骨转移疾病的方法、其药物以及预测骨转移疾病的临床结果的方法

骨转移疾病的方法、其药物以及预测骨转移疾病的 临床结果的方法

本发明提供了：个体中的骨转移疾病的新方法，其中所述方法优选地取决于 个体在前或期间是否在一种或多种体液中显示某些特定蛋白水平，其中所述包括 向个体施用至少一种泛αv整联蛋白抑制剂；用于所述新方法中的药物；以及基于所述个体 的一种或多种体液中的所述特定蛋白水平预测用至少一种泛αv整联蛋白抑制剂的结 果的方法。

更具体地，本发明提供了在个体中用至少一种泛αv整联蛋白抑制剂、优选包括泛α v整联蛋白抑制剂abituzumab或Intetumumab骨转移疾病、优选源自前列腺癌、乳腺癌 和/或癌症的骨转移疾病的新方法，其中所述个体在之前或期间在一种或多种体液中 显示某些特定蛋白水平。

骨转移或癌转移性骨病是一类由原发性肿瘤侵袭到骨导致的癌症转移。骨是最常 见的转移位置之一。[ Coleman RE (October 2006). "Clinical features of metastatic bone disease and risk of skeletal morbidity". Clin. Cancer Res. 12 (20 Pt 2): 6243s–9s.] 尽管任何类型的癌症都能够在骨内形成转移性肿瘤，但骨髓的微 环境倾向于有利于特定类型的癌症，包括前列腺癌、乳腺癌和肺癌。[ Guise T (October 2010). "Examining the metastatic niche: targeting the microenvironment". Semin. Oncol. 37 (Suppl 2): S2–14.] 特别是在前列腺癌中，骨转移倾向于是唯一的转 移部位。[ Jimenez-Andrade JM, Mantyh WG, Bloom AP, Ferng AS, Geffre CP, Mantyh PW (June 2010). "Bone cancer pain". Annals of the New York Academy of Sciences 1198: 173–81]。

肺癌，也称为肺的癌或肺部癌，是以肺组织中不受控制的细胞生长为特征的恶性 肺肿瘤。如果不进行，该生长可通过转移扩散到肺外而进入附近组织或身体的其它部 分（包括肝、脑和骨）。始于肺的大多数癌症，被称为原发性肺癌，是源自上皮细胞的癌。主要 的原发性类型是小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。非小细胞肺癌（NSCLC）是除小 细胞肺癌（SCLC）之外的任何类型的上皮肺癌。作为一个类别，与小细胞癌相比，NSCLC及其 转移对化疗相对不敏感。在转移性NSCLC中使用了多种化疗，不幸的是迄今为止效果甚微。 小细胞癌或小细胞肺癌（SCLC）是一类高度恶性的癌症，其最常见产生于肺内，但其也可偶 尔在其它身体部位（诸如子宫颈、前列腺和胃肠道）中产生。SCLC通常在该肿瘤的自然病史 中非常早地广泛转移。同样在这种情况下，所述转移主要影响骨、肝和脑。

乳腺癌从乳腺组织发展。它最常见地在来自乳导管的内衬和为导管提供乳的小叶 的细胞中发展。从导管发展的癌症被称为导管癌，而从小叶发展的癌症被称为小叶癌。此 外，存在超过18种其它亚型的乳腺癌。乳腺癌的诊断通过对相关肿块进行活检来定期确认。 一旦确诊，则进行进一步测试以确定癌症是否已经扩散到乳房之外以及它可能对于哪些治 疗有响应。如果癌症已经扩散到乳房之外，则乳腺癌呈现为转移性疾病。由转移性乳腺癌引 起的症状将取决于转移的位置。常见的转移部位包括骨、肝、肺和脑。

转移过程是多步骤事件，并且代表癌症最可怕的方面。在诊断时，癌症在其自然病 史中经常是非常晚期的，并且转移的存在是常见的事件。事实上，约30％的患者在临床诊断 时具有可检测的转移，而另外30％的患者具有隐匿性转移。转移可以是弥散的，并且它们可 以同时侵染不同的器官，或定位至特定器官。在局部疾病的情况下，手术是首选；然而 复发和预后取决于许多标准，诸如：可切除性、患者的临床情况和转移数目。

