槲皮素和异槲皮素衍生物的制备方法

槲皮素和异槲皮素衍生物的制备方法

本发明涉及式Ⅰ化合物的制备方法 其中，m,n和p各自独立地为2-8的整数，并且 R¹为OH或 其特征在于式Ⅱ化合物 其中m,n和p各自独立且其定义同式Ⅰ， 在水性介质中进行酶裂解。

为了达到本发明的目的，其中基团R¹为OH的式Ⅰ化合物作为槲皮素 衍生物。为了达到本发明的目的，其中基团R¹为下式的式Ⅰ化合物 看作异槲皮素衍生物。为了达到本发明的目的，式Ⅱ化合物作为卢丁衍 生物。

式Ⅰ化合物具有一或多个优点，例如抗氧化、心血管、抗病毒、前 列腺素-代谢-影响和/或解痉性质。在与其它类黄酮的混合物中，它们具 有协同作用，例如催泻性质。

式Ⅰ槲皮素和异槲皮素衍生物比起槲皮素和异槲皮素本身来说在水中 具有更好的溶解性。另外，它们含有较少的颜，因此更适合用于化妆 品。另外，它们具优势地适合用于食物行业。

制备式Ⅰ化合物已知方法的缺点是它们使用毒性化合物和/或有机溶 剂。

因此，本发明的目标是寻那些可以避免或至少可以降低已知方法缺 点的槲皮素和异槲皮素衍生物的制备方法，特别是提供一种简单的方法。

现已出人意料地发现，如果制备式Ⅰ化合物的方法

其中m,n和p各自独立地为2-8的整数，并且基团R¹为OH或 是在如下的条件下进行的话，即式Ⅱ化合物， 其中m,n和p定义同式Ⅰ，在水性介质中进行酶裂解，那么上述目标即 可以实现。

本发明方法特别值得注意的是这样一个事实：式Ⅰ化合物是以简单的 方式从非毒性物质制备得到的。后处理过程被简化，例如在本发明条件 下产品的溶解度比起始原料出人意料的低很多。本发明方法的另一个优 点是式Ⅰ化合物两种R¹含义下所有等价的取代化合物均可从单一地起始 物质来制备。

本发明还提供了食物，所述的食物富含一或多种式Ⅰ化合物，本发 明还提供了式Ⅰ化合物作为食物的用途。

根据本发明，富含了一或多种式Ⅰ化合物的食物包括所有适合动物或 人类消耗的物质，例如维生素或其前维生素，脂肪，矿物质或氨基酸。 根据本发明，富含了一或多种式Ⅰ化合物的食物还可是单一天然来源的 食物，例如糖，未甜化的果汁，单一植物种属的花蜜或果泥，例如未甜 化的苹果汁(例如包括不同种类苹果果汁的混合物)，葡萄汁，橙汁，炖 苹果，杏花蜜，番茄汁，番茄酱，番茄果泥等。

根据本发明，富含了一或多种式Ⅰ化合物食物进一步的例子是单一植 物种属的玉米和谷物以及从这些植物种属中制备得到的物质，例如谷物 浆，黑麦粉，小麦片或燕麦糠。根据本发明，以下食物的混合物也适合 富含一或多种式Ⅰ化合物，例如多种维生素制剂，矿物质混合物或糖化 果汁。根据本发明，可以提及的可富含一或多种式Ⅰ化合物的食物进一 步的实例是食物制剂，例如精制麦片，烤制的产品，混合饮料，为儿童 特制的食物，例如酸乳酪，饮食食物，低热量的食物或动物饲料。

根据本发明，富含了一或多种式Ⅰ化合物的食物还包括碳水化合物、 脂类、蛋白质、无机元素、痕量元素、维生素、水以及植物和动物活性 代谢成分的所有可口的组合。

根据本发明，富含了一或多种式Ⅰ化合物的食物以及含有一或多种式 Ⅰ化合物的食品添加剂优选的是经口服采用，例如采取食物、药丸、片剂、 胶囊、粉末、糖浆、溶液或悬浮液的形式。

根据本发明，富含了一或多种式Ⅰ化合物的食物可以利用本领域内专 家已知的技术来制备。

进一步的，本发明提供了包含一或多种式Ⅰ化合物的化妆品或药物制 剂以及一或多种式Ⅰ化合物在化妆品或药物制剂中的用途。包含一或多 种式Ⅰ化合物的化妆品制剂以及一或多种式Ⅰ化合物在化妆品制剂中的 用途是优选的。

