肿瘤的方法

发明领域

本发明涉及肿瘤的方法。更具体而言，本发明涉及结合使用 放射免疫疗法和整联蛋白受体拮抗剂肿瘤。

发明背景

人们期望获得新的且协同性的性组合来转移性乳腺癌， 前列腺癌，何杰金氏淋巴瘤及其他癌症，因为其中许多癌症目前用标 准多模态疗法还无法治愈。乳腺癌中p53突变的高发生率以及bcl-2蛋 白质的超表达加大了对化疗和放疗的阻力。系统地，靶向肿瘤的放射 免疫疗法(RIT)有可能特异性地靶向组织并将癌特异性的细胞毒素抗 体送递给遍布的病灶。但是，对人乳腺癌异种移植模型的研究表明： RIT，作为单一物质一般不能治愈肿瘤。放射性标记的抗体可能不均匀 地渗入肿瘤，并且该渗入可能不足以治愈肿瘤的所有部位。目前应用 RIT与其它模态的组合，但是辅助的化疗或外部放疗会提高骨髓 毒性的风险，这是RIT的主要限量因素。

有人建议将抗血管生成剂用于肿瘤。这些物质靶向遗传上正 常的内皮细胞，这些内皮细胞在肿瘤血管生成过程中增殖的速度要远 高于正常组织中极低的内皮更新率。已经表明抗血管生成剂连同其它 化疗剂当与外部放疗结合使用时可以增强效能。通过RGD氨基酸 序列与几种配体结合地αVβ3整联蛋白受体可在正常的脉管系统中表 达，但是在生长中的肿瘤脉管系统中高度表达，使得它成为一个潜在 的抗血管生成剂靶位。αVβ3整联蛋白的高表达及活化作用还与更多的 转移性及侵入性乳腺肿瘤有关。已经表明单克隆抗体(MAb)和环状 RGD五肽对αVβ3活性的抑制作用可诱导内皮的细胞凋亡，抑制血管生 成，以及增强内皮单层的透性。已有人将αVβ3活性的抑制作用与在乳 腺癌异种移植和黑素瘤异种移植中肿瘤生长的降低联系起来。环状 RGD五肽与抗体IL-2融合蛋白质的协同作用提高了对黑素瘤，结肠癌 和成神经细胞瘤鼠模型的效能。已经利用放射性标记的环状RGD 五肽说明了选择性肿瘤吸收过程。

发明概述

本发明提供了肿瘤患者的方法，例如前列腺肿瘤，乳腺肿瘤， 淋巴瘤等等。该方法是结合模态的放射免疫疗法(CMRIT)，方 案涉及给患者施用抗血管生成的含环-(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的 五肽(cRGD五肽)和放射免疫剂(RIT)。该方法包括一个连续 的方案，包括第一步给患者施用至少一剂的cRGD五肽。在初始 cRGD五肽后，给患者施用抗肿瘤有效量的RIT。RIT后，给 患者施用至少一个附加剂量的cRGD五肽。

优选每剂cRGD五肽的量和时间选择在该患者可容忍剂量的最大 值上或其附近，即，在该最大水平上cRGD五肽对患者的毒性是 学可接受的。

在相同剂量水平下，本发明的CMRIT方法能够比单独RIT或单 独的cRGD五肽获得明显更高的抗肿瘤效能。在相同剂量水平下， CMRIT方法还能比单独RIT或单独cRGD五肽获得更强的肿瘤细 胞和肿瘤内皮细胞的细胞凋亡。

本发明一方面还提供试剂盒，其包括含有至少一个单位剂量RIT 的第一容器，和一个或多个附加容器，该附加容器中包含总共至少两 个单位剂量的cRGD五肽。每种容器含有一个标签描述该容器的内容 物，也可以任选地描述施用的排序，以及任何涉及药物和放射性物质 的有关政府规定所要求的其它相关信息。该试剂盒还可以包括根据本 文描述的方法施用容器内容物肿瘤的印制的说明书。

附图简述

在附图中，图1柱形图说明相对于用单独的RIT和单独cRGD五 肽而言，在用本发明CMRIT方法的小鼠中肿瘤治愈率增大， PR表示部分恢复，CR表示完全恢复；

图2是与单独RIT和单独cRGD五肽的相比较，在用本发明 CMRIT小鼠中的毒性数据的图示；

图3为肿瘤细胞的显微照相图，其说明来自用本发明CMRIT方法 小鼠的肿瘤中细胞凋亡增多；

图4数据图表明在来自用本发明CMRIT方法小鼠的肿瘤中 (A)总细胞和(B)内皮细胞(EC)的细胞凋亡，其通过TUNEL方 法测定；

图5是肿瘤细胞的显微照相图，其表明相对于用单独RIT和单独 cRGD五肽小鼠，在来自用本发明CMRIT方法小鼠的肿瘤中 细胞增殖有所降低，以及

图6是HBT 3477乳腺肿瘤细胞的显微照相图，其说明在该细胞上 表达β3和CD31。

优选实施方案的详细说明

本发明可以有多种不同形式的实施方案。在附图中显示了特定实 施方案并在说明书和权利要求中详细描述。本公开内容是本发明原理 的一个范例，本发明并不限于本文所述的特定实施方案。

用于患者肿瘤的结合模态放射免疫疗法(CMRIT)方法包括 以下连续步骤：(a)给患者施用至少一剂的抗血管生成的含环-(精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸)的五肽(cRGD五肽)；(b)给患者施用抗肿 瘤有效量的放射免疫剂(RIT)；以及(c)给患者施用至少一个 附加剂量的cRGD五肽。

优选各剂cRGD五肽的量和时间选择在该患者可容忍剂量的最大 值上或其附近，即，在该最大水平上cRGD五肽对患者的毒性是 学可接受的。可容忍剂量的最大值可以通过药物领域众所周知的方法 容易地测定。例如，cRGD五肽的毒性可以获自临床研究。每剂的量优 选在约0.05mg到约500mg的范围内，更优选约0.1到约100mg，最 优选约0.2到约20mg。每日的合计剂量优选在约0.001到约2mg/kg 体重的范围内，更优选约0.002到约1mg/kg，最优选约0.002到约0.2 mg/kg。但是针对各指定患者的特定剂量依赖于多种因素，例如所用特 定cRGD五肽化合物的活性，年龄，体重，健康的综合状态，性别， 膳食，施用的时间和途径(rout)，以及排泄的速度，药物的结合，和 所针对的特定疾病的严重度。优选肠胃外施用，最优选腹膜内 (i.p.)施用，但也可口服，栓剂或局部施用。如果需要，施用RIT后 附加cRGD五肽的施用可以持续最多几个月。

