用于裂解细胞的方法

用于裂解细胞的方法

本发明涉及用于裂解细胞尤其是细菌细胞和分离核酸的方法。将样品用包含与水不能混溶的至少一种液体的裂解溶液处理且加热。然后将混合物冷却并且加入水，使得在冷却后生成两相系统。核酸可以在水相中到。

发明背景

核酸例如DNA广泛用于分子生物学领域中用于研究和临床分析。用于分析DNA的常见方法是DNA印迹、通过诸如聚合酶链反应（PCR）的方法扩增、和测序。使用这些方法，测定DNA序列中的差异，以帮助基因鉴定、体筛选、病原体鉴定和诊断测试。所有这些分析都需要纯化的DNA样品作为一致和有效结果的基础。

核酸分离步骤一般在核酸的分析和体外操作前，以便使核酸不含不需要的污染物，所述污染物可以干扰后续处理程序。对于研究和诊断分子生物学的绝大多数程序，需要提取的核酸作为第一个步骤。在一般的DNA提取方案中，收获且裂解含有目的核酸的细胞。

细胞裂解是在用基于核酸的方法例如PCR和克隆技术进一步处理前，通过破坏细胞膜从细胞中释放材料的过程，并且特别是从细胞中提取细胞内材料以分离DNA或RNA的过程。

通过细胞破裂的细胞裂解方法可以分类成机械方法和非机械方法。

机械方法包括超声破碎、使用匀浆器的破坏、使用例如弗氏压碎器等的挤压、减压、粉碎等。非机械方法包括化学方法、热方法、酶促方法等。

其为非机械方法的化学方法使用例如酸、碱、去污剂、溶剂、离液试剂等。尤其地，使用去污剂的化学方法被广泛使用。去污剂破坏脂质双膜以释放细胞内容物且裂解膜蛋白质。去污剂最常用于裂解动物细胞。大多数去污剂使蛋白质变性。然而，用于细胞裂解的试剂是分开添加的，并且因此需要去除试剂的后续过程。可以发生PCR抑制，并且该过程花费长时间。

酶促方法使用溶菌酶、蛋白酶等。

热方法包括冻融、加热、渗透冲击、电冲击等。例如，细胞裂解通过使细胞与热物体例如热板接触或通过重复冷冻至-70℃和解冻至室温的循环来实现。

在US 2006/0141556中，通过将微波辐射到样品上升高样品的温度来执行细胞裂解。蒸气压中的增加通过将两性离子化合物或离子液体加入样品得到预防。

仍存在快速和有效裂解方法的需要。

发明概述

已发现细胞尤其是细菌细胞可以通过下述有效裂解：向样品中加入包含水不混溶的液体的裂解溶液，加热混合物且在冷却后加入水或含水缓冲液以生成两相系统。核酸可在水相中到，并且可直接转移至进一步的下游操作如PCR。

因此，本发明涉及通过下述用于裂解细胞的方法

a）提供包含细胞的样品

b）向样品中加入至少包含水不混溶的液体的裂解溶液

c）将步骤b）中获得的混合物加热至高于80℃的温度

d）在步骤c）中的温度高于100℃的情况下，将样品冷却至低于100℃的温度

e）将水或含水缓冲溶液加入混合物中，从而生成水不混溶的液相和水相。

在优选实施方案中，细胞是细菌细胞。

在优选实施方案中，将混合物加热至100 – 150℃。

在优选实施方案中，在步骤d）中，将样品冷却至20 – 40℃。

在优选实施方案中，在步骤b）中加入的裂解溶液包含至少一种油或至少一种离子液体。在非常优选的实施方案中，它包含至少一种离子液体。

在优选实施方案中，在步骤b）中加入的裂解溶液包含至少一种基于双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺[Ntf₂]的离子液体。这意指离子液体的阴离子是双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺[Ntf₂]。

在优选实施方案中，在步骤b）中加入的裂解溶液包含三己基（十四烷基）鏻三（五氟乙基）三氟磷酸酯[Ttp][Fap]和/或1-丁基-1-甲基吡咯烷双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺[bmpyrr][Ntf₂]。

在对于革兰氏阳性细胞尤其优选的一个实施方案中，在步骤b1）中加入裂解溶液前，使样品与至少一种基于N,N-二甲基乙醇铵[DMAE]的离子液体预温育。这意指离子液体的阳离子是N,N-二甲基乙醇铵[DMAE]。

在一个实施方案中，在步骤e）后，使所得到的混合物与蛋白酶温育。

在一个实施方案中，在步骤e）和与蛋白酶的任选温育后，通过PCR方法特别是通过实时PCR、电泳（琼脂糖或聚丙烯酰胺）或克隆技术如连接或限制性酶消化，直接分析水相中的核酸。

本发明还涉及包含具有水不混溶的液体的一个容器和具有蛋白酶的一个容器的试剂盒。

发明详述

如本文使用的术语“核酸”指本领域技术人员已知的任何类型的DNA或RNA。例子是基因组DNA、信使RNA、质粒DNA。

如本文使用的术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH 7 – pH9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH（参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999）。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液（PBS）、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇（TRIS）缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液（TBS）和TRIS/EDTA（TE）。