大约在30年以前，一般认为阳光具有作用并且是安全的，原因是 其可以合成维生素D。近年来，这个观点有很大改变，而且不仅仅来自医 学角度。与天然和人为日照有关的潜在危险被推到了意识的前沿。特别 地，随着对于有关日光对皮肤老化和皮肤癌形成作用知识的了解，人们 的行为已经有所改变。

正如所知的，皮肤对太阳射线是很敏感的，其不仅可以引起最初的晒 黑或红斑，而且还会带来严重或轻微的烧伤。

太阳射线还具有其它副作用：它们可使皮肤丧失弹性并形成皱纹， 从而导致皮肤早期老化。在一些情况下，还可以观察到皮肤病，在极端 的情况下，会导致皮肤癌。

另外还需要保护头发免受光化学损伤，以防止其在颜、漂染方面的 改变或机械性质的损伤。

正如所知的，太阳射线中最有害的部分来自波长小于400nm的紫外线。 人们还认识到地球大气层中存在的臭氧层可以吸收部分太阳射线，可以 到达地球表面的紫外线的下限约为280nm。

因此在日光保护领域内的主要目标实际上是提供对于UVB和UVA照射 的良好保护。

本发明式Ⅰ化合物可以单独(当然也可以联合)和其它来自不同级别 物质(单独或联合的)的光保护过滤物质一起用于化妆品或药物制剂中。 其它级别物质的光保护过滤物质有有机或无机UVA和UVB过滤物质、IR 过滤物质或VIS过滤物质。特别优选的是与有机UV过滤物质或其混合物 的组合。

因此本发明提供了一或多种式Ⅰ化合物在化妆品制剂中的用途，尤 其是作为UV过滤物质的用途，例如防晒霜、皮肤霜或皮肤凝胶、发胶或 化妆棒。

进一步合适的有机UV过滤物质包括本领域技术人员已知的所有UVA和 UVB过滤物质。从专业文献上可以到大量针对两个UV区域所尝试和实 验过的物质，例如：

亚苄基樟脑衍生物，如

-3-(4’-甲基亚苄基)-d1-樟脑(例如Eusolex6300)，

-3-亚苄基樟脑(例如MexorylSD)，

-N-{(2和4)-[(2-氧代硼(oxoborn)-3-亚基)-甲基]苄基}丙

烯酰胺的聚合物(例如MexorylSW)

-N,N,N-三甲基-4-(2-氧代硼(oxoborn)-3-亚基甲基)-苯胺鎓甲

基硫酸盐(例如MexorylSK)或

-α-(2-氧代硼(oxoborn)-3-亚基)甲苯-4-磺酸(例如Mexoryl SL)。

苯甲酰基-或二苯甲酰基甲烷，例如

-1-(4-叔丁基苯基)-3-(4-甲氧基苯基)丙烷-1,3-二酮(例如Eusolex

9020)或

-4-异丙基二苯甲酰基甲烷(Eusolex8020)，

苯并苯酮，例如

-2-羟基-4-甲氧基苯并苯酮(例如Eusolex4360)或

-2-羟基-4-甲氧基苯并苯酮-5-磺酸及其钠盐(例如UvinulMS-

40)，

甲氧基肉桂酸酯，例如

-甲氧基肉桂酸辛酯(例如Eusolex2292)，

-4-甲氧基肉桂酸异戊酯，例如其异构体混合物(例如Neo Heliopan

E1000)，

水杨酸酯衍生物，例如

-2-乙基己基水杨酸酯(例如EusolexOS)，

-4-异丙基苄基水杨酸酯(例如Megasol)或

-3,3,5-三甲基环己基水杨酸酯(例如EusolexHMS)，

4-氨基苯甲酸及其衍生物，例如

-4-氨基苯甲酸，

-4-(二甲基氨基)苯甲酸2-乙基己基酯(例如Eusolex6007)，

-4-氨基苯甲酸乙氧化的乙酯(例如UvinulP-25)，

以及其它物质，例如

-2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸2-乙基己酯(例如EusolexOCR)，

-2-苯基苯并咪唑-5-磺酸及其钾盐、钠盐和三乙醇胺盐(例如Eusolex

232)，

-3,3’-(1,4-亚苯基二亚甲基)-双(7,7-二甲基-2-氧代双环[2.2.1]