切除后，复发是常见的，表明在诊断时存在微转移灶。全身化疗是理想的设置，但 只有少数患者被其治愈，而在大多数患者中，全身化疗失败。许多生理屏障和药代动力学参 数参与降低其效力。

肝、肺和淋巴结是过滤器官，因此倾向于转移。转移的不良化学敏感性，特别是源 自结肠直肠的转移的不良化学敏感性，迫使许多研究人员采取方法增加药物的时间和浓 度。出于减少或限制对这种重要和精细器官的副作用的需要而导致开发了肝脏隔离技术用 于灌注抗肿瘤剂。(K. R. Aigner, Isolated liver perfusion.在: Morris DL, McArdle CS, Onik GM, eds. Hepatic Metastases. Oxford: Butterworth Heinemann, 1996. 101-107)。自1981年以来，已连续引入了改良和技术改进。肝转移可以具有不同的来源，并 且它们的化学敏感性可以根据组织学类型和它们在加热下的反应而变化。

本领域对于开发用于全身癌症、特别是转移的新策略仍然存在日益增长 的需要。

因此，本发明的目标是开发这样的新策略。它应当适用于全身，并且它应当降 低待应用的癌症剂的剂量和/或提高其效率。另一个目标是使肿瘤血管正常化以增加 肿瘤的全身剂的递送，即，使肿瘤血管系统重新恢复非肿瘤组织的血管系统的功能。

因此，本发明的优选目标是为人类、特别是患有骨转移、优选与其来源无关的骨转 移的人类癌症患者提供更有效、更好的耐受的，因此优选导致增强的总体存活（OS）、无 进展存活（PFS）、生活质量（QOL）和/或增加的中值存活。

在美国，前列腺癌是皮肤癌以外最常见的癌症，并且是男性癌症死亡的第二最常 见原因。

前列腺癌被分为四个阶段：I期前列腺癌仅在前列腺中发现，并且在直肠指诊期间 不能感觉到，也不能通过成像可见。在II期前列腺癌中，肿瘤已在前列腺内生长，但没有延 伸至其以外，而在III期中，癌症已扩散到前列腺外，但仅在最小程度上扩散。通常，III期内 的前列腺癌将仅扩散到附近的组织，诸如精囊。最后，在IV期中，癌症已在前列腺外扩散到 其它组织，诸如淋巴结、骨、肝和/或肺或脑。

尽管睾酮为去势水平、但依然进展的前列腺癌的范围包括已经对主要激素具 有不同程度和持续时间的响应的肿瘤，而临床表现包括：仅前列腺特异性抗原（PSA）上升、 伴随骨和/或软组织扩散的PSA上升或主要内脏疾病模式的。

目前批准的前列腺癌的包括手术去势、化学去势或手术和化学去势的组合。 去除睾丸（产生睾酮的主要器官）将循环雄激素的水平降低至小于正常水平的5％。雄激素 水平的这种降低抑制前列腺肿瘤生长。虽然手术去势的抗肿瘤作用是直接的，但抗肿瘤作 用可以是暂时的。手术去势通常导致雄激素非依赖性前列腺肿瘤细胞的克隆选择。这导致 前列腺肿瘤以没有睾酮或DHT刺激而增殖的形式再生长。化学去势（也称为医学去势）通常 取代手术去势作为初始。尽管其发病率高，但对患有前列腺癌的男性的选择仍然 相对有限，并且通常取决于癌症的阶段。

选择包括外科诸如根治性前列腺切除术（其中完全除去前列腺），和通过 外部束施加的辐射（所述外部束将剂量从体外引导至前列腺，或通过植入前列腺内的低剂 量放射性种子以局部杀死癌细胞）。抗雄激素激素疗法也用于前列腺癌，其单独使用或 与手术或放射联合使用。激素疗法通常旨在通过使用去势或施用激素类似物来阻断脑垂体 产生刺激睾酮产生的激素，并要求患者长时间注射这些激素类似物。最后，当其它方法失败 时，化疗方法已用于晚期前列腺癌，通常作为最后的手段。近几年来，多西他赛和泼尼 松的组合被确定为对雄激素剥夺后已进展的患者的新护理标准。