可以用药学可接受的赋形剂和载体配制cRGD五肽，例如缓冲液 等等，这些是本领域众所周知的。适当的赋形剂物质为有机或无机物 质，其适于肠的(如口或直肠)，肠胃外(如静脉内注射)或局部(如 局部，真皮，眼或鼻)施用，或适于以吸入喷雾的形式施用并且其不 与新的化合物反应，例如水或含水等渗盐溶液，低级醇，植物油，苯 甲醇，聚乙二醇，甘油三乙酸酯及其他脂肪酸甘油酯，明胶，大豆卵 磷脂，碳水化合物例如乳糖或淀粉，硬脂酸镁，滑石，纤维素和凡士 林。

普通片剂，糖衣片剂，胶囊，糖浆，汁或滴剂是对口服特别有用 的；特别是糖衣片剂和具有肠溶衣的胶囊或胶囊壳体。栓剂用于直肠 施用，溶液用于肠胃外施用，优选油或水溶液，以及悬浮液，乳剂或 植入物。

适用于局部施用形式的实例为溶液，其可用于滴眼剂形式，以及 例如悬浮液，乳剂，乳膏，软膏或敷布。如以吸入喷雾的形式施用则 可以使用含有该有效成分的喷雾剂，其中所述有效成分溶解或悬浮在 气态推进剂或气态推进剂混合物(如二氧化碳或者氟氯烃取代物)中。 在该情况下，所述有效成分可方便地以微粒化的形式使用，同时可能 存在一种或多种辅助的生理学配伍溶剂，例如乙醇。吸入溶液可以借 助于通常的吸入器施用。cRGD五肽还可以是冻干的，并且所获冻干物 可用于生产例如注射制剂。所述注射剂可以以快速注射或以连续输注 的形式(例如静脉内，肌内，皮下或鞘内)施用。所述制剂可被灭菌 和/或包含助剂，例如防腐剂，稳定剂和/或润湿剂，乳化剂，用于影响 渗透压的盐，缓冲物质，着剂和/或调味剂。如果需要，所述cRGD 五肽还可以含有一种或多种其他的活性成分，包括例如一种或多种维 生素等等。

可以直接使用cRGD五肽本身或其一种或多种生理学可接受的 盐。所述cRGD五肽能够转化成一种内盐或利用酸转化成一种相关的 酸加成盐。特别适用于用于该反应的酸是那些能产生生理学可接受盐 的酸。因此可使用无机酸，如硫酸，硝酸，氢卤酸，比如盐酸或氢溴 酸，磷酸，比如正磷酸，氨基磺酸，以及有机酸，特别是脂肪族，脂 环族，araliphatic，芳香族或杂环的一元或多元羧酸，磺酸或硫酸，例 如蚁酸，乙酸，丙酸，特戊酸，二乙基乙酸，丙二酸，丁二酸，庚二 酸，延胡索酸，马来酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，安息香酸，水杨酸， 2或3苯基丙酸，柠檬酸，葡糖酸，抗坏血酸，烟酸，异烟酸，甲磺酸 或乙磺酸，乙二磺酸，2-羟基乙磺酸，苯磺酸，对甲苯磺酸，萘-单或 二磺酸，月桂基硫酸。

或者，cRGD五肽的酸形式通过与碱反应能够转化成一种其生理学 可接受的金属或铵盐。这里特别适用钠，钾，镁，钙和铵盐，以及取 代的铵盐，例如二甲基-，二乙基-或二异丙基铵盐，单乙醇-，二乙醇- 或三乙醇铵盐，环己基铵盐，二环己基铵盐，二苄基乙二铵盐，以及 带有N-甲基-D-葡糖胺或精氨酸或赖氨酸的盐。

优选所述cRGD五肽是环-(Arg-Gly-Asp-D-PheVal) (EMD66203)，环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)(EMD121974， Cilengitide，获自MerckKGaA，Darmstadt，德国)，或环-(Arg-Gly Asp-D-Phe-l-氨基环己烷羧酸)(EMD270179)，这些肽的制备在Jonczyk 等的美国专利5,866,540和6,001,961中描述，有关的公开内容引 入本文作为参考。最优选cRGD五肽是环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N- Me]-Val)。

优选第一剂cRGD五肽对患者的首次施用不迟于RIT施用前约1 小时。优选在RIT施用后约两天之内施用至少一个附加剂量的cRGD 五肽。在一个优选实施方案中，对患者进行RIT施用后施用了至少约 两剂额外的cRGD五肽，更优选至少约三剂额外的cRGD五肽，最优 选至少约4剂额外剂量。在一个特别优选实施方案中，RIT施用后连 续地施用至少约五剂额外的cRGD五肽。优选各剂额外的cRGD五肽 以各剂之间不超过两天的间隔施用。如果需要，可以以每周约2剂的 速率在几个月的期限内持续RIT的额外剂量施用。

优选RIT剂量基于特定RIT试剂的放射性水平。当使用90Y作为 辐射源时，使用的RIT量优选提供每剂约20mCi到约200mCi的放射 性剂量。但是针对各指定患者的特定剂量依赖于多种因素，例如所用 特定RIT化合物的放射性，所用的特定放射性核素，年龄，体重，健 康的综合状态，性别，膳食，施用的时间和途径，以及排泄的速度， 药物的结合，和所针对的特定肿瘤的大小和严重度。例如， 转移性的前列腺癌或乳腺癌时，与螯合的90Y结合的抗-MUC-1 (M170)单克隆抗体一般根据肿瘤的大小及其他上述因素，以约5 mCi/mg抗体的比活性递送约20mCi到约200mCi范围内的总剂量。 优选RIT肠胃外施用，更优选静脉内(i.v.)施用。

