该配基选自趋化因子族，优选C-X-C族，尤其是 IL-8。编码这些蛋白的结构是通过DNA重组技术获得的。融合蛋白 包括抗体重链的可变区和恒定区的CH1段(CH1-偶联物，Fab-片 段)及合适的轻链，或者抗体重链的可变区和稳定区的CH1及CH2 段，或者，抗体重链可变区和稳定区的CH1，CH2，CH3段，每一 种情况下，各部位都融合在生物活性配基上。通过与合适轻链的共 同表达，可以产生以抗原承载细胞为靶，并在体内转运活性配基到 特异位点的融合蛋白。

与此类似，另一个免疫偶联物可由将趋化因子融合到抗体FV 片段的C-末端而得到。这样的情况下，重、轻链可在一个多肽上表 达，在此多肽上，两种成分通过合适的连接序列结合起来以确保抗 原结合位点的适当折叠。不同的结构在图1中表明。

免疫偶联物的表在产生新的分子，它们结合有两种功能：首先 它们以抗原承载细胞(EGFR)为靶，其次，它们在体内转运活性配 基到特异位点。这些配基是强化学诱引剂和活性物质，并导致在肿 瘤位点的效应细胞浸润，并可引起随后的肿瘤破坏作用。

通过使用本发明的免疫偶联物、肿瘤、如黑素瘤、神经胶质瘤 和癌可被检测出来并可在无大量一般毒性作用的情况下得到成功的 。

因此，本发明的目的之一是为了提供一个免疫偶联物，它含有 一个单克隆抗体或其片断，它们可被导向带有表皮生长因子受体 (EGFR)抗原决定基的肿瘤细胞；还含有融合于上述抗体或抗体片 断的趋化因子蛋白配基。

有几组不同的趋化因子，如C-X-C和C-C趋化因子。

这样，依照本发明的优选方案是从C-X-C族中选择趋化因子。

在C-X-C族中，IL-8是本发明所倾向的选择。

因此，本发明的目的之一是提供一个免疫偶联物，其趋化因子 选自C-X-C族并优选白细胞介素8(IL-8)。

依照本发明，可使用的抗体是完整的抗体或其片断。合适的片 断是F_VS，F_abs或F(ab’)2S(依照本申请用语为CH1抗体片断)， CH3和CH2抗体片段(图1)。优选方案为F_VS，CH1-，CH2和CH3 抗体片断。

因此，本发明的目的之一是提供一个免疫偶联物，其抗体是 Fab片段或F(ab’2)片段，这些片段实质包括抗体重链的可变区，恒 定区的CH1段及合适的轻链(抗体-CH1偶联物)。另一个免疫偶联 物，其抗体是一个实质上包括抗体重链可变区，恒定区CH1和 CH2段及合适轻链(抗体-CH2偶联物)的抗体片段，还有一个免疫 偶联物，其抗体为一完整抗体，主要包括抗体重链的可变区，恒定 区的CH1，CH2和CH3段及合适的轻链(抗体-CH3偶联物)，最 后，还有一个免疫偶联物，其抗体主要包括抗体重链的可变区，合 适的轻链和一个连接轻链和重链(抗体-FV偶联物)的多肽序列组 成。

本发明的免疫偶联物可包括在抗体(片段)和可产生诱导作用的 趋化因子之间的任意一个限制性位点它使得例如一特异连接肽的引 入成为可能，从而保证了偶联物与目标表位的最佳结合。合适的连 接肽和引入它们的方法在技术上已众所周知，并在下文中叙述。依 据本发明，所选择的限制性位点是特定DNA结构中唯一的位点。较 好的限制位点是NcoI和BclI。

因此，本发明进一步的目的是提供一个免疫偶联物，它含有一 个氨基酸(序列)，该氨基酸(序列)可由抗体/抗体片断和生物活性 配基之间的DNA限制位点推导出，所述限制性位点在整个融合结 构中是唯一的。