庚-1-基甲磺酸及其盐类(例如MexorylSX)以及

-2,4,6-三苯胺基-(对-碳(carbo)-2’-乙基己基-1’-氧)-1,3,5-

三嗪(例如UvinulT-150)，

这些UV过滤物质通常被混入化妆品制剂中，用量为0.5-10％(重量 比)，优选的是1-8％。

进一步适合的UV过滤物质的实例有

-2-(2H-苯并三唑-2-基)-4-甲基-6-(2-甲基-3-(1,3,3,3-四甲

基-1-(三甲基甲硅烷氧基)-二硅氧烷基)丙基)苯酚(例如

Silatrizole),

-4,4’-[[(6-[4-((1,1-二甲基乙基)氨基羰基)-苯基氨基]-1,3,5-

三嗪2,4-二基)二亚氨基]双-(2-乙基己基苯甲酸酯(盐))(例

如UvasorbHEB)，

-α-(三甲基甲硅烷基)-ω-[三甲基甲硅烷基)氧基]聚[氧(二甲

基)[和约6％的甲基[2-[对-[2,2-双-(乙氧羰基)乙烯基]苯氧

基]-1-亚甲基乙基]以及约1.5％甲基[3-[对-[2,2-双-(乙氧羰基)

乙烯基)苯氧基)丙烯基)以及0.1-0.4％(甲基氢]亚甲硅烷氧

基]](n=60)(例如ParsolSLX)。

-2,2’-亚甲基双(6-(2H-苯并三唑-2-基)-4-(1,1,3,3-四甲基丁

基)苯酚(例如TinosorbM),

-2,2’-(1,4-亚苯基)双(1H-苯并咪唑-4,6-二磺酸，单钠盐)(例

如Neo HeliopanAP)以及

-2,4-双{[4-(2-乙基己基氧)-2-羟基]苯基}-6-(4-甲氧基苯基)

-1,3,5-三嗪(例如TinosorbS)。

这些有机UV过滤物质通常被混入化妆品制剂中，用量为0.5-20％(重 量比)，优选的是1-15％。

可能的无机UV过滤物质来自二氧化钛，例如包衣的二氧化钛(例如 EusolexT-2000)，氧化锌(例如Sachtotec)，氧化铁或氧化铈。 这些无机UV过滤物质通常被混入化妆品制剂中，用量为0.5-20％(重量 比)，优选的是2-10％。

在这些式Ⅰ化合物与其它UV过滤物质一起存在的制剂中，式Ⅰ化合物 作为抗氧剂和游离基清除剂发挥作用。另外，使用这种制剂，可以获得 宽带的UV保护作用。本发明还提供了一或多种式Ⅰ化合物在化妆品制剂 中作为UV过滤物质、抗氧剂和/或游离基清除剂的用途。

本发明还进一步提供了保护皮肤和/或天然或敏感化头发免受日光侵害 的方法，该方法是将含有一或多种式Ⅰ化合物作为光保护过滤物质的化 妆品应用于皮肤或头发上。

如有所需，本发明防晒产品中还可以包含一或多种具有自鞣性质的化 学物质。

可以利用的具有自鞣性质的化学物质可以是本领域技术人员已知的适 合用于化妆品制备的所有天然和合成物质。它们可以是蔬菜提取物或合 成的自鞣剂，例如二羟基丙酮或α-乙酮醇。

进一步地，本发明制剂还可以用于皮肤炎症和过敏的预防性， 在一些情况下，可以防止一些类型的癌症。

本发明制剂可以用作保护人类皮肤或头发或敏感头发的制剂，也可以

作为防晒产品。 “敏感头发”的含义是指受到永久性电烫或者上或漂染处理的头发。

本发明化妆制品可以用来保护人类皮肤免受日光照射。为了达到这 一目的，其可以采取这类产品的各种常规形式。因此它们可以采取洗液 或乳剂，例如霜剂或洗面奶(O/W,W/O)，也可以采取油性-醇性、油性- 水性或水性-醇性凝胶等形式，还可以采取固体棒形式或配制成气溶胶。

制剂可以含有这类制剂常用的化妆辅助剂，例如增稠剂、润滑剂、 加湿剂、界面活性剂、乳化剂、防腐剂、抗泡沫剂、香料、蜡、羊毛脂、 推进剂、染料和/或颜料(它们使组合物本身带有颜或给皮肤上)， 或常规用于化妆品的其它成分。

分散剂或助溶剂可以是油、蜡或其它脂肪类物质，低级单醇或低级 多醇或其混合物。特别优选的单醇或多醇包括乙醇、异丙醇、丙二醇、 甘油和山梨醇。

本发明优选的实施方案是以保护霜或奶形式存在的乳剂，其除了含 有式Ⅰ化合物作为UV过滤物质以及适当时进一步含有光保护过滤物质之 外，还包含脂肪醇、脂肪酸，脂肪酸酯(特别是脂肪酸三甘油酯)、羊毛 脂或者天然或合成的油或蜡以及当水存在情况下的乳化剂。