上述没有一种是治愈性的，而前列腺癌首先是雄激素依赖性的，尽管有基于 手术和激素的疗法，但通常将进展，并且随着时间变得具有抗性，导致称为“激素难治性癌 症”或“去势抗性癌症”的癌症类型（CRPC）。

CRPC的临床疾病表现通常与骨转移相关，并且可包括疼痛、病理性骨折和脊髓压 迫，具有可能与盆腔不适、由输尿管压迫引起的肾功能障碍、膀胱出口阻塞和性功能障碍的 局部复发。此外，虽然骨癌是CRPC的主要结果，但是患者可能发生软组织转移（淋巴结）以及 在肝、肺、脑和其它器官中发生内脏转移。CRPC患者对化疗的响应极低，并且大多数患者在 开始后20个月内死于进行性前列腺癌。双膦酸盐通常用于患有具有骨转移的去势抗性 前列腺癌的患者。

已证明，前列腺肿瘤保持休眠和临床上不可检测，直到它们开始分泌血管生成因 子并下调血管生成抑制剂的表达。通常，可以说，血管生成对前列腺肿瘤的发生是关键的。 因此，不太出乎意料地，抗血管生成剂可能抑制前列腺癌细胞生长。

在前列腺癌中，肿瘤细胞表达异常的整联蛋白谱并被明显异常的细胞外基质 （ECM）包围。鉴于每种整联蛋白调节特定细胞功能的能力，这些变化具有深远的后果。β3和β 1亚基的表达激活特异性信号通路并支持不同的癌细胞功能。在癌细胞中专门需要β3用于 提高cdc2水平以及cdc2激酶活性。这些作用是β3特有的，对于β6没有观察到。已经描述了β3 和β6整联蛋白变体的上调。Zheng等人(Cancer Research 1999; 59, 1655–1664)使用从十 六个外科标本分离的人前列腺癌细胞，以显示这些细胞表达αvβ3，而正常的前列腺上皮细 胞不表达。类似地，发现αvβ6在腺癌中表达(Li等人; Molecular and Cellular Biology 2007; 27, 4444)。

整联蛋白抑制剂的使用很可能影响癌细胞存活和血管生成，因为整联蛋白由肿瘤 细胞以及内皮细胞表达。虽然难以区分对肿瘤生长的作用和对血管发生的作用，但当靶向 的整联蛋白由肿瘤和内皮细胞同时表达时，可以预测这些抑制剂的最大反应。

骨是前列腺癌的最常见的转移部位。Bisanz等人(Molecular Therapy 2005; 12, 634–643)展示了α-v整联蛋白对骨中的前列腺肿瘤存活的积极作用。人前列腺癌骨异种移 植物的分析显示，肿瘤内施用脂质体包封的人类α-v siRNA显著抑制骨中PC3肿瘤的生长并 增加前列腺肿瘤细胞的凋亡。进一步研究(McCabe等人, Oncogene 2007; 26, 6238–6243) 证明肿瘤细胞上αvβ3整联蛋白的活化对于识别关键骨特异性基质蛋白是必需的。这些数据 表明αvβ3整联蛋白调节远端转移中的前列腺癌生长。

由于整联蛋白介导肿瘤细胞和骨微环境之间的相互作用并促进骨中的生长，所以 使用整联蛋白抑制剂的潜在应用是预防前列腺癌骨病变。这些病变是成骨性的和/或溶骨 性的，并且经常在前列腺癌患者中检测到（超过80％的前列腺癌患者在尸体解剖时已经建 立骨转移）。

最近的研究已显示，αvβ3整联蛋白促进由转移到骨的前列腺癌细胞介导的骨增 长，并指出αvβ3是阻断前列腺癌成骨细胞病变的潜在靶标。免疫组织化学分析已证明α v整联蛋白存在于大部分人前列腺癌组织样品中。