待用根据本发明的方法裂解的细胞是所有类型的细胞，优选包含细胞壁的细胞，最优选细菌细胞、真菌细胞、古细菌细胞、藻类细胞或植物细胞。特别优选的细胞是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞，尤其是选自下述的那些：李斯特菌属物种（Listeria spp.）、金黄葡萄球菌（S. aureus）、P. paratuberculosis、沙门氏菌属物种（Salmonella spp.）、空肠弯曲杆菌（C. jejuni）、娄地青霉菌（Penicillum roquefortii）和大肠杆菌（E. Coli）。

根据本发明，样品可以是包含细胞的任何样品。样品可以是例如食物样品，体液特别是血液、血浆或血清，水或组织样品。在优选实施方案中，样品已用包括下述步骤的方法由复杂样品生成：

a）提供复杂样品，

b）使所述样品与下述温育：

-至少一种离液剂，

-缓冲液和

-至少一种去污剂，

c）通过离心或过滤从所得到的混合物中分离所述细胞。关于这个从复杂样品中分离细胞的程序的细节公开于EP 2049677中。

根据本发明的样品还可以通过下述由复杂样品生成

a）提供复杂样品，

b）使所述样品与包含至少MgCI₂和/或离子液体的提取溶液温育

c）优选通过离心、亲和结合和/或过滤，从步骤b）的混合物中分离所述细胞。

关于这个从复杂样品中分离细胞的程序的细节公开于WO 2010145754中。

根据本发明，复杂样品可以是例如食物样品，体液特别是血液、血浆或血清，水或组织样品。一般地，复杂样品具有复杂基质（即尤其其中包含蛋白质、脂质、碳水化合物等）和/或高粘度。

根据本发明，水不混溶的液体是水不混溶的油或水不混溶的离子液体。

适合于根据本发明的方法的油是任何油，其在室温是液体，并且具有高于150℃、更优选高于200℃的沸点以及闪点。此外，油必须是水不混溶的。这意指适合于根据本发明的方法的油当与水在20 – 80℃混合时形成两相系统。关于合适油的例子是有机油、矿物油、硅油或精油（essential oil）。

有机油是包含至少脂肪酸和/或甘油三酯的油。在室温是液体的有机油一般包含链长6 – 30个碳原子的单或多不饱和脂肪酸。合适的有机油的例子是菜籽油和蓖麻油。

矿物油是包含石蜡油和或环烷油的油和/或芳香油。优选的矿物油是包含较重烷烃的混合物的石蜡油，如重白油（CAS 8012-95-1）。

合适的硅油优选是通式R（R₂SiO）_nSiR₃的线性硅油，R彼此独立的但优选在整个分子中等同的是直的或分支C1 - C8烷基残基。合适硅油的一个例子是聚（二甲基硅氧烷）（CAS 63148-62-9）。

关于精油的例子是萜烯或类萜。

如本发明中使用的离子液体或液体盐是由一般的有机阳离子和阴离子组成的离子种类。它们不含任何中性分子且通常具有低于373 K的熔点。

离子液体的领域目前被广泛研究，因为潜在应用是各种各样的。关于离子液体的综述文章是例如

。

一般而言，本领域技术人员已知的通式K⁺A^-的所有离子液体，特别是水不混溶的那些，在根据本发明的方法中是合适的。

离子液体的阴离子A^-一般选自包含卤化物、四氟硼酸盐或衍生物、六氟磷酸盐或衍生物如PF₃（R_f）₃、氰酰胺、硫氰酸盐或者通式[N（R_f）₂]^-或通式[N（XR_f）₂]^-的酰亚胺的组，其中R_f指示具有1 – 8个C原子的部分或全氟取代的烷基，并且X指示SO₂或CO。此处卤化物阴离子可以选自氯化物、溴化物和碘化物阴离子，优选氯化物和溴化物阴离子。

就离子液体的阳离子K⁺的选择而言本身不存在限制。然而，优先给予有机阳离子，特别优选铵、磷、脲阳离子、硫脲、胍盐阳离子或杂环阳离子如吡咯烷阳离子。

铵阳离子可以例如通过式（1）进行描述

其中

在每种情况下，R彼此独立地指示

H，其中所有取代基R不能同时是H、OR’、NR’₂，条件是式（1）中的最多一个取代基R是OR’、NR’₂，

具有1-20个C原子的直链或分支烷基，

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或分支烯基，

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或分支炔基，

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以通过具有1-6个C原子的烷基取代，其中一个或多个R可以部分或完全由卤素特别是-F和/或-Cl取代，或部分由-OH、-OR’、-CN、-C（O）OH、-C（O）NR’₂、-SO₂NR’₂、-C（O）X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，并且其中R中不处于α-位置中的一个或两个不邻近的碳原子可以替换为选自下述的原子和/或原子团：-O-、-S-、-S（O）-、-SO₂-、-SO₂O-、-C（O）-、-C（O）O-、-N⁺R’₂-、-P（O）R’O-、-C（O）NR’-、-SO₂NR’-、-OP（O）R’O-、-P（O）（NR’₂）NR’-、-PR’₂=N-或-P（O）R’-，其中R’ 可以是= H，非、部分或全氟化的C₁-至C₆-烷基，C₃-至C₇-环烷基，未取代或取代的苯基，并且X可以是 = 卤素。