用于肿瘤的放射免疫剂是本领域公知的。适当的RIT物 质包括附着有任何学有益的放射性核素，并且可附着到肿瘤或肿 瘤脉管系统或可被肿瘤或肿瘤脉管系统捕获的任何靶向放射性核素治 疗物。这种有益的RIT物质包括一个肿瘤靶向或肿瘤脉管系统靶向配 体或分子。放射性核素能够直接附着到目标分子或配体，或通过螯合 剂附着于或相连于该配体。或者，该配体包括一个螯合或放射性核素 捕获基团，并能够施用给不带放射性的(cold)患者，使其结合到患者 的肿瘤或肿瘤脉管系统。放射性核素随后施用后，被结合的配体能够 在肿瘤位点捕获该放射性核素(前-靶向放射性核素疗法)。靶向分子 或配体包括抗体，抗体片段，抗体片段的重组结合，肽，或具有肿瘤 或肿瘤脉管系统选择性亲和力的任何其它配体。

优选RIT是一个放射性核素标记的螯合剂-配体复合体，其中螯合 剂是以化学键结合到肿瘤-靶向分子上的。优选的肿瘤-靶向分子包括抗 体，例如单克隆抗体，或抗体片段。更优选该肿瘤靶向分子是一个抗 肿瘤抗体。可以使用任何抗肿瘤抗体。优选该抗肿瘤抗体靶向肿瘤脉 管系统。或者，该抗体能够靶向肿瘤抗原，例如p185HER2，牛奶粘蛋 白核心蛋白质，TAG-72，Lewis a，癌胚抗原(CEA)，由9.2.27抗体 识别的高Mr黑素瘤抗原，或由OV-TL3或MOV18识别的卵巢相关抗 原。优选抗肿瘤抗体是抗-MUC-1单克隆抗体，例如M170 mAb(可以 从Biomira Inc.，Edmonton，加拿大获得)，嵌合的L6抗肿瘤单克隆 抗体(ChL6MAb)等等。

任何适用于癌症放射疗法的放射性核素均可用于本发明的 CMRIT方法。适当的放射性核素包括，但不限于，131I，177Lu，67Cu， 64Cu，196Re和90Y。优选该放射性核素是90Y。

适当的RIT物质和其制备在Meares等的美国专利5,958,374中 描述，有关的公开内容在此引入本文作为参考。

优选该螯合剂是一个多氮杂大环基团或多氧杂大环 (polyoxamacrocyclic)基团。更优选该螯合基团选自：1，4，7，10- 四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸；1，4，7，10-四氮杂环十 三烷-N，N′，N″，N-四乙酸；1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′， N″，N-四乙酸；或1，5，9，13-四氮杂环十六烷-N，N′，N″，N- 四乙酸。

更优选该放射性核素标记的螯合剂-配体复合体是以化学键与 ChL6 mAb或M170 mAb结合的。最优选该RIT是90Y-1，4，7，10- 四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸-肽-ChL6(在下文中称为 90Y-DOTA-肽-ChL6)，或其抗-MUC1-1 mAb类似物。

优选该放射性核素是90Y。111I可被纳入RIT中以对肿瘤进行造 影。更优选该放射性核素标记的螯合剂-配体复合体是以化学键与ChL6 MAb或M170 mAb结合的。

在一个优选实施方案中该螯合剂是N-取代的1，4，7，10-四氮杂 环十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸；其中N-取代基是-CH2C(＝O)- (Gly)3-L-(对异硫氰酸根合)-Phe-酰胺(在下文中称为DOTA-肽)， 该放射性核素是90Y。

与cRGD五肽的制剂相比，RIT能够与如上所述适用于液体可注 射制剂的各种药学可接受的赋形剂一起配制。

本发明的CMRIT方法能够用于各种癌症。例如，本发明的 CMRIT方法能够用于明显的实体瘤，如乳腺癌，结肠癌，肺癌， 甲状腺癌，卵巢癌症等等。CMRIT方法还可以用于非实体瘤癌 症，如非何杰金氏淋巴瘤等等。本发明的CMRIT方法优选用于乳 腺癌。

在相同剂量水平下，本发明的CMRIT方法获得的抗肿瘤效能显著 高于单独RIT和单独cRGD五肽的合计总抗肿瘤效能(即，观察 到了协同效应)。在相同剂量水平下，CMRIT方法还能比单独用RIT 或单独cRGD五肽获得更强的肿瘤细胞和肿瘤内皮细胞的细胞凋 亡。

本发明另一方面提供一种试剂盒，其包括含有至少一个单位剂量 RIT的第一容器，和一个或多个附加容器，该附加容器中包含总共至 少两个单位剂量的cRGD五肽。每种容器含有一个标签描述该容器的 内容物，也可以任选地描述施用的排序，以及任何涉及药物和放射性 物质的有关政府规定所要求的其它相关信息。该试剂盒还可以包括根 据本文描述的方法施用容器内容物肿瘤的印制的说明书。

容器可以是小瓶，安瓿，瓶子等等。各容器优选包括一个单位剂 量，不过还可以使用多个剂量的容器。说明书材料还优选包括安全和 效能信息。

提供了以下非限制性实施例以进一步说明本发明。

试剂。购买溶于0.05M HC1中作为氯化物盐的无载体钇-90(90Y) (Pacific Northwest National Laboratory，Richland WA or New England Nuclear，Boston，MA)。将嵌合的L6(ChL6) ——一种人- 小鼠抗体嵌合体(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute，Seattle，WA)——与在人乳腺癌，结肠癌，卵巢癌和肺癌 上高度表达的整合膜糖蛋白反应。环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]- Val)(EMD121974)是αVβ3和αVβ5整联蛋白的选择性拮抗剂，其对 分离的αVβ3整联蛋白的IC50值在纳摩尔极低范围内，而对表达αVβ3的 M21黑素瘤细胞的IC50值则在微摩尔的范围内。肽合成和表征按照 Dechantsreiter等(J.Med.Chem.42：3033-40(1999))先前的描述进 行，其有关的公开内容在此引入本文作为参考。

细胞系。一种人乳腺腺癌细胞系HBT 3477，获自Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute(SeattleWA)。HBT 3477 细胞的70％以上被L6强烈地染。在HBT 3477细胞中，表达bcl-2 而p53是突变的，在外显子10中带有一个无义突变，在p53蛋白质区 域中产生缺失，该蛋白质在四聚化(tetramerization)和双链DNA断 裂的检测中起作用。HBT 3477细胞表达功能性的αVβ5整联蛋白，而不 是αVβ3整联蛋白，因为附着到玻连蛋白的过程被αVβ5特异性P1F6抗体 阻断，而并非由αVβ3特异性LM609抗体阻断。环-(Arg-Gly-Asp-D— Phe-[N-Me]-Val)阻断了HBT 3477细胞附着到玻连蛋白的过程，其IC50 约5μM。