本发明进一步的目的是提供一个免疫偶联物，它包含一个在抗 体/抗体片断与生物活性配基之间的连接肽。

原理上，导向肿瘤细胞表面EGF受体的所有抗体都是适用的， 但单克隆抗体425是优选方案。

而且，本发明的另一个目的是提供一个免疫偶联物，其抗体和 抗体片段来源于鼠的、人化的或嵌合体的MAb425，并且以从 MAb425-CH1-IL8 MAb 425-CH2-(NcoI)-IL8，MAb 425-CH2- (BclI)-IL8，MAb 425-FV-IL8，MAb425-CH3-IL8族中选择为好。

此外，本发明的另一目的是提供一种上、下文及权利要求中所 定义的免疫偶联物的生产方法，它包括将编码抗体或抗体片段和生 物活性配基的DNA序列，通过一个与所需融合DNA序列互补的 寡核苷酸彼此融合在一单链DNA上。把产生的目的结构置于表达 载体上，转化此载体到宿主体中，于营养液中培养宿主细胞，并表 达此融合蛋白。

本发明的免疫偶联物适用于临床。

因此，本发明的目的之一是提供一种药物配方，它至少包含有 一种上、下文及权利要求中所定义的免疫偶联物以及生理学上许可 的载体。

本发明的目标之一是产生一种融合蛋白，它包括作为靶向成分 的单克隆抗体和作为效应物，具有趋化和激活性质的趋化因子IL- 8。

第一次，可以证明当IL-8和其它趋化因子(例如MIP_s)的N-末 端被附加的氨基酸，例如抗体的一部分所封闭的时候，它们可以保 持其生物活性。因此，在靶向肿瘤中，这个分子将会是很有用 的，这是由于效应细胞可被导向EGF受体阳性的肿瘤细胞并在原 位被激活。

可以证明，编码MAb425重链及IL-8蛋白的CDNA可用分子 生物学的方法被融合，蛋白可在合适的表达系统中表达，而且EGF 受体结合能力在融合蛋白中被保留(图2)。

IL-8的主要靶细胞是嗜中性粒细胞，它们有三种生物学功能：

·沿一个趋化梯度趋化移动

·释放带有预制备的蛋白水解酶的储存颗粒

·即时产生过氧化物阴离子(呼吸性释放)

相应地，也研究了MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8 融合蛋白的趋化活性，MPo释放和过氧化物释放的介导。

进一步，可以看出，本发明的融合蛋白(例如MAb425/NcoI/ IL-8和MAb425/BclI/IL-8)可引起趋化活性，诱导MPO的释放和 过氧化物的释放。图3a中所显示的结果表明了以上两种融合蛋白在 重组IL-8(图3b)的范围内对人中性粒细胞是有趋化性的，除了应 成型为二价形式的MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8融 合蛋白之外，还产生在大肠杆菌(E.coli)中表达并被纯化的一价F (ab’)-IL-8融合蛋白。图4显示出与MAb425F(ab’)相对比，相应的 在E.Coli中表达并被纯化的F(ab’)-IL-8融合蛋白对人中性粒细胞 是具趋化性的。

与游离IL-8相对比，MAb425/BclI/IL-8融合蛋白具有相当强 的过氧化物释放的能力(图5)，MAb425/NcoI/IL-8融合蛋白活性 较小，但明显高于对照值(图5)。单独的MAb425无活性。所有的试 验均以细胞松驰素B作为增强剂来进行。该试剂在单独存在时无活 性(数据未显示)。

两种融合蛋白均诱导髓过氧化物酶(MPO)的释放，但 MAb425/NcoI/IL-8融合蛋白比MAb425/BclI/IL-8融合蛋白更具 活性(图6)。所有数据均参照溶解细胞的数据计算，该数 被称作100％酶含量。所有数据的获得均使用细胞松驰素B作为增 强剂。

以前已证明，IL-8分子的N-末端带有高度保守的E-L-R基元 对于受体结合和信号传导是必须的。IL-8的三维结构是一个两个 N-末端均在一个开放构型中的匀二聚物。当IL-8的两个N-末端被 附加的氨基酸所封闭时，其生物活性是可能丧失的。因此，在两个 CDNA之间引入限制性位点(NcoI/BclI)以产生连接肽从而恢复N- 末端的可接近性。