进一步优选的实施方案是基于天然或合成油和蜡、羊毛脂、脂肪酸 酯，特别是脂肪酸三甘油酯的油性洗液，或者是基于低级醇(例如乙醇 或甘醇(如丙二醇)和/或多醇(例如甘油))以及油、蜡和脂肪酸酯(例 如脂肪酸三甘油酯)的油性-醇性洗液。

本发明的化妆制品也可以采取醇性凝胶的形式，其中包含一或多种 低级醇或低级多醇(例如乙醇、丙二醇或甘油)以及增稠剂(例如二氧 化硅)。油性-醇性凝胶进一步包含天然和合成的油和蜡。

固体棒由天然和合成的蜡和油、脂肪醇、脂肪酸、脂肪酸酯、羊毛 脂以及其它脂肪类物质组成。

如果制剂被配为气溶胶，通常使用常规的推进剂，例如烷烃、氟烷 烃和氯代氟烷。

如果本发明组合物的目标是保护天然或敏感化头发免受日光照射， 其可以采取用于冲洗的香波、洗液、凝胶或乳化剂等形式，在这种情况 下，可在香波使用前或后、上或漂染前或后，或永久性电烫的前或后 应用有关的制剂；或使组合物采取用于造型和处理的洗液或凝胶形式， 用于刷或吹风烫的洗液或凝胶形式以及头发喷雾剂、永久性电烫组合物、 头发上剂或漂染剂等形式。此组合物除了包含式Ⅰ化合物作为有机UV 过滤物质以及在合适的情况下进一步包含光保护过滤物质外，它还可以 含有这类组合物常用的各种辅助剂，例如界面活性剂、增稠剂、聚合物、 润滑剂、防腐剂、泡沫稳定剂、电解质、有机溶剂、硅酮衍生物、油、 蜡、抗脂肪剂、染料和/或颜料(它们使组合物本身带有颜或给头发上 )，或常规用于头发护理的其它成分。

根据本发明，采用本领域技术人员已知的技术可以制备得到化妆制 品。

对于式Ⅰ化合物而言，优选的是那些其中的基团R¹具下式的化合物： 这些式Ⅰ化合物也指上述或下述式Ⅰ*化合物 其中m*,n*和p*各自独立地为2-8的整数。

本发明也涉及这些式Ⅰ*化合物。

出人意料的是，现已发现式Ⅰ*化合物是无的。

在式Ⅰ或Ⅰ*化合物中，m,n和p或m*,n*和p*在各种情况下均各 自独立地为2,3,4,5,6,7或8。优选地，m,n和p或m*,n*和p* 在各种情况下均各自独立地为2,3或4。特别优选地，m,n和p或m*, n*和p*是相同的，更为特别优选地，m,n和p或m*,n*和p*为2。

根据本发明，富含了一或多种式Ⅰ*化合物的食物以及包含一或多种 式Ⅰ*化合物的化妆品制剂是特别优选的。因此，一或多种式Ⅰ*化合物作 为食品添加剂的用途及其用于化妆品制剂的用途(例如作为UV过滤物质) 也是特别优选的。

本发明提供了具有优势的制备式Ⅰ化合物的方法，该方法是在水性介 质中使式Ⅱ化合物进行酶裂解。根据本发明，将式Ⅱ化合物溶于水中， 使之与适量的酶进行接触。反应优选的是在彻底混合(例如搅拌)下进 行。

根据本发明的方法，既可以制备式Ⅰ槲皮素衍生物也可以制备式Ⅰ 异槲皮素衍生物。然而优选应该是：按照本发明的方法，或实质上仅制 备式Ⅰ槲皮素衍生物，或实质上仅制备式Ⅰ异槲皮素衍生物。

用于本发明过程中合适的酶是水解酶。优选的是使用分离自菌株斜卧 青霉的水解酶，特别是柚苷酶和橙皮苷酶。更特别优选的使用柚苷酶。

根据本发明，反应过程所用的起始物质和酶均有市售或可用本领域内 专家熟知的方法分离或制备得到，这些可以参见文献中的描述(例如 Houben-Weyl的标准工作手册，Methoden der organischen Chemie(有 机化学方法)，Georg-Thieme-Verlag,Stuttgart)。

根据本发明，合适的反应温度在15-80℃之间。本发明方法优选的是 在30-50℃下进行，特别优选的是于35-45℃下进行。

如果反应的温度太低，反应速率会很慢。相反，如果反应的温度太高， 身为蛋白质的酶会变性并失活。

根据本发明，反应过程中合适的pH在3-8之间。优选的pH是在4.5-7 之间，特别优选的pH是在4.8-6.8之间。然而，进一步优选的pH可以 根据所用酶的不同在一个给定的范围内进行变化。