90Y-DOTA-肽-ChL6。如DeNardo等(J.Nucl.Med.，36：829-836) 所述，将ChL6缀合到1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N- 四乙酸(DOTA)上并用90Y放射性标记，用大于或等于80％的效能制 备90Y-DOTA-肽-ChL6。通过分子筛高效液相层析(HPLC)，醋酸纤 维素电泳(CAE)以及HBT 3477细胞结合放射免疫反应性测定(RIA) 检查90Y-DOTA-肽-ChL6的结构和功能完整性。HPLC和CAE显示 90％以上的90Y-DOTA-肽-ChL6是单体形式，而高分子量形式低于 4％，如CAE所测。与活细胞结合的免疫反应性显示大于92％反应性； 以200，230或260μCi一剂的90Y-DOTA-肽-ChL6施用。

小鼠。根据University of California动物护理指南饲养雌性无胸腺 Balb/cnu/na小鼠(7-10星期龄；Harlan Sprague Dawley，Inc.， Frederick，MD)。将对数期收集的HBT 3477细胞(3.0×106)皮下注 射到腹部的一侧用于研究(标记的区域除外)以及注射到两侧用 于研究免疫病理学。尾部静脉注射RIT，并通过腹膜内注射(i.p.)递 送环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)。指定RIT注射的时间为“第 0天”，或者对于只有cRGD五肽的组则指定首次cRGD五肽注射的时 间为“第0天”。在指明的时间脱颈法处死小鼠，用于免疫病理学研 究，当肿瘤负荷高于允许的极限时，或在84天时处死小鼠用于研 究。

对照(无RIT)组。各组分别为：由未接受小鼠组成(24 只小鼠，14只小鼠每只具有2个肿瘤而10只小鼠每只具有1个肿瘤)； 由接受未标记ChL6抗体的小鼠(315μg)组成(8只小鼠每只具有2 个肿瘤)；以及由接受环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)的小鼠 组成，在0，2，4，6，8和10天施用6剂250μg(18只小鼠，其中每 只具有1个肿瘤)。

高剂量RIT组。各组分别为：由接受RIT单一物质的小鼠组 成(260μCi 90Y-DOTA-肽-ChL6，(39只小鼠，15只小鼠每只具有2 个肿瘤而24只小鼠每只具有1个肿瘤))；以及由接受RIT(260μCi 90Y-DOTA-肽-ChL6)和6剂250μg环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]- Val)结合的小鼠组成，从第0天开始，在施用RIT之前1小时开 始施用第一剂环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)，然后在2，4，6， 8和10天施用其余的5剂(42只小鼠，其中每只均具有1个肿瘤)。

低剂量RIT组。各组为：由接受RIT单一物质的小鼠组成 (200-230μCi 90Y-DOTA-肽-ChL6，(28只小鼠，其中9只小鼠每只 具有2个肿瘤，而在以前的研究中这9只小鼠每只接受了230μCi 90Y-DOTA-肽-ChL6，而另外19只小鼠每只具有1个肿瘤，其曾接受 了200μCi 90Y-DOTA-肽-ChL6))；以及由接受RIT(200μCi 90Y-DOTA- 肽-ChL6)和6剂(每剂250μg)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val) 结合的小鼠组成。从第0天开始，在施用RIT之前1小时开始施 用第一剂环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)，然后在2，4，6，8 和10天施用其余的5剂(30只小鼠，其中每只均具有1个肿瘤)。

杀肿瘤效果。用测径器每周三次测量肿瘤的3个正交直径。使用 半椭圆体公式计算肿瘤体积(DeNardo等Clin.Cancer Res.，3：71-79 (1997))。初始肿瘤体积定义为之前当天体积。完全恢复的肿 瘤被认为零体积。按下述分类肿瘤应答：治愈(C)，到研究结束时(84 天)肿瘤消失并没有再生；完全恢复(CR)，肿瘤消失至少7天，但 随后又再生；部分恢复(PR)，肿瘤体积减少50％或更多，至少维持 7天，但随后再生；无应答(NR)，肿瘤体积减少不到50％。对于具有 两种肿瘤而这两种肿瘤的应答不相同的小鼠，则根据这两个肿瘤的应答 描述肿瘤应答。从肿瘤应答结果中排除不到30天就死于毒性的小鼠。

毒性。注射后12星期或直至死亡，每周2-3次测量体重和血细胞 计数。使用2μL微细管吸量管从尾部静脉收集血样。收集来自一个剂 量组内小鼠的样品，以磷酸缓冲盐水(PBS，0.9％盐水/10 mM磷酸钠， pH 7.6)1∶200稀释以进行红细胞(RBC)计数；以1％(w/v)草酸铵 1∶100稀释以进行血小板计数；或以3％(w/v)乙酸按1∶20稀释以进 行白细胞(WBC)计数。

细胞免疫病理学组。除非另作说明，各组均由2只小鼠组成，每 只具有2个肿瘤，在各时间点分析总共4个肿瘤。各组为：由未接受 小鼠组成(4只小鼠，7个肿瘤)；由接受250μg环-(Arg-Gly- Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)小鼠组成，以一剂施用，然后在肽注射2小时， 6小时和1-5天处死；由接受单独RIT施用(260μCi90Y-DOTA- peptide-ChL6)的小鼠组成，随后在2小时，6小时和1-6天处死(3 只小鼠，第5天5个肿瘤)；由接受RIT(260μCi90Y-DOTA-肽-ChL6) 和环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)(250μg)联合施用的小鼠组 成(CMRIT方法)，环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)在RIT前 1小时施用，在10天内每隔一天重复，在RIT后2小时，6小时和1- 6天处死。取出肿瘤，切成两半，冰冻在最佳切削温度(O.C.T)培养 基中，贮藏在大约-70℃直至切片(10μm切片)。通过末端脱氧核苷 酸转移酶-介导的dUTP切口末端标记(TUNEL，Cavrieli等，J.Cell Bio.，119：493-501(1992))分析评价所有时间点的细胞凋亡，评价选 定时间点(未的，1，5和6天)的增殖速度(Ki67)和微血管密 度(CD31)的差异。