鏻阳离子可以例如通过式（2）进行描述

其中

在每种情况下，R²彼此独立地指示

H、OR’或NR’₂，

具有1-20个C原子的直链或分支烷基，

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或分支烯基，

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或分支炔基，

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以通过具有1-6个C原子的烷基取代，其中一个或多个R²可以部分或完全由卤素特别是-F和/或-Cl取代，或部分由-OH、-OR’、-CN、-C（O）OH、-C（O）NR’₂、-SO₂NR’₂、-C（O）X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，并且其中R²中不处于α-位置中的一个或两个不邻近的碳原子可以替换为选自下述的原子和/或原子团：-O-、-S-、-S（O）-、-SO₂-、-SO₂O-、-C（O）-、-C（O）O-、-N⁺R’₂-、-P（O）R’O-、-C（O）NR’-、-SO₂NR’-、-OP（O）R’O-、-P（O）（NR’₂）NR’-、-PR’₂=N-或-P（O）R’-，其中R’  = H，非、部分或全氟化的C₁-至C₆-烷基，C₃-至C₇-环烷基，未取代或取代的苯基，并且X = 卤素。

然而，排除其中所有四个或三个取代基R和R²完全由卤素取代的式（1）和（2）的阳离子，例如三（三氟甲基）甲基铵阳离子、四（三氟甲基）铵阳离子、或四（九氟丁基）铵阳离子。

脲阳离子可以例如通过式（3）进行描述

并且硫脲阳离子通过式（4）进行描述，

其中

R³至R⁷各自彼此独立地指示

氢，其中氢对于R⁵被排除，

具有1-20个C原子的直链或分支烷基，

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或分支烯基，

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或分支炔基，

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以通过具有1-6个C原子的烷基取代，其中取代基R³至R⁷中的一个或多个可以部分或完全由卤素特别是-F和/或-Cl取代，或部分由-OH、-OR’、-CN、-C（O）OH、-C（O）NR’₂、-SO₂NR’₂、-C（O）X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，并且其中R³至R⁷中不处于α-位置中的一个或两个不邻近的碳原子可以替换为选自下述的原子和/或原子团：-O-、-S-、-S（O）-、-SO₂-、-SO₂O-、-C（O）-、-C（O）O-、-N⁺R’₂-、-P（O）R’O-、-C（O）NR’-、-SO₂NR’-、-OP（O）R’O-、-P（O）（NR’₂）NR’-、-PR’₂=N-或-P（O）R’-，其中R’  = H，非、部分或全氟化的C₁-至C₆-烷基，C₃-至C₇-环烷基，未取代或取代的苯基，并且X = 卤素。

胍盐阳离子可以通过式（5）进行描述

其中

R⁸至R¹³各自彼此独立地指示

氢、-CN、NR’₂、-OR’

具有1-20个C原子的直链或分支烷基，

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或分支烯基，

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或分支炔基，

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以通过具有1-6个C原子的烷基取代，其中取代基R⁸至R¹³中的一个或多个可以部分或完全由卤素特别是-F和/或-Cl取代，或部分由-OH、-OR’、-CN、-C（O）OH、-C（O）NR’₂、-SO₂NR’₂、-C（O）X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，并且其中R⁸至R¹³中不处于α-位置中的一个或两个不邻近的碳原子可以替换为选自下述的原子和/或原子团：-O-、-S-、-S（O）-、-SO₂-、-SO₂O-、-C（O）-、-C（O）O-、-N⁺R’₂-、-P（O）R’O-、-C（O）NR’-、-SO₂NR’-、-OP（O）R’O-、-P（O）（NR’₂）NR’-、-PR’₂=N-或-P（O）R’-，其中R’  = H，非、部分或全氟化的C₁-至C₆-烷基，C₃-至C₇-环烷基，未取代或取代的苯基，并且X = 卤素。

此外，可以采用通式（6）的阳离子

其中

HetN⁺指示选自下述的杂环阳离子

其中取代基

R¹’至R⁴’ 各自彼此独立地指示

氢、-CN、-OR’、-NR’₂、-P（O）R’₂、-P（O）（OR’）₂、-P（O）（NR’₂）₂、-C（O）R’、-C（O）OR’，

具有1-20个C原子的直链或分支烷基，

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或分支烯基，

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或分支炔基，

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，

其可以通过具有1-6个C原子的烷基取代，

饱和、部分或完全不饱和的杂芳基、杂芳基-C₁-C₆-烷基或芳基-C₁-C₆-烷基，

其中取代基R^1'、R^2'、R^3'和/或R^4'一起还可以形成环系统，

其中一个或多个取代基R¹’至R⁴’可以部分或完全由卤素特别是-F和/或-Cl取代，或由-OH、-OR’、-CN、-C（O）OH、-C（O）NR’₂、-SO₂NR’₂、-C（O）X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，但当R^1'和R^4'不能同时由卤素完全取代时，并且当在取代基R¹’至R⁴’中，不与杂原子键合的一个或两个不邻近的碳原子可以替换为选自下述的原子和/或原子团-O-、-S-、-S（O）-、-SO₂-、-SO₂O-、-C（O）-、-C（O）O-、-N⁺R’₂-、-P（O）R’O-、-C（O）NR’-、-SO₂NR’-、-OP（O）R’O-、-P（O）（NR’₂）NR’-、-PR’₂=N-或-P（O）R’-，其中R’  = H，非、部分或全氟化的C₁-至C₆-烷基，C₃-至C₇-环烷基，未取代或取代的苯基，并且X = 卤素。