产生融合蛋白的其它方法，例如两成分的化学偶联会导致可能 在两批产品间变动的非常不确定的结构。另外，化学偶联会破坏配 体的二级结构或产生由于不可接近性造成的大多数蛋白质在受体接 合方面的钝化。相比较来说，本发明的方法可产生确定结构的融合 蛋白，这种蛋白可以几乎无限制地被很重现地表达。

总之，本发明的融合蛋白具有下述性质：

—接合于EGFR阳性细胞

—产生趋化活性

—介导MPO和过氧化物的释放

—诱导肿瘤细胞的原位溶解。

因此，本发明的免疫偶联物适用于肿瘤。

表1：

表1表明用于产生NcoI或BclI点位，以产生真核表达的融合 蛋白的PCR引物序列。

图1：

抗体一细胞因子免疫偶联物的模型。

C＝细胞因子；VH＝重链可变区；VL＝轻链可变区；CH＝重 链恒定区；CL＝轻链恒定区。

图2：

以抗EGF-R的ELISA证明MAb425在COS-7的转染上清 中：

正方形：MAb425-CH3上清液

三角形：MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液

倒三角形：MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液

点：PHCMV上清液

横轴：上清液稀释度

纵轴：光密度在490nm

图3a：

以COS-7转染上清诱导趋化性：

柱1：对照DMEM/PS

柱2：未稀释的PHCMV上清

柱3：MAb425-CH3上清1∶14稀释(据EGF-γ-ELISA的结 果)

柱4：MAb425-CH3上清1∶28稀释(据EGF-γ-ELISA的结 果)

柱5：未稀释的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清(1.76×10^-10 Mol/L^*)

柱6：MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清1∶2稀释

柱7：MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清，未稀释(2.0×10^-10 Mol/L^*)

柱8：MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清1∶2，稀释^*IL-8浓度以 ELISA(Amersham)测定

纵轴：每个计数区的细胞数目

图3b：

纯化IL-8介导的趋化作用

纵轴：每个计数区的细胞数目

横轴：IL-8浓度(Mol/L)

图4：

MAb425-CH1-IL-8(E.Coli)介导的趋化作用：

点：大肠杆菌中表达的MAb425-CH1-IL-8

正方形：大肠杆菌中表达的MAb425-F(ab’)

三角形：Dulbecco’s/BSA对照

纵轴：每个计数区的细胞数目

横轴：浓度(Mol/l)

图5：

COS-7转染上清对过氧化物释放的诱导

柱1：未被刺激的细胞

柱2：IL-8 10^-7M

柱3：未稀释的MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清(2.0×10^-10 Mol/L^*)

柱4：未稀释的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清(1.76×10^-10 Mol/L^*)

柱5：未稀释的MAb425-CH3上清(OMol/L^*)

*IL-8的浓度由ELISA(Amersham)测定

纵轴：光密度在550nm

图6：

以COS-7转染上清液诱导MPO释放：

柱1：未被刺激的细胞

柱2：用细胞松驰素B刺激的细胞

柱3：IL-8 10^-7M

柱4：未稀释的MAb425-CH3上清液

柱5：MAb425-CH3上清液1∶2稀释

柱6：未稀释的MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液

柱7：MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液1∶2稀释

柱8：未稀释的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液

柱9：MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液1∶2稀释

纵轴：与总的MPO量(100％)相比的％MPO活性

所有微生物、细胞素、质粒、启动子、抗性标记，复制起始点，限 制性位点或申请中提到的其它片段都是商品化的或可普遍得到的。 如果没有给出其它提示，它们仅用作例证，而不是本发明所必需 的，并可相应地被其它合适的工具和生物材料代替。