总的和内皮的细胞凋亡TUNEL分析。将肿瘤在Fisher superplus 载玻片(Fisher，Pittsburgh，PA)上切割成10μm切片，风干1小时， 冰冻在大约-70℃，直至按照该厂家的说明书，在1％多聚甲醛中固定 约10分钟后，用Apop Tag Red试剂盒(罗丹明作为标记，Intergen Purchase，NY)进行TUNEL分析。TUNEL后，清洗载玻片并以1∶100 稀释倍数与抗CD31的大鼠抗小鼠MAb(Pharmingen，San Diego，CA) 在4℃温育过夜，以鉴定内皮细胞。清洗载玻片并和与FITC相连的抗 大鼠抗体(1∶50稀释倍数)(Pharmingen)温育1小时。清洗载玻片， 在4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，0.2μg/ml)中短暂浸泡用于背景 核染，再一次清洗并封固(mounted)，然后4℃储备在暗处直至定 量。

总的和内皮的细胞凋亡定量。在各切片的无坏死区域，用装备有 Chroma Pinkle Filter Set(Chroma，Brattleboro，VT)的Olympus显 微镜定量6个随机选择的X600视野(150,000μm2/视野)，该显微镜 带有UV，FITC和罗丹明激发滤波器，及二/三重带通滤波器，可以允 许多波长的同步观察。使用DAPI标记，选择视野以覆盖整个观察面 积，其通常包括约300-350个细胞。通过各肿瘤的每个视野阳性核的平 均数测定总的细胞凋亡，而用二重带通滤波器使用相同视野计数由 FITC(CD31)及罗丹明(TUNEL)标记的细胞，测定内皮的细胞凋 亡。各视野选自肿瘤切片的明显无坏死区，因为HBT 3477异种移植一 般在裸鼠中快速生长，在6天内体积加倍，导致未肿瘤的主要坏 死。因为TUNEL可以标记坏死的细胞，尽管强度较小，但在完全随机 过程中仍选择该策略。

增殖及微血管密度分析。将来自未以及用cRGD五肽，RIT 及CMRIT方法并在后1，5和6天处死的小鼠的肿瘤10μm 切片在冰冷丙酮中固定10分钟，在PBS中清洗，并在带有0.6％H2O2 的甲醇中短暂温育(5分钟)。在PBS中清洗后，用在PBS中的10％ 山羊血清和1％牛血清清蛋白阻断切片10分钟。将小鼠抗Ki67 MAb (Pharmingen，B56克隆)应用于阻断溶液中(6.25μg/ml)，在室温 下温育载玻片2小时，然后在PBS中清洗。应用山羊抗小鼠罗丹明标 记的或山羊抗小鼠Cy-3标记的抗体(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc，West Grove，PA，1∶100)，在室温下温育载玻片 1小时。在PBS中清洗后，与大鼠抗小鼠CD31抗体(Pharmingen， 1∶100)在室温下温育切片1小时，然后在PBS中清洗，随后与山羊抗 大鼠FITC-标记的抗体(Pharmingen，1∶50)温育1小时。在PBS中 清洗后，用DAPI(0.4μg/ml)复染载玻片并封固在盖玻片下的Biomeda 凝胶装置中(Fisher)。使用Olympus显微镜以X1000放大倍数进行 Ki67的定量，以评定增殖。计数各个肿瘤随机选择的被DAPI染的6 个视野，测定在一个肿瘤中Ki67-阳性细胞的平均总数/视野。以X400 放大倍数计数各随机视野的CD31-染的血管数目，测定微血管密度。 任何CD31阳性的内皮细胞或细胞簇(其从一个相邻的簇中被分离出 来)都算作是一种微血管。使用各肿瘤切片的6个随机选择视野确定 各肿瘤的平均数。求取来自4肿瘤/组的值的平均值，测定组的微 血管密度平均数。

裸鼠中HBT 3477的β3和CD31的表达。肿瘤被切成两半，冷冻在 O.C.T培养基中(Tissue Tek，Miles，Inc.，Elkhart，IN)及贮藏在大 约-70℃，直至切片。切片(10μm)被风干并冷冻在大约-70℃直至染 。然后在冰冷丙酮中固定切片10分钟，在PBS中清洗并用在PBS 中的10％山羊血清阻断30分钟。以10μg/ml应用仓鼠抗小鼠CD61 (β3)MAb(Pharmingen)并在室温下温育载玻片3小时。在PBS中 清洗后，应用抗-仓鼠罗丹明-连接的抗体(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.)(1∶50)，然后在室温下温育1小时。在PBS中 清洗后，应用大鼠抗小鼠CD31抗体(1∶100，Pharmingen)并在室温 下温育载玻片1小时。PBS清洗后，应用抗-大鼠FITC-连接的抗体 (1∶50，Pharmingen)并在室温下温育载玻片1小时，在PBS中清洗。 在DAPI中(0.2μg/ml)浸泡载玻片并封固在盖玻片下的Biomeda凝胶 装置中(Fisher)。装备有Chroma Pinkle Filter Set(Chroma， Brattleboro，VT)的Olympus显微镜观察到β3和CD31的共表达，该 显微镜带有UV，FITC和罗丹明激发滤波器，及二/三重带通滤波器， 允许多波长的同步观察。

统计分析。使用带有Stat Exact软件的Fisher Exact检验用RIT 及CMRIT方法小鼠的死亡率数据的统计分析，以确定死亡率是否 不同。使用Cochran Mantel Haenszel检验统计分析数据，评价RIT 剂量对RIT及CMRIT方法组结果的影响。通过Fisher Exact检验比较 RIT对CMRIT方法组的治愈率和所有的其它应答，对2肿瘤的动物使 用的最好肿瘤应答用于统计学目的。酌情使用STATview软件，通过 方差分析(ANOVA)(FisherPLSD)评价在不同时间点免疫病理学组 之间的统计学差异，认为p＜0.05为显著。

杀肿瘤效果。未小鼠，接受单独环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe- [N-Me]-Val小鼠，以及接受ChL6未标记抗体小鼠的大多数肿瘤均不 间断地生长。发现环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)(每隔一天 施用，总剂量6×250μg)对肿瘤生长没有明显的效果，在18只测试小 鼠中没有治愈。除2只未小鼠之外，还有两只接受未标记ChL6 抗体的小鼠出现肿瘤的自发恢复，因此无RIT小鼠获得8％(4/50)的 治愈率(表1，图1)。