这些和其它结果表明抗整联蛋白剂可以具有直接和间接的抗肿瘤活性。但是只有 很少的临床试验报道肽或非肽整联蛋白抑制剂是前列腺癌中的有效试剂。

因此，需要提供骨转移，优选乳腺癌、肺癌和/或前列腺癌的骨转移的方法。此 外，特别需要提供用于前列腺癌骨转移，尤其是去势抗性前列腺癌骨转移的方法。

因此，还需要提供来自转移性雄激素非依赖性前列腺癌（mAIPCa）的骨转移 和/或来自转移性雄激素依赖性前列腺癌（mADPCa）的骨转移的方法。

根据本发明的一个方面，提供了用于在个体、优选人个体中鉴定骨转移的方法，所 述骨转移对用至少一种泛αv整联蛋白抑制剂、优选Abituzumab的敏感，其包括在一种 或多种体液中测定所述特定蛋白水平，其中选自第一组的所述特定蛋白的一种或多种蛋白 的高水平和/或选自第二组的所述特定蛋白的一种或多种蛋白的低水平表明所述肿瘤对所 述敏感。

体液优选是源自活体个体、优选活人个体的体内的液体。它们包括从身体排泄或 分泌的液体以及通常不排泄或分泌的身体水。

体液可以优选地按类型指定，诸如细胞内液、细胞外液、血管内液（例如全血、血液 和血浆）、间质液、淋巴液（有时被认为是间质液的亚型）和跨细胞液。

优选的体液选自全血（优选也称为“血液”）、血液血清（优选也称为“血清”）、血液 血浆（优选也称为“血浆”）、渗出物、淋巴液、粘液、腹膜液、唾液、痰液、眼泪和尿液。特别优 选的体液选自全血（优选也称为“血液”）、血液血清（优选也称为“血清”）、血液血浆（优选也 称为“血浆”）。特别优选的是血液血浆（优选也称为“血浆”）。或者优选的是血液血清（优选 也称为“血清”）和全血（优选也称为“血液”）。

对于每种所述特定蛋白，将患者分类为“低水平”或“高水平”的阈值优选通过如下 测定：列出相应体液中相应特定蛋白的所有可用水平，然后从所述体液中的所述特定蛋白 水平值的该列表确定中值，并将该中值作为阈值。

该阈值优选地在本文中也被称为中值阈值。优选地，在患有如本文所述的相应骨 转移疾病的个体体中确定所述阈值或中值阈值。更优选地，从作为患有相应骨转移疾病 的患病个体体的一部分的多名个体的体液确定相应特定蛋白的所述阈值或中值阈值。

例如，为了确定一种或多种所述特定蛋白的所述中值阈值，从患有去势抗性前列 腺癌（mCRPC）的150名人类个体获取体液样品（在这里：血液样品），以获得约500μL的优选体 液（在这里：血浆）。所含的目标特定蛋白（例如，STX1A）的水平使用基于适体的蛋白检测系 统，例如，在实验部分详细描述的SomaLogic蛋白质组亲和力测定方法来测定，其中每种目 标蛋白的结果由检测系统报告的相对荧光读数表示。在任选的下一步骤中，可以通过除去 非目标蛋白的数据来简化获得的原始数据集，所述非目标蛋白例如，已知在血浆蛋白（诸如 血浆制备过程期间可能发生的血小板活化或细胞裂解）期间由于不适当的样品处理而导致 或影响的蛋白。因此获得的数据集然后优选进行诸如数据归一化程序的步骤，以获得感兴 趣的蛋白的强信号并估计患者研究体中的中值蛋白水平。优选地，该数据分析过程包括 截止优化。因此，该程序提供了一种或多种特定目标蛋白的中值阈值，例如，蛋白STX1A的中 值阈值。采用这种获得的中值阈值，所述150名患有去势抗性前列腺癌（mCRPC）的人类个体 以及患有mCRPC的未来人类个体都可以被容易地表征为分别具有高水平或低水平的一种或 多种特定目标蛋白，例如，STX1A，其具有预测的对用至少一种泛αv整联蛋白抑制剂任选地 与一种或多种化疗剂的组合的临床结果的特定影响。