本发明所必需的相关技术在下文中详尽叙述，其它未详细描述 的技术与已知标准方法相符，这些方法或为技术熟练人员熟知或在 引用的参考文献，专利申请和标准文献(如：“Atibodies，A Labora- tory Manul”，Harlow，Lane，Cold Spring Harbor，1988)中有更详 细的描述。

单克隆抗体

MAb425是抗人A431癌细胞系(ATCC CRL 1555)的IgG1鼠 单克隆抗体。MAb425结合于人EGF受体外部功能区的多肽表位并 与EGF竞争结合。MAb被发现在体外介导肿瘤细胞毒性，并抑制 表皮及直肠结肠肿瘤源细胞系肿瘤细胞的生长(Rodeck et al.， Cancer Res.47：3692，1987)。MAb425的人化或嵌合体转型在 WO92/15683中已公开。

趋化因子

编码趋化因子的CDNA既可以从英国Biotechnology(生化技 术)公司购买(人IL-8 BBG44：Hermann Biermann GmbH，Bad Nauheim FRG)或由产生人细胞系U937(ATCC CRL 1593)的细胞 因子中分离出的mRNA产生从产生趋化因子的细胞中得到的总 mRNA是用生产厂家介绍的RNA201(WAK-Chemie，Germany) 分离的。此RNA随后被转录成CDNA，编码趋化因子的序列使用 从已发表的DNA序列推测出的合适引物进行PCR扩增。

载体

PUC19是一系列有关高拷贝数大肠杆菌质粒克隆化载体的一 部分，并含有PBR322和MBmp19的几部分。PUC19包含可诱导的 细菌乳糖启动子-操纵子，其后是多克隆位点(Yanisch-Oerron et al.，Gene 33：103-109，1985)。PUC载体可作为商品买到(例如： New England Biolabs)。

pBluescipt KS/SK+和KS/SK噬菌体质粒载体来自pUC19。 这些载体都可作为商品买到(Stratagene，Heidelberg)。原核表达载 体是以PUC19载体衍生物，PSW1载体作为基础(Ward et al.， Nature 341：544-546，1989)，PSW1包含一段序列，该序列编码从 Erwinia Carotovora得到的细菌pel基因的前导肽。外来DNA被导 入框架，在pelB前导序列之后，使得蛋白表达入外周细胞质中。

真核表达载体PHCMV(Gillies et al.，Cell 33：717。1983)包含 有猴病毒40(SV40)的复制起始点和人诞腺病毒的启动子和增强子 区。这个启动子和增强子区的后面是多克隆位点，用以导入表达基 因。在这个载体中，将MAb425重链可变区的嵌合体形式和与在 CH2段末端的趋化因子融合的C_γ1 CH2区相结合以产生MAb425 重链融合蛋白。通过与合适轻链相结合的方式把融合Ig链装入免疫 偶联物中以形成一价抗原结合区，此区域随后可被用于产生一个对 靶抗原特异的二价免疫偶联物。此重链及轻链结构可被装入一个或 分开的载体中。

融合蛋白在真核细胞中的表达

用于表达Fab425趋化因子融合蛋白的真核表达载体的构建

用PCR技术融合Mab425与趋化因子

人C_γ1恒定区作为BamHI/BamHI片段被插入PUC19。这个 Cγ1恒定区包含两个SacII位点：一个位于5’基因内区5’BamHI位 点下游40bp处，第二个位于5’BamHI位点下游580bp及CH3段开 头上游140bp处。第二个SacII位点适于更进一步的亚克隆，因此， 用一个连接子导入一个SnaBI位点会破坏第一个SacII位点。在这 个结构中(ΔSacII Cγ1)从SacII位点向下游的片段能够很容易地被 交换。

1.IL-8从PUC18载体(BglII/EcoRI)上切下并被插入pBlue Script SK⁺(Stratagene GmbH，Heidelberg)(Smal/EcoRI)，从而 去掉BgIII和SamI位点。ΔSacII Cγ1克隆的SacII/×baI片段被插 入pBlueskript SK⁺。两个基因均使用PCR技术以合适的引物扩增：