在表1中，括号中的数字代表使用患有两个肿瘤(2肿瘤小鼠)小 鼠的最佳应答所获的总数。例如，如果一个2肿瘤小鼠治愈了一个肿 瘤而一个肿瘤部分恢复，可以在该表中最坏的应答分析下算作是一个 部分恢复(PR)(不带括号的项目)，但是使用最佳应答分析也可以 算作是一个治愈(C)(括号中的数字)。用260μCi(高剂量)或200-230 μCi(低剂量)90Y-DOTA-肽-ChL6单独或与6剂环-(Arg-Gly-Asp- D-Phe-[N-Me]-Val)结合(CMRIT方法)接受RIT的小鼠。从效 能评定中排除RIT后30天之前死于毒性的小鼠中的肿瘤应答。单独的 高剂量RIT在26只小鼠中得到4只治愈(15％)，而单独的低剂量 RIT在20只小鼠中得到5只治愈(25％)。低剂量RIT的CMRIT方 法在22只小鼠中得到8只治愈(36％，p＝0.514)，而高剂量RIT的 CMRIT方法在19只小鼠中得到10只治愈(53％，p＝0.011)。统计分 析表明根据RIT或CMRIT方法调节的RIT剂量的结果不存在差 异。因为剂量并没有改变结果(p＞0.8)，所以比较RIT的结果和CMRIT 方法的结果。这个结果显示CMRIT方法比RIT(20％治愈率)得到明 显更多的治愈(44％治愈率)(p＝0.020)，与CMRIT方法比单独RIT 效能更强的情形相一致。

图1表明CMRIT方法增强了在小鼠乳腺癌异种移植中的效 能。显示了对作为单一试剂以及结合(CMRIT方法)应用的 90Y-DOTA-肽-ChL6和环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)的肿瘤应 答。结果表明了RIT(200-260μCi 90Y-DOTA-肽-ChL6)结合使用的高 剂量和低剂量结果。各组为未组，用315μg未标记ChL6的 小鼠，用6剂250μg环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)的小 鼠，单独用RIT的小鼠，以及CMRIT方法小鼠(6剂250μg 环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)和1剂RIT(200和260μCi))。 在84天结束时评定应答。与RIT小鼠(如图所示使用最坏的结果， 或双肿瘤小鼠的最佳结果，后者p＝0.02)相比，在CMRIT方法小 鼠中观察到了明显增强的效能。

表1

在表1中，cRGD五肽是环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)； CR是完全恢复，PR是部分恢复，NR是没有恢复，括号中的数字是基 于2肿瘤小鼠的最佳反应的。

环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)的毒性。与未小鼠相 比(所有未接受RIT(未的，未标记的ChL6，环-(Arg-Gly- Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)的组小鼠无一死于毒性)，单独的环-(Arg- Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)(250μg，10天内6剂)没有引起死亡率 或毒性增加。环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)的以及未治 疗小鼠表现出相似的体重变化以及RBC，WBC和血小板水平。与未接 受RIT的小鼠相比，用高或低剂量RIT的小鼠以及用RIT和环- (Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)结合的小鼠表现出体重， RBC，WBC和血小板计数降低，但是RIT和环-(Arg-Gly-Asp-D- Phe-[N-Me]-Val)的结合并没有使这些值低于单独RIT小鼠中观 察到的值(图2A-D)。在高剂量RIT情况下，在RIT(13/39小鼠(33％)) 和CMRIT方法(23/42小鼠(55％))组中死亡率均高于未小鼠， 但CMRIT方法并没有使死亡率统计学的升高(Fisher′s Exact， p＝0.0736)。同样，低剂量RIT和CMRIT方法组的死亡率高于未 小鼠，但CMRIT方法小鼠的死亡率(8/30(27％))也没有高于 RIT(8/28小鼠(29％))(Fisher′s Exact，p＝1.000)。结合低和高 剂量组死亡率结果可以发现，CMRIT方法并没有使死亡率高于RIT (Fisher′s Exact，p＝0.1652)。这些结果表明cRGD五肽，如环- (Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)，单独或与RIT结合使用并未显著 提高毒性。

图2显示环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)疗法或CMRIT方 法均没有增高毒性。A：RBC，B：血小板，C：WBC，D：小鼠体重， 来自单一试验的未小鼠(5)，环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]- Val)(6剂250μg)单独小鼠(13)，RIT单独小鼠(260μCi 90Y-DOTA-肽-ChL6)(5)，以及CMRIT方法(260μCi90Y-DOTA- 肽-ChL6和6剂250μg环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)) 小鼠(13)。所示结果代表各组总的血样和所示日期各组平均体重±s.e。 cRGD五肽单独或与RIT结合均未提高毒性。

肿瘤和内皮细胞(总细胞)中的细胞凋亡。通过TUNEL方法，与 CD31染结合使用来评价细胞调亡以鉴定内皮细胞(图3)。求取每 个肿瘤非坏死组织的6个随机视野(X600)中TUNEL-阳性肿瘤和内 皮细胞(总细胞)的数目的平均值，所述视野的选择使得细胞覆盖该 视野整个面积，其平均数应大约为350个细胞/视野。未肿瘤平均 具有9±1.0阳性细胞/视野(2.6％)。一剂的cRGD五肽(环-(Arg- Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val))在后1天明显提高了细胞凋亡 (16.2±1.89，4.6％)，但该细胞凋亡水平随后有所降低。与未肿 瘤相比，单独RIT明显地提高了细胞凋亡作用(如图4所示)， 第6天观察到最大数量的凋亡细胞(21.4±2.9，6.1％)。CMRIT方法 带来的细胞凋亡作用在所有时间点均高于所有其他组，只有第6 天除外(图4注明了显著的细胞凋亡增强)。CMRIT方法带来的细胞 凋亡作用在RIT后第5天达到最高峰值(30.7±2.0细胞/视野，8.8％)， 而CMRIT方法后第1天有较低的峰(21.9±2.6，6.3％)。这两个细胞 凋亡峰与细胞凋亡发生的两个“波”一致。但是，与RIT肿瘤相比， CMRIT方法肿瘤中发生的总细胞凋亡的差异是加成性的，这表明 还有其它机制可能影响效能。