为了本发明的目的，完全不饱和的取代基也意指芳香族取代基。

适合于根据本发明的方法的与水不混溶的离子液体是水不混溶的离子液体。这意指适合于根据本发明的方法的离子液体当与水在20 – 80℃混合时形成两相系统。与水不能混溶的疏水离子液体例如公开于US 5,827,602中。

根据本发明使用的离子液体优选是液体，即优选地它们在室温（约25℃）是液体。

在优选实施方案中，水不混溶的离子液体的阴离子A^-选自包含通式[N（R_f）₂]^-或通式[N（XR_f）₂]^-的酰亚胺和PF₃(R_f)₃的组，其中R_f指示具有1 – 8个C原子的部分或完全氟取代的烷基，并且X指示SO₂或CO。

在非常优选的实施方案中，水不混溶的离子液体的阴离子A^-是三（五氟乙基）三氟磷酸酯[Fap]，或尤其优选的，它是双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺[Ntf₂]。

已发现水不混溶的离子液体的阴离子A^-对于测定离子液体是否尤其适合于本发明的方法比阳离子更重要。已发现具有三（五氟乙基）三氟磷酸酯[Fap]的离子液体和尤其是具有双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺[Ntf₂]阴离子的那些，当与合适的阳离子组合时不仅提供水不混溶的相，还提供在水相中的核酸富集。

当使用[Fap]或[Ntf₂]阴离子时，水不混溶的离子液体的阳离子优选选自包含

的组，其中取代基R¹’至R⁴’ 各自彼此独立地指示氢或具有1-20个C原子的直链或分支烷基，

和

根据式（2）的鏻阳离子

其中在每种情况下，R²彼此独立地指示

H，或具有1-20个C原子的直链或分支烷基。

待在本发明中使用的优选的水不混溶的离子液体是三己基（十四烷基）鏻三（五氟乙基）三氟磷酸酯[Ttp][Fap]、三己基（十四烷基）鏻双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺、N-丁基二乙醇铵双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺和尤其优选的1-丁基-1-甲基吡咯烷鎓盐双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺[bmpyrr][Ntf₂]。

本发明涉及在至少一种水不混溶的液体的存在下通过热裂解用于裂解细胞的方法。液体不仅在热裂解过程中使用还 – 并且这是甚至更重要的 – 用于在裂解后从混合物中分离核酸。合适的水不混溶的液体的例子是油和离子液体。

使具有待裂解的细胞的样品与包含至少一种水不混溶的液体的裂解溶液接触。一般地，使样品与至少等于样品体积的裂解溶液体积接触。这意指例如如果样品具有5 μl的体积，则它至少与5 μl裂解溶液接触。在优选实施方案中，裂解溶液的体积是样品体积的至少3倍。在非常优选的实施方案中，它是样品体积的至少5倍。

在优选实施方案中，裂解溶液仅包含一种水不混溶的液体，但它还可以包含另外的物质如一种或多种另外的水不混溶的液体。在优选实施方案中，裂解溶液至少包含一种水不混溶的离子液体。

随后将样品和裂解溶液的混合物加热至高于80℃用于热裂解。在优选实施方案中，将它加热至80 – 200℃，非常优选地，将它加热至100 – 150℃。

加热可以通过本领域技术人员已知的任何方法完成，例如在加热块中、使用微波辐射、加热罩或使用超声。

一般地，将混合物在它加热达到的温度温育短时间。温育时间一般范围为2秒到5分钟，取决于选择的温度、待裂解的细胞类型和混合物的体积。

对于核酸的提取，随后使混合物与水或含水缓冲溶液接触。在样品和裂解溶液的混合物已加热至高于100℃的情况下，混合物应在加入水或含水缓冲溶液前冷却至低于100℃。

在优选实施方案中，不依赖于热裂解已发生时所在的温度，混合物然后在加入水或含水缓冲溶液前冷却至温度低于50℃、优选温度4 - 40℃、最优选20 - 40℃。

水或含水缓冲溶液加入混合物导致两相系统的形成 – 一个相包含水不混溶的液体，一个相是包含水或含水缓冲溶液的水相。

加入的水或含水缓冲溶液的pH一般是pH 4 - pH 12。在优选实施方案中，它是pH 6 - pH 10，最优选pH 6.5 - pH 8.5。

一般地，对加入样品和裂解溶液的混合物中的水或含水缓冲溶液的量不存在限制。优选地，水或含水缓冲溶液的体积是样品和裂解溶液的混合物体积的十分之一至10倍。这意指体积比优选是1:10至10:1。在非常优选的实施方案中，它是1:2至2:1。