—对于ΔSacII cγ1：3’引物：CH2段的末端序列和NcoI位点。

5’引物：反向测序引物

—对于IL-8 3’引物：通用测序引物

           5’引物：一个NcoI位点及IL-8起始序列

产物被切下并以SK⁺SacII/EcoRI连接。所得肽序列CH2段 C-末端的丝氨酸被变为甲硫氨酸，IL-8部分N-末端的丝氨酸被变 为甘氨酸。

在两个多肽之间接点上新产生的序列是：

5′AAA GCC ATG GGT GCT3′

   Lys Ala Met Gly Ala cγ1CH2 IL-8(2-72)

使用引物(表1)进行同样步骤以便在两个基因中导入BclI位 点。所得的融合基因在Cγ1恒定区与IL-8基因之间有一个BclI位 点，此融合基因编码CH-2段的全部序列，两上附加氨基酸(缬氨 酸，异亮氨酸)，设有前两个氨基酸(丝氨酸丙氨酸)的IL-8序列。

在两个多肽之间的接点上新产生的序列是： 5′GCC AAA GTG ATC AAA GAA 3′    Ala Lys Val Ile Lys Glu cγ1CH2 IL-8(3-72)

使用SacII和EcoRI限制性位点将PCR产物亚克隆入SK⁺。为 了真核表达的需要，把这些配合基因克隆进pHcmv载体。

                                     表    1

构建物   引物     DNA序列

CH2/NcoI IL-8/NcoI CH2/BclI IL-8/BclI cγ15’ cγ1 3’ IL-8 5’ IL-8 3’ cγ1 5’ cγ1 3’ IL-8 5’ IL-8 3’ 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 5’-TGATCCATGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCG-3’ 5’-GATCTACCTGCCATGGGTGCTAAAGAA-3’ 5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’ 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 5’-CGCGTGATCACTTTGGCTTTGGAGATGGTT-3’ 5’-CTCGTGATCAAAGAACTTAGATGTCAATGC-3’ 5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’

免疫偶联物在真核细胞中的表达需要将含有重链和轻链的载体 DNA引入宿主细胞中。已经介绍有多种不同的方法，如电穿孔， DEAE葡聚糖，磷酸钙，脂质体或原生质体的融合。只要编码免疫 偶联物的重组DNA序列在那种细胞型中被恰当地转录成mRNA， 任何一种宿主细胞型都可以使用。宿主细胞可以是不产生免疫球蛋 白的骨髓瘤细胞，如Sp2/0-AG14(ATCC CRL 1581)，P3× 63Ag8.653(ATCC CRL 1580)或仓鼠细胞例如。CHO-KL(ATCC CCL61)或CHO/DHFR-(ATCC CRL 9096)，或BHK-21(ATCC CCL 10)。为瞬时表达的需要，可以使用COS-1(ATCC CRL 1650) 或COS-7(ATCC CRL 1651)。

免疫偶联物的瞬时表达

表达载体PHCMV包含有猴病毒40(SV40)的复制起始点。细 胞系COS-7是猴细胞系CV-1的一个分支，原细胞系已被转入起始 点缺乏的SV-40病毒。因此，含有SV40复制起始点的质粒将会被 扩增，免疫偶联物的产物也将会增加。72小时后收集上清液，用 ELISA检测EGF受体的结合情况及趋化因子浓度。

免疫偶联物的永久表达：

把含有表达免疫偶联物的重组结构的载体导入合适的宿主细胞 中。重链和轻链结构可以被装入同一个或分开的不同载体中；在后 一种情况中，两个载体可以带有同一选择标记，如新霉毒抗性或二 氢叶酸还原酶(DHFR)。或者带有二个不同的选择标记用于两个载 体都存在时的筛选。DHFR标记的选择只能在DHFR负性细胞系如 CHO/DHFR-中进行。为了表达免疫偶联物，可以使用EGF受体特 异性的ELISA分析混合种。对阳性克隆进一步的筛选可使用限度 稀释克隆法进行。