图3的显微照相图表明CMRIT方法引起细胞凋亡作用增强。来自 (A)未，(B)cRGD五肽-(1剂250μg环-(Arg-Gly- Asp-D-Phe-[N-Me]-Val))，(C)RIT(260μCi90Y-DOTA-肽-ChL6)， 和(D)CMRIT方法(260μCi90Y-DOTA-肽-ChL6和6剂250μg环- (Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val))小鼠肿瘤的10μm切片显示了细 胞凋亡(用Apop Tag Red进行TUNEL)和CD31(FITC)，所述小 鼠是在开始后5天进行评价。在罗丹明和FITC染料(箭头标记的 橙细胞)协同定位(colocalized)的肿瘤细胞以及内皮细胞中(FITC) 观察到了细胞凋亡(罗丹明)。背景核染用DAPI获得。用装备有 Pinkle滤波器的Olympus显微镜以X600给切片照相。与RIT单独治 疗小鼠相比，在CMRIT方法小鼠中观察到更强的肿瘤和内皮细胞 细胞凋亡(ANOVA，p＜0.05)。

内皮细胞凋亡。由于cRGD五肽以前曾被报道可在血管内皮细胞 中诱导凋亡，因此将未肿瘤与cRGD五肽-(一剂环-(Arg- Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val))肿瘤中的内皮细胞凋亡相比较。与未治 疗肿瘤(0.6±0.1)相比，cRGD五肽后第1天(2.5±0.5)和第5 天(2.4±0.7)观察到了明显更强的细胞凋亡作用。但是，cRGD五肽- 和未肿瘤之间的这些细胞凋亡差异并未反应在生长或肿瘤体 积的差异上，甚至多剂(6)环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)也 一样。与未肿瘤相比，在早期的时间点上，单独RIT也产生了明 显更强的细胞凋亡作用(图4)。CMRIT与RIT后第1天和第5天的 内皮细胞凋亡的2个峰有关，在第1天水平最高(3.9±1.2细胞/视野) (图4)。在CMRIT方法肿瘤中内皮细胞凋亡的平均水平在所有 时间均高于所有其他组，只有第3天和第6天除外。不过就第1和第5 天产生的峰而言，增强的内皮细胞凋亡似乎没有高于在CMRIT方法治 疗肿瘤中的总细胞凋亡。

图4的数据图形显示单独cRGD五肽或CMRIT方法后第1 和第5天，环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)引起了肿瘤和内皮 细胞中细胞凋亡增强。通过TUNEL和CD31免疫组织化学分析来自未 小鼠(■)，cRGD五肽小鼠(1剂250μg环-(Arg-Gly- Asp-D-Phe-[N-Me]-Val))(●)，RIT小鼠(260μCi90Y-DOTA- 肽-ChL6)(▲)，以及CMRIT方法小鼠(260μCi90Y-DOTA- 肽-ChL6和6剂250μg环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val))(◆) 的HBT3477肿瘤来估计A.总细胞凋亡(实心符号)和B.内皮细胞凋亡 (EC)(空心符号)。以X600放大倍数定量来自每个肿瘤6个随机 视野的细胞凋亡，选4个肿瘤用于测定的平均数。通过实心符号 表示总细胞凋亡，空心符号表示内皮的细胞凋亡。误差线表示平均数 的标准误差。明显大于RIT值的CMRIT方法值(ANOVA，p＜0.05) 用*标记；明显大于未值的cRGD五肽值(ANOVA，p＜0.05)用& 标记；明显大于未值的RIT值用$标记。RIT后2小时，1天和5 天时，CMRIT方法肿瘤的总细胞凋亡明显不同于RIT肿瘤。RIT 后6小时，2天和5天时，CMRIT方法小鼠的内皮凋亡明显高于 RIT小鼠。X轴没有按比例描绘以说明在初期时间点的各种变化。Y轴 上的断口表示在总细胞凋亡和内皮细胞凋亡之间的刻度变更。

总细胞增殖。测定未肿瘤和在1，5及6天时肿瘤的Ki67阳 性细胞平均数(在第6天未测定cRGD五肽的肿瘤)。Ki67抗体 会识别在所有细胞周期活性期存在于增殖细胞核中的蛋白质，但不识 别在G0期细胞中发现的蛋白质。这个结果表明在第5天与未小鼠 相比，单独的RIT或cRGD五肽可以明显降低在细胞周期呈活性的细 胞的增殖率(表2)。与未小鼠相比，CMRIT方法同样降低了增 殖，且与单独的RIT相比，在第6天明显降低了增殖(图5)。

图5的肿瘤细胞显微照相图表明CMRIT方法后肿瘤细胞的增 殖相对于RIT有所降低。通过Ki67小鼠MAb及随后的抗-小鼠罗 丹明-连接的抗体，在RIT后6天肿瘤的10μm冷冻切片上鉴定(A) RIT和(B)CMRIT方法肿瘤中的增殖细胞。通过抗CD31大鼠 MAb及随后的连接于FITC抗-大鼠抗体鉴定用于计数微血管密度的内 皮细胞簇。核染料为DAPI。以X1000放大倍数定量来自每肿瘤6个随 机视野的增殖，选4个肿瘤用于测定的平均数。RIT后6天，与 RIT肿瘤相比，在CMRIT方法肿瘤中观察到的Ki67-阳性细 胞更少，尽管在这个时间点微血管的数目并没有不同。用装备有Pinkle 滤波器的Olympus显微镜以X600给切片照相。

微血管密度。后在关键时间点，通过求取来自未，cRGD 五肽，RIT和CMRIT方法小鼠各肿瘤一个切片在6个随机选 择视野的非连续CD31-染区域的总数的平均数，测定各肿瘤的微血 管密度(表2)。与未小鼠相比，在RIT后第6天，在接受 单独RIT或与cRGD五肽(环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)) 结合RIT的小鼠中的微血管密度明显降低。在第1天和5天观察到的 更强内皮细胞凋亡(高于RIT)仿佛与微血管密度中可测量差异不相 关，且并未高于总细胞凋亡。这些数据表明与CMRIT方法有关的内皮 细胞凋亡增强可以促进结果，但多半不是影响结果的唯一机 理。另外，第6天的数据没有表明：降低的微血管计数可以解释在RIT 和CMRIT方法之间结果的差异。