在加入水或含水缓冲溶液后，优选搅动混合物，以提供两个相的充分混合。这可以例如通过振荡或涡旋完成。

细胞碎片以及变性蛋白质通常在水和水不混溶的液相之间的中间相中。可以分离水相，并且可以从水相中分离核酸，或水相可以直接用于进一步评估，例如用于实时PCR。

已发现尤其具有[Ntf₂]阴离子的离子液体提供水相中的核酸富集。当使用根据本发明的其他水不混溶的离子液体或油时，可以在水相中发现的核酸量一般是约50%或更多，但当使用具有[Ntf₂]阴离子的离子液体时，水相中的核酸量一般可以扩大至高于70%（混合物中的核酸总量）。

在优选实施方案中，在加入裂解溶液前，样品可以与支持裂解的物质预温育。支持裂解的物质是例如去污剂、离液物质或水不混溶的离子液体。已发现与包含铵阳离子的物质尤其是包含铵阳离子的水不混溶的离子液体预温育，特别有利于包含革兰氏阳性细菌细胞的样品。包含铵阳离子的合适物质的例子是根据式（1）的包含阳离子[NR₄]⁺的那些

其中

在每种情况下，R彼此独立地指示

H，

具有1-20个C原子的直链或分支烷基，

具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或分支烯基，

具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或分支炔基，

具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以通过具有1-6个C原子的烷基取代，其中一个或多个R可以部分或完全由卤素特别是-F和/或-Cl取代，或部分由-OH、-OR’、-CN、-C（O）OH、-C（O）NR’₂、-SO₂NR’₂、-C（O）X、-SO₂OH、-SO₂X、-NO₂取代，并且其中R中不处于α-位置中的一个或两个不邻近的碳原子可以替换为选自下述的原子和/或原子团：-O-、-S-、-S（O）-、-SO₂-、-SO₂O-、-C（O）-、-C（O）O-、-N⁺R’₂-、-P（O）R’O-、-C（O）NR’-、-SO₂NR’-、-OP（O）R’O-、-P（O）（NR’₂）NR’-、-PR’₂=N-或-P（O）R’-，其中R’ 可以是= H，非、部分或全氟化的C₁-至C₆-烷基，C₃-至C₇-环烷基，未取代或取代的苯基，并且X可以是 = 卤素。

非离子液体的根据式（1）包含阳离子[NR₄]⁺的合适物质是例如氨水、（NH₄）₂SO₄、NH₄Cl、NH₄COOH。

在非常优选的实施方案中，预温育用至少一种基于N,N-二甲基-2-羟乙基铵[DMAE]的离子液体执行。这些离子液体的阳离子是[DMAE]。阴离子优选选自丙酸盐、乙酸盐、辛酸盐、2-羟基乙酸盐、三氟乙酸盐和2-盐。最优选的用于预温育的离子液体是N,N-二甲基-2-羟乙基铵-2-盐和尤其是N,N-二甲基-2-羟乙基铵-丙酸盐。

预温育一般通过将支持裂解的物质例如离子液体加入样品来执行。支持裂解的物质可以作为纯物质加入或者与水或含水缓冲溶液混合。加入的体积一般是样品体积的10倍至十分之一。如果离子液体用作裂解支持物质，则它们优选预先与水或含水缓冲液混合且随后加入样品。水相中的离子液体量一般是0,05 - 6 M，优选0,5 - 2 M。

可以将支持裂解的一种或多种物质加入样品。

在加入支持裂解的一种或多种物质（例如N,N-二甲基-2-羟乙基铵-丙酸盐）后，一般将混合物在20 – 100℃温育5 – 30分钟。在优选实施方案中，温育在70 – 90℃执行10 – 20分钟。

然后，为了根据本发明执行热裂解，将水不混溶的液体与样品和支持裂解的物质混合。

在另一个优选实施方案中，在已执行热裂解和已加入水或含水缓冲溶液后，两相系统可以用蛋白酶处理，以释放粘住蛋白质或细胞碎片的核酸。关于这点的优选蛋白酶是蛋白酶K。一般地，使两相混合物与蛋白酶在温度20 – 60℃、优选在约56℃温育10 – 60分钟、优选10 – 30分钟。然后，可以通过离心去除固体材料。可以分离且进一步分析具有核酸的水相。为了在使用后灭活蛋白酶，样品一般用灭活剂处理或加热。灭活蛋白酶的方法是本领域技术人员已知的。优选方法是通过将样品加热至约100℃的热灭活。当分离基因组DNA时，蛋白酶处理尤其用于改善得率。其对于一般不粘住蛋白质或细胞碎片的质粒或更短的寡核苷酸的分离一般不是必需的。

一般地，根据本发明的程序提供其中核酸以这样的纯度存在的水相，所述纯度足以直接进行PCR如实时PCR、电泳（琼脂糖或聚丙烯酰胺）或一般的克隆技术如连接或限制性酶消化。

对于尤其需要高纯度的特定应用或如果原始样品包含特异性杂质，第三个相可以在裂解和相分离后加入混合物中。第三个相可以是例如有机溶剂或聚合物相，其不能与水相和水不混溶的液相两者混溶。如果油用作水不混溶的液体，则第三个相还可以包含水不混溶的离子液体，如果水不混溶的液体包含水不混溶的离子液体，则第三个相可以例如是油。第三个相提供从水相中提取杂质的另外可能性，所述水相否则不能与核酸分离。有机杂质可以例如通过加入由有机溶剂制成的第三个相进行提取。蛋白质可以例如通过加入包含聚合物的相进行去除。