M425趋化因子免疫偶联物的纯化

由宿主细胞制造的M425免疫偶联物可以使用任何一种合适的 方法进行收集和纯化，例如使用靶抗原、抗细胞因子抗体或抗个性 基因抗体的亲合谱法(例如：Harlow，lane，I.c.)。

本发明中使用经标准方法(如：Kostelny et al.(1992)，J.Im- munol，148，1547)，由MAb425制取的抗个性基因抗体进行纯化。

为了获得纯的FV-免疫偶联物，将表达质粒(见下)转入适于蛋 白表达的大肠杆菌菌株。细胞生长到OD₅₇₈＝0.5，并用异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷(IPTG)(ImM)诱导。细胞生长过夜，收集上清液及细 胞。上清液用一个依据标准步骤制备的抗MAb425，抗个性基因的 谱柱进行分离。以含有0.5M Nacl的磷酸盐缓冲液洗柱，结合在 柱上的蛋白用PH＝2.5的含0.5M Nacl的100mm甘氨酸洗脱。洗 脱液立即用PH8.0的2.5M Tris中和，将含有MAb425-CH1-IL-8 的各部分合并，浓缩并对PBS透析。

用于Fab425-趋化因子的原核表达载体的构建及Fv-趋化因子 融合蛋白的表达

Fv片段依据Glock shuber等人的方法制成(Bit-chemistry 29： 1362-1367，1990)。编码轻链和重链Fd片段或Fv片段的DNA序 列被导入PSW1载体的多克隆位点中。轻链成熟编码序列，重链成 熟编码序列及Fv编码序列位于细菌pelB基因的前导肽之后。重链 的编码序列包含一个NcoI(3’末端)位点。以PCR修饰编码CDNA 的趋化因子以导入NcoI(5’末端)和NotI(3’末端)或EcoRI(用于 Fv融合)限制性位点。在框架中，趋化因子基因被直接融合于重链 的CH1区或Fv段。相应地，一个连接肽，例如(Gly-Gly-Gly-Gly- Sex)x，这里x可为1到4，可被导入CH1区和趋化因子基因之间。 这种连接子及其制作方法可从文献(如Curtis等，1991，Proc、 Natl、Acad、Sci、U.S.A，88，5809)中得知。

这些载体使功能性F(ab’)(＝CHI)及Fv-趋化因子，融合蛋白 在大肠杆菌中的有效表达成为可能。轻链和重链-趋化因子融合蛋白 定位于在可诱导的乳糖启动子(Skerra和Pluckthun，Science 242： 1038-1040，1988)调控下的单二顺反子信使RNA上，因此，Fab/ Fv-融合蛋白的表达可根据对培养条件的要求来诱导。从二顺反子 信使RNA上翻译，两个蛋白倾向于合成等量的Fd-趋化因子融合 蛋白和轻链，以增加正确装配入功能性Fab/Fv融合蛋白的可能性。 这两个多肽被分泌入大肠杆菌外周胞质中，在那里发生二硫键的折 叠，形成并装配入功能性Fab 425 CH1/Fv融合蛋白中。延长细菌的 培养可导致大肠杆菌外膜的部分渗透性使得融合蛋白可扩散入培养 基中。

Mab425免疫偶联物的结合作用

Mab425免疫偶联物的结合性质用EGF-受体特异性的ELISA 测定。简言之，就是微滴定度板在4℃用纯化的EGF-受体包被过 夜。用含有融合蛋白的上清液或含有未被偶联的Mab片段的上清液 孵育该板。洗板以移去未被结合的材料，然后平板先用偶联于过氧 化物酶的羊抗人IgG及IgM(重链和轻链)，再用底物孵育，以检测 结合于EGF-受体的抗体。在490nm测定结合的EGF-受体特异性 蛋白的量。

Mab425-IL-8免疫偶联物的生物活性

效应细胞的分离

为了检测生物活性，按Hoslett等(Am.J.Pathol 119：101- 110，1985)以前所述，从健康供血者的全血中新鲜分离出人外周血 嗜中性粒细胞。离心分离血浆，用葡聚糖沉降法分离红细胞，最后 用percoll-梯度离心法分离淋巴细胞和白细胞。分离出的中性粒细 胞立即使用。