例如，如果使用柚苷酶的话，优选的pH范围为6.4-6.8。

优选地，反应是在用缓冲系统调节pH的情况下进行的，可以使用所有 适合建立上述pH范围的常规缓冲系统，然而优选的是使用柠檬酸缓冲液。

根据本发明方法起始物质与水的合适的重量比为0.001∶99.999至40∶ 60。根据本发明，优选的起始物质与水的重量比为0.005∶99.995至20∶ 80，特别优选的是0.5∶99.5至10∶90。

根据本发明方法酶与起始物质的合适的重量比为0.005∶99.995至50∶ 50。根据本发明，优选的酶与起始物质的重量比为0.5∶99.5至30∶70， 特别优选的是2∶98至20∶80。

根据本发明，为了制备式Ⅰ异槲皮素衍生物，反应应按照以下方式进 行：如果所用的酶为柚苷酶，反应优选的是在35-40℃且pH为6.4-6.8 下进行约12-18小时。在这种情况下，优选的是连续对反应进行监测。 以合适的方式延长反应时间，可以制备得到式Ⅰ异槲皮素衍生物。

反应的进程、结束以及反应产物的分析均可用HPLC进行监测，例如 使用标准的HPLC仪器以及含有C₁₈-烷基包裹的反相物质的柱子。

另外，反应的进程及结束也可用薄层层析(TLC)进行监测。

当反应完成后，反应混合物一般由水、缓冲剂、酶、小量未反应的起 始物质、鼠李糖、式Ⅰ槲皮素和/或异槲皮素衍生物以及(任意地)葡萄 糖组成。通过常规的方法可以分离式Ⅰ槲皮素和/或异槲皮素衍生物。为 了达到本发明的目的，“常规处理”的含义如下：

将反应混合物冷却，例如至0℃。将在冷却过程中结晶出来的式Ⅰ槲 皮素和/或异槲皮素衍生物从反应混合物中分离出来，例如采用抽滤或减 压过滤，或对沉淀结晶进行离心。洗涤固体，优选的是用水，然后进行 干燥，例如在50℃且压力为200mbar的条件下。

反应产品进一步的纯化或需要进行式Ⅰ槲皮素和/或异槲皮素衍生物的 彼此分离时，可以采用HPLC等手段。

水、缓冲剂、酶、小量起始物质、鼠李糖以及(任意地)葡萄糖留在 滤液中。

用已知的方法可将残留在滤液中的物质分离出来，例如通过超滤、 使滤液通过阳和/或阴离子交换剂、结晶和机械分离(例如过滤)等方法。 存在于滤液中的任何葡萄糖也可以通过酵母发酵分离出来。

处理步骤中产生的物质(例如酶)可以循环使用，继续进行反应。

即使没有进一步的细节，我们也可以肯定本领域技术人员会在广义上 利用上述的内容。因此优选的实施方案仅仅是为了描述本发明，而不是 以任何方式限制本发明。

上文和下文所列全部申请书和出版物完整的公开内容均通过参考文 献被引入本申请。

下列实施例是为了描述本发明，而不应看作是对本发明的限制。

实施例

所供应物质来源如下： 三(羟基乙基)卢丁：Merck KgaA,Article No.50111902 柚苷酶：          Sigma,Article No.N-1385

监测反应并用HPLC分析产品。 采用标准HPLC设备的HPLC条件： 柱：      LiChroSorbRP18(用C₁₈-烷基包裹的反相物质，颗粒大 小为5μm(Merck KGaA,Article No.151355)) 流动相：  乙腈和水的混合物(体积比为20∶80,pH2.6)， 流速：    1ml/分钟， 波长：    260nm， 温度：    30℃， 样品体积：10μl， 样品制备：将5mg样品溶于3ml甲醇中，用流动相使之体积达到10ml， 保留时间：三羟基乙基卢丁：10.1分钟，

      三羟基乙基异槲皮素：11.4分钟，

      三羟基乙基槲皮素：42.7分钟。

实施例1

将5g三(羟基乙基)卢丁溶于150ml去离子水中，加入0.64g柠檬 酸和1.4g 32％的氢氧化钠水溶液pH至6.6。加入0.5g柚苷酶，使反应 混合物在40℃下搅拌16小时。常规处理，得到2.41g三(羟基乙基)异 槲皮素，纯度为96％。