进一步改善核酸纯度的另一个可能性是调整pH，在分离水相和水不混溶的液相前建立密度梯度或盐梯度，使得副产物沉淀或移动至水相和水不混溶的液相之间的中间相。尤其如果离子液体用作水不混溶的液体，则离心还可以帮助从水相中去除沉淀的副产物，因为水相在离子液相之上。

根据本发明的方法分离的核酸可以用于定量或定性测定样品中的细胞。这可以例如通过PCR方法特别是通过实时PCR、电泳（琼脂糖或聚丙烯酰胺）或一般的克隆技术如连接或限制性酶消化来实现。

为了测定或监控分离程序的效率，样品可以用限定量的核酸掺料（spiked）。

根据本发明的方法显著促进且加速细胞裂解和核酸提取。整个程序一般不连同预温育花费10 – 20分钟，或连同预温育花费50 – 60分钟。此外，两相或甚至三相系统提供杂质的自动去除，所述杂质移动至水不混溶的液相（在使用水不混溶的离子液体的情况下，如盐），陷在水不混溶的液相和水相（如较大的蛋白质和细胞碎片）之间的中间相中，或可以通过第三个相的靶向添加（例如通过添加有机溶剂的有机杂质）或其他方法去除。

本发明进一步涉及用于执行细胞裂解的试剂盒，其包含具有水不混溶的液体的至少一个容器和具有蛋白酶的一个容器。在优选实施方案中，蛋白酶是蛋白酶K。在另一个优选实施方案中，水不混溶的液体是水不混溶的离子液体。试剂盒可以另外包含具有至少一种基于N,N-二甲基-2-羟乙基铵[DMAE]的离子液体，优选具有N,N-二甲基-2-羟乙基铵-丙酸盐的一个容器。容器是适合于贮存且包装水不混溶的液体、油或蛋白酶的任何盒、瓶或其他包装方式。合适的容器是本领域技术人员已知的。

根据本发明的方法提供非常快速和有效的裂解系统。本发明通过下述图和实施例进一步举例说明，然而，并不限于其。

图1显示其为优选离子液体的部分的离子的化学结构。

图2给出当用包含水不混溶的离子液体的裂解溶液裂解革兰氏阴性细胞时，优选执行的程序步骤的一个示例性流程图。在这种情况下，一般不需要预温育。

图3给出当用包含水不混溶的离子液体的裂解溶液裂解革兰氏阳性细胞时，优选执行的程序步骤的一个示例性流程图。在这种情况下，一般地，预温育扩大核酸的得率。

在图4中，与用于裂解鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的标准技术Macherey&Nagel NucleoSpin?试剂盒相比较，显示了关于不同温育温度和不同温育时间的结果。

上文和下文引用的所有申请、专利和公开和相应的于2011年4月27日提交的EP申请EP 11003449.3的完整公开内容通过引用并入本文。

实施例

下述实施例代表本发明的实践应用。

沙门氏菌属（Salmonella）和埃希氏杆菌属（Escherichia）：

裂解：在1-丁基-1-甲基吡咯烷鎓盐双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺（bmpyrr Ntf₂）中在120或140℃ 1分钟

李斯特菌属（Listeria）：

在80℃与N,N-二甲基乙醇铵丙酸盐（DMAE prop）预温育10分钟。

裂解：在1-丁基-1-甲基吡咯烷鎓盐双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺（bmpyrr Ntf₂）中在140℃ 1分钟

然后：使用蛋白酶K 20分钟

材料与方法：

如果没有另外说明，所有化学制品和离子液体（ILs）都由Merck KGaA（Darmstadt，德国）提供。

细菌菌株和培养条件。单核细胞增多性李斯特菌（L. monocytogenes）EGDe（1/2a，内部编号2964）用作革兰氏阳性菌的模型生物。鼠伤寒沙门氏菌（NCTC 12023）、大肠杆菌TOP10F′和大肠杆菌TOP10F′，+ppl2/IAC（Frühwirth等人，2011）用作革兰氏阴性菌的模型生物。所有菌株都使用MicroBank技术（Pro-Lab Diagnostics，Richmont Hill，加拿大）维持在-80℃。单核细胞增多性李斯特菌EGDe、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌TOP10F′，+ppl2/IAC是奥地利维也纳兽医大学兽医公共卫生与食品科学系乳品卫生学院（Institute of Milk Hygiene，Department of Veterinary Public Health and Food Science，University of Veterinary Medicine，Vienna，Austria）的细菌菌株保藏的部分。大肠杆菌TOP 10 F`由Invitrogen GmbH（Lofer，奥地利）提供。所有细菌菌株都在具有0.6%（w/v）酵母提取物的胰蛋白胨大豆液体培养液（TSB-Y；Oxoid，Hampshire，英国）中在其各自的最适生长温度37℃生长过夜。

用于细胞破坏实验的仪器。作为用于小体积（100μl）ILs的管，使用用于螺纹瓶的0.3ml玻璃小型药液筒（40 x 6mm；Fisherbrand，Fisher Scientific Austria GmbH，Vienna，奥地利），通常用于HPLC测量的设备。