趋化活性的检测

趋化性的检测依据Fald等(J.Immunol Methocls 33：239-247， 1980)所述方法进行。简言之，就是使用48boyden chamber及5um 的膜，纯化的中性粒细胞以1×10⁶细胞/ml的浓度被重新悬浮于 DEME介质中(DEME，1％青霉素，1％链霉素，10％FCS，2mM L谷氨酰胺，1mM谷铜酸钠，10mM HEPES)。含有融合蛋白的上 清液或对照上清液放入下面的孔中，以膜覆盖上面的孔中盛装细胞 悬液。在37℃孵育30分钟后，把膜移去并在2％戊二醛。中将膜固 定10分钟。然后，在魏格特氏铁苏木精染剂中将粘附于膜上的细胞 染3分钟。在显微镜下，测定结合于膜的细胞数目。

在中性粒细胞中诱导酶释放能力的测定

为评估这些免疫偶联物在中性粒细胞中诱导颗粒释放的能力， 要控制上清液中髓过氧化物酶的活性(Henson等，J.Immunol 121： 851；1978)试验在每孔5×10⁵个细胞的96孔微量滴定度板中进行。 与刺激物孵育(37℃)后，离心滴定度板，并把不含细胞的上清液转 移到另一个96孔微量滴定度板中。这个不含细胞离的上清液与二茴 香胺(作为底物)孵育并在492nm测定吸收度使用浓度为10^-7M的 FMLF作为阳性对照。为测定全部酶含量，以溶解未经 刺激的细胞。以对全部酶含量(溶解)的百分比计算活力。

过氧化物释放能力的测定

细胞素C可被O^2-所还原并因此改变它的吸收度。这个吸收 度的变化对估计过氧化物的活性是一个有价值的标志。此试验依据 Guthrie等(J.Exp.Med 160：1656-1671，1984)所述方法在每孔5 ×10⁵个细胞的96孔微量滴定度板中进行。将刺激物与细胞素C 孵育后，离心平板，在550nm测定上清液的吸收度。

进一步的免疫偶联物

据以上描述，已经制备并研究了抗EGFR-CH1，-CH2-，CH3 及Fv的免疫偶联物(带有/不带有限制性位点和连接子)，它们包含 有作为趋化因子组分的MIP-2α及MIP-2β。这些结构显示出与IL-8 分枝相似的性质。

免疫偶联物的用途

本发明的免疫偶联物可为目的给药于病人。因此，本发明 的目的之一是提供一种药物配方，它包含有至少一个在上文及权利 要求中定义的融合蛋白作为活性成分，并辅以一种或多种药学许可 的载体，赋形剂或稀释剂。

本发明中的免疫偶联物典型的给药方式是静脉内或胃肠外注 射。一般来说，这些免疫偶联物给药的剂量范围很广足以产生目标 肿瘤的抑制及肿瘤溶解效应。这个剂量依赖于病人的年龄，个体条 件，性别及疾病程度，并可以在0.1mg/kg到200mg/kg之间变动， 倾向于选择每日剂量在0.1mg/kg到100mg/kg之间，一次或多剂 量给药，持续一天或几天。

胃肠外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬液及乳剂。 非水溶剂可以是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油和可注射的有 机酯如油酸乙酯，以及在技术上已知的适于这些意图的其他溶剂。 本项发明的免疫偶联物可被用在一种含有生理学许可的载体的成分 中。这些合适的载体可以是盐水，PBS，林格氏溶液及乳酸化的林格 氏溶液。防腐剂和其他添加剂如抗菌素，抗氧剂及螯合剂也可以出 现在药物配方中。

所提请发明的药物配方适用于对所有类型肿瘤的，包括黑 素瘤，神经胶质瘤及癌症，也包括血液肿瘤和固体肿瘤。