表2

a腹膜内1剂环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)，250μg。

b 315μg静脉内1剂90Y-DOTA-肽-ChL6(260μCi)。

c 315μg静脉内1剂90Y-DOTA-肽-ChL6(260μCi)和腹膜内4剂 250μg环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)，各剂隔天进行，在RIT 前1小时开始，

d以400X计数各肿瘤6个视野内CD31阳性区域平均数±SE

e与未的明显不同(ANOVA，p＜0.05)

f求取以1000X计数的各肿瘤6个视野内Ki67-阳性细胞数(约 112±10细胞/视野)的平均数以测定增殖细胞的平均数。

g CMRIT方法显著低于RIT(ANOVA，p＜0.05)。

在HBT 3477肿瘤中αVβ3的表达。用抗β3抗体(该抗体与小鼠整联 蛋白(CD61)反应)进行的免疫组织化学表明：在裸鼠中HBT 3477 肿瘤的选定区域上存在有限的标记(图6)。β3标记的区域包括呈现出 环状的脉管结构区域，该区域被识别CD31的抗体共同标记，这与供应 这些肿瘤的血管中αVβ3的表达情况相一致。观察发现β3的表达基本上 低于CD31，如果仅有一小部分CD31标记的内皮细胞是新血管，那么 即可以得到这样的结果。

图6的肿瘤切片显微照相图显示β3和CD31在HBT 3477乳腺癌肿 瘤细胞中表达。使用免疫组织化学技术，分析取自未小鼠的肿瘤 中整联蛋白β3和内皮蛋白质CD31的表达。应用抗小鼠β3的仓鼠MAb， 然后应用抗仓鼠罗丹明-连接的抗体。随后应用大鼠抗小鼠CD31 MAb，然后是抗大鼠FITC-连接的抗体。罗丹明(β3)和FITC(CD31) 的协同定位(Colocalization)(橙，箭标表示)与供应肿瘤的血管 中αVβ3整联蛋白的表达一致。用装备有Pinkle滤波器的Olympus显微 镜以X600给肿瘤切片照相。

该结果表明本发明的CMRIT方法相对于常规的RIT单一疗法能 够增强肿瘤的效能，而不会增强毒性。与单独RIT 15％的治愈率、 单独环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)0％的治愈率相比，应用高 剂量RIT的CMRIT方法产生53％的治愈率，而与单独RIT 20％的治 愈率相比，结合的剂量水平产生了44％治愈率。尽管在更高的剂量水 平CMRIT方法与死亡率的升高有关，但CMRIT方法与RIT的死亡率 并没有统计学差异。这些结果表明与单一物质的疗法相比，CMRIT方 法会带来显著更好的结果，而毒性并没有伴随的统计学升高。

DeNardo等已经报告RIT之前1小时施用250μg cRGD五肽 (EMD270179)可使HBT 3477肿瘤对RIT的吸收增强至50％(Cancer Biother.Radiopharm.15：71-79(2000))。不过在HBT 3477模型的一 项利用90Y-DOTA-肽-ChL6的早期研究中，其中剂量从110μCi到330 μCi变化，当注射剂量超出260μCi 90Y-DOTA-肽-ChL6时，治愈率没 有随着注射剂量的增强而提高。这些结果强有力的表明与cRGD五肽 如环-(Arg-GlyAsp-D-Phe-[N-Me]-Val)有关的RIT吸收的提高并不是 治愈率升高的主要因素。

通过评定内皮与肿瘤细胞相比的细胞凋亡及其时程，研究血管对 CMRIT方法的影响。如果cRGD五肽诱导了内皮的细胞凋亡并跟随内 皮细胞的损失随后诱导肿瘤细胞凋亡，则可以预期：在总细胞凋亡增 强之前观察到内皮的细胞凋亡增强。cRGD五肽(环-(Arg-Gly-Asp- D-Phe-[N-Me]-Val)结合RIT(如CMRIT方法)可升高内皮和总细胞 凋亡水平，使其在几乎所有的时间点均高于用RIT观察到的细胞凋亡 水平，在第1和5天水平明显增强。另外，与未相比，一剂的环- (Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)能在相同的时间点明显增强内皮的 细胞凋亡。尽管还不清楚内皮细胞凋亡先于总细胞凋亡的方式，但与 RIT相比，在CMRIT方法中内皮的细胞凋亡持续上升。但是，这些差 异的效果不是直接由评定时间点的微血管密度的差异反映的。环- (Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)有可能影响了微脉管组织的质量， 而该质量不会已经由微血管密度反映出来。这与CMRIT方法中第6 天观察到的增殖低于RIT肿瘤的情形相一致，第6天是评价的最 迟的时间点，这时微血管数目在RIT和CMRIT方法的肿瘤中已 经减少。

在CMRIT方法和RIT之间的其它可能差异可能与cRGD五肽如 环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)的间接抑制效果有关系。1-4小 时内的照射显示放射作用可诱导β3整联蛋白在肿瘤血管累积及活化。 增强与照射的肿瘤血管腔中血小板的累积有关。通过用抗αVβ3整联蛋 白的抗体阻断，已经抑制了血小板与内皮细胞的粘附，且血小板可能 通过包含在α颗粒中的生长因子促进肿瘤血管生成。已经报道环- (Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)对分离的α2bβ3受体的IC50为420 nM，而对αVβ3的则为5nM。在小鼠模型中的这些剂量水平，有可能 由于辐射，环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)抑制血小板在肿瘤 脉管系统的累积，因此降低了与肿瘤细胞的旁分泌相互作用。另外， 已经报道αvβ3整联蛋白受体可参与血管内皮生长因子-2(VEGFR-2) 受体的完全活化。另外，cRGD五肽的抑制作用可能阻碍了内皮细胞上 VEGFR-2受体的下游效应，例如降低向相邻肿瘤细胞释放生长因子， 导致整体抑制肿瘤细胞增殖。

HBT3477皮下肿瘤生长没有对环-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]- Val)的抑制做出应答(单一模态)，这很可能表明：在这种模型中肿 瘤生长利用存在的血管，或即使在cRGD五肽存在的情况下也可发生 充足的血管生长。RIT后，当血管密度基本上降低时，cRGD五肽的抑 制可能导致肿瘤细胞减少及内皮细胞从辐射损伤康复，使得处于细胞 凋亡形式的肿瘤细胞死亡增加，与增强效能相关。

本发明的CMRIT方法由于用抗血管生成环状RGD五肽结合疗 法，增强了RIT肿瘤的效能。本发明CMRIT方法观察到的 协同作用很可能由于结合了几个机理效应，使得细胞凋亡增强并减少 细胞增殖。但是用CMRIT方法观察到的高水平内皮细胞凋亡与影响肿 瘤细胞损失并促进治愈率提高的内皮损失一致。