对于将它们加热高于100℃，构造具有适合于小型药液筒尺度的钻孔的铝块且置于磁搅拌器（IKAMAG^? RCT；IKA-Labortechnik，Staufen i. Br.，德国）上。实际温度始终用粘在含有各自IL的参考管中的金属温度计（ama-digit ad14th，Amarell，Kreuzwertheim，德国）直接测量。

细菌和细胞破坏实验的制备。

革兰氏阴性

鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的制备。过夜培养的细菌通过在6,000 x g下离心5分钟收获，用ddH₂O洗涤三次并且重悬浮于1/20起始体积的ddH₂O中。将10μl重悬浮的培养物置于100μl bmpyrr Ntf₂，用锡箔覆盖并且测试不同温育时间和温度。在温育后，通过将2 x 250μl ddH₂O加入IL中，并且用吸管混合数秒，将“悬浮液”转移到2ml管（Eppendorf，Hamburg，德国）内。将悬浮液短暂涡旋并且上层相直接用于实时PCR测量。

革兰氏阳性

单核细胞增多性李斯特菌的制备。过夜培养的细菌通过在6,000 x g下离心5分钟收获，用ddH₂O洗涤三次并且重悬浮于1/20体积的起始体积的20% DMAE丙酸盐溶液中（时间和温度参见表1）。将10μl重悬浮的培养物置于100μl bmpyrr Ntf₂，并且测试不同温育时间和温度。在温育后，通过将2 x 250μl ddH₂O加入IL中，并且用吸管混合数秒，将“悬浮液”转移到2ml管（Eppendorf，Hamburg，德国）内。将悬浮液短暂涡旋并且上层相直接用于实时PCR。

用于细胞破坏方法的对照样品。细胞破坏方法中使用的十微升相同细菌悬浮液用于DNA分离，使用NucleoSpin^?组织试剂盒和用于革兰氏阳性菌的支持方案。使用预裂解缓冲液（包括溶菌酶）的步骤执行一小时，并且蛋白酶K步骤执行过夜。修改该方案的最后一个步骤。代替使用100μl预温（70℃）洗脱缓冲液BE的一次洗涤，使用50μl预温ddH₂O的两次洗涤用于从柱中洗脱DNA（Mayrl等人，2009）。最后加入400μl ddH₂O以达到与细胞破坏实验中相同的体积。

关于实时PCR定量的DNA标准。每个细菌物种的一毫升纯过夜培养物用于DNA分离，使用NucleoSpin^?组织试剂盒和用于革兰氏阳性菌的支持方案。使用预裂解缓冲液（包括溶菌酶）的步骤执行一小时，并且蛋白酶K步骤执行过夜。修改方案用于最后一个步骤。代替使用100μl预温（70℃）洗脱缓冲液BE的一次洗涤，使用50μl预温ddH₂O的两次洗涤用于从柱中洗脱DNA（Mayrl等人，2009）。通过使用Hoefer DyNA Quant 200仪器（Pharmacia Biotech，San Francisco，CA，USA）的荧光测量执行DNA浓度的测定。

实时PCR。根据先前公开分析鼠伤寒沙门氏菌（Mester等人，2010；Roeder等人，2010）。通过靶向单核细胞增多性李斯特菌的prfA基因的274bp片段，如先前公开的执行关于单核细胞增多性李斯特菌的实时PCR方案（D'Agostino等人，2004；Rossmanith，等人2006）。根据使用pLuc-LM5探针用于单核细胞增多性李斯特菌的方案（Frühwirth等人2011），通过实时PCR分析含有内部扩增对照的质粒ppl2/IAC。通过Kaclikova 等人（2005）的方案分析大肠杆菌。

在图4中，呈现关于鼠伤寒沙门氏菌的不同温育温度和温育时间的裂解方案结果。

表1给出用于从不同细菌菌株中提取基因组DNA的几种反应条件的概括。

表2给出用于从大肠杆菌中提取质粒DNA的反应条件概括。

在两个表中，给出与NucleoSpin?组织试剂盒比较的平均得率（平均得率）。

表1

细菌菌株 预温育液体 温育液体 温育温度/时间 温育后 平均得率 [%]

鼠伤寒沙门氏菌（NCTC 12023）   bmpyrr Ntf ₂ 80℃/1分钟   88

    bmpyrr Ntf ₂** 120℃/1分钟   117

    bmpyrr Ntf ₂ 150℃/1分钟   109

    bmpyrr Ntf ₂ 180℃/1分钟   94

    菜籽油 120℃/1分钟   92

大肠杆菌TOP10F′   bmpyrr Ntf ₂ 120℃/1分钟   94

    bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟   131

    bmpyrr Ntf ₂ 160℃/1分钟   119

  1,2M DMAE prop，10分钟，80℃ bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟   138

单核细胞增多性李斯特菌（1/2a，内部编号2964）   bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟   2

  1,2M DMAE prop，10分钟，80℃ bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟   89

  1,2M DMAE prop，10分钟，80℃ bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟 蛋白酶K，20分钟，56℃ 98

  1,2M铵，10分钟，80℃ bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟 蛋白酶K，20分钟，56℃ 57

  1,2M DMAE 2-盐，10分钟，80℃ bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟   9

  1,2M DMAE 2-盐，10分钟，80℃ bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟 蛋白酶K，20分钟，56℃ 64

  1,2M DMAE 三氟乙酸盐，10分钟，80℃ bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟   10

  1,2M DMAE三氟乙酸盐，10分钟，80℃ bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟 蛋白酶K，20分钟，56℃ 30

表2

细菌菌株 预温育液体 温育液体 温育温度/时间 温育后 平均得率 [%]

大肠杆菌Top10F′，+ppl2/IAC   bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟   66

    bmpyrr Ntf ₂ 140℃/1分钟 蛋白酶K，20分钟，56℃ 44

RNA分离

试剂

对于空肠弯曲杆菌DSMZ 4866的维持和生长，购买脑心浸剂液体培养液、甘油、胰蛋白酶大豆琼脂、酵母提取物（Merck，Darmstadt，德国）、哥伦比亚琼脂和裂解马血（Oxoid，Basingstoke，UK）。用NucleoSpin^?组织试剂盒（Macherey-Nagel，Düren，德国）执行DNA分离，并且用High Pure RNA分离试剂盒（Roche，Mannheim，德国）执行RNA分离。用于实时RT-PCR的试剂（SuperScript? III逆转录酶、RNase? OUT、SYTO9、PlatinumTaq^? DNA聚合酶）得自Invitrogen（Lofer，奥地利），并且引物和探针得自MWG Biotech（Ebersberg，德国）。

空肠弯曲杆菌（DSMZ 4688）的培养

将100μl菌株空肠弯曲杆菌DSMZ 4688的永久冷冻物（20% v/v甘油、20% v/v裂解马血和60% v/v脑心浸剂液体培养液，维持在-80℃）接种到9ml脑心浸剂（膜过滤的）中，并且在微好氧条件（3% O₂、10% CO₂、87% N₂）下在42℃生长48小时。为了证明培养物的纯度，另外划线培养分别补充有酵母提取物（0.6% w/v）的哥伦比亚琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂的两块板，并且为了证明脑心浸剂液体培养液的纯度，在每种情况下，将100μl铺平板到相同类型的板上。

通过使用bmpyrr Ntf₂来自空肠弯曲杆菌DSMZ 4688的RNA分离

在每种情况下，1ml 48小时培养物通过在6,000 x g下离心5分钟收获，并且重悬浮于20μl DEPC处理的H₂O，并且将全部量置于100μl bmpyrr Ntf₂内，用锡箔覆盖并且在120℃或140℃温育一分钟。在温育后，将100μl DEPC处理的H₂O或90μl DNA酶温育缓冲液和10μl DNA酶I（根据High Pure RNA分离试剂盒的方案）加入样品中，并且将整个悬浮液转移到1.5ml管（Eppendorf，Hamburg，德国）内。另外，将悬浮液涡旋数秒，并且将含有DNA酶的样品首先在振荡下在室温温育60分钟，并且然后在75℃停止DNA酶活性15分钟。同时，用冰冷却用DEPC处理的H₂O处理的样品。在最后涡旋后将样品的上层相转移到新管内，并且贮存于-80℃。

通过High Pure RNA分离试剂盒来自空肠弯曲杆菌的RNA分离

对于每一种样品，1ml 48小时培养物通过在6,000 x g下离心5分钟收获，并且根据High Pure RNA分离试剂盒的方案处理。对于DNA酶I影响的估计，这个步骤在两个样品中省略。

经由NucleoSpin^?组织试剂盒来自空肠弯曲杆菌的DNA提取的DNA分离和参考

一毫升48小时培养物通过在6,000 x g下离心5分钟收获，这种样品用作参考以也获得DNA含量用于与离子液体方法比较。另外，从哥伦比亚琼脂板获得样品用于产生DNA标准。DNA分离根据NucleoSpin^?组织试剂盒用于革兰氏阳性菌的方案（1小时溶菌酶、蛋白酶K过夜）执行。修改该方案的最后一个步骤。代替使用100μl预温（70℃）洗脱缓冲液BE的一次洗涤，使用50μl预温ddH₂O的两次洗涤用于从柱中洗脱DNA（Mayrl等人，2009）。关于标准的DNA浓度通过使用Hoefer DyNA Quant 200仪器（Pharmacia Biotech，San Francisco，CA）荧光获得。

用于定量的核酸处理

cDNA合成和实时RT-PCR分析根据Dzieciol等人（2011）的方案执行。

表3

本发明与参考方法（商业试剂盒，RNA分离试剂盒）用于从空肠弯曲杆菌中分离RNA的性能比较显示于表3中。具有用于基因组DNA残渣消化和去除的另外DNA酶步骤的本发明方案的回收减少起因于DNA酶方案的持续时间而不是清晰显示的低RNA含量。这显示于呈现证明低DNA含量的数据的表5中。因此，如该表中呈现的本方案的RNA回收是显著的。

表3

^a 高纯 RNA分离试剂盒（Roche，Mannheim，德国）。

表4

在表3中所示的实验过程中的基因组DNA回收在表4中可见。

表4

^a NucleoSpin?组织试剂盒（Macherey-Nagel，Düren. 德国），用于革兰氏阳性菌的方案（1小时溶菌酶、蛋白酶K过夜）。

表5

表3中所示的实验的RT（-）值。RT（-）值证实在该方案后样品中的DNA比例。例如，2个对数尺度的间隔意指样品中1%的DNA含量。

表5