优选地，在用所述至少一种泛αv整联蛋白抑制剂相应骨转移疾病之前，进行 体液取样和/或相应特定蛋白的中值的评估。优选地，如果所述体液中的其相应特定蛋白水 平高于中值阈值，则将患者分类为“高水平”。相应地，如果所述体液中的其相应特定蛋白水 平低于或等于所述中值阈值，则优选将患者分类为“低水平”。

更优选地，对于每种所述特定蛋白，将患者分类为“低水平”或“高水平”的阈值优 选通过如下测定：列出血浆中相应特定蛋白的所有可用水平，然后从所述血浆中的所述特 定蛋白水平值的该列表确定中值，和将该中值作为阈值。该阈值优选地在本文中也被称为 中值阈值。优选地，在用所述至少一种泛αv整联蛋白抑制剂相应骨转移疾病之前，进行 血液取样和/或相应特定蛋白的中值的评估。优选地，如果所述血浆中的其相应特定蛋白水 平高于中值阈值，则将患者分类为“高水平”。相应地，如果所述血浆中的其相应特定蛋白水 平低于或等于所述中值阈值，则优选将患者分类为“低水平”。优选地，此处的相应骨转移疾 病是转移性前列腺癌，更优选转移性去势抗性前列腺癌（mCRPC）。优选地，所述至少一种泛α v整联蛋白抑制剂包括Abituzumab或Intetumumab。更优选地，所述至少一种泛αv整联蛋白 抑制剂是Abituzumab或Intetumumab。特别优选地，所述至少一种泛αv整联蛋白抑制剂是 Abituzumab。

更优选地，对于每种所述特定蛋白，将患者分类为“低水平”或“高水平”的阈值优 选通过如下测定：列出血浆中相应特定蛋白的所有可用水平，然后从所述血浆中的所述特 定蛋白水平值的该列表确定中值，和将该中值作为阈值。该阈值优选地在本文中也被称为 中值阈值。优选地，在用所述至少一种泛αv整联蛋白抑制剂相应骨转移疾病之前，进行 血液取样和/或相应特定蛋白的中值的评估。优选地，如果所述血浆中的其相应特定蛋白水 平高于中值阈值，则将患者分类为“高水平”。相应地，如果所述血浆中的其相应特定蛋白水 平低于或等于所述中值阈值，则优选将患者分类为“低水平”。优选地，此处的相应骨转移疾 病是转移性前列腺癌，更优选转移性去势抗性前列腺癌（mCRPC）。优选地，所述至少一种泛α v整联蛋白抑制剂包括Abituzumab或Intetumumab。更优选地，所述至少一种泛αv整联蛋白 抑制剂是Abituzumab或Intetumumab。特别优选地，所述至少一种泛αv整联蛋白抑制剂是 Abituzumab。

确定所述阈值水平、尤其是所述中间阈值水平的方法是本领域已知的。合适技术 的实例包括但不限于SomaLogic技术，优选SomaLogic Proteomic Affinity Assay技术， SomaLogic SOMAscan™/V3/Version 10.5.1.1、ELISA（酶联免疫吸附测定）技术及其变体， 包括作为高灵敏度变体的RIA（放射免疫测定）技术、2D SDS-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）质 谱技术和邻近连接测定（PLA）技术。

更具体地，基于所述蛋白的血浆水平将患者分类为“高”和“低”组的阈值优选是跨 患者体的中值血浆水平。所述阈值可以显示与所使用的实际技术的轻微、但不相关的依 赖性。

优选地，使用SomaLogic技术，优选SomaLogic Proteomic Affinity Assay技术 (Somalogic, Inc., 2945 Wilderness Pl, Boulder, CO 80301, USA，如本文所述的软件 包和版本号）测量待分类的样品的蛋白血浆水平。相应地鉴定的中值血浆水平可以用作分 类为“低”和“高”类别的阈值，其优选在用数据归一化步骤处理新的SomaLogic患者概况、诸 如其已经在本文描述的分析中进行之后使用。例如，在888个血浆蛋白水平上的患者的 前蛋白质组概况 - 当它通过SomaLogic系统制备时 - 可以有利地与针对所有样品的现有 前数据集（如应用的vsn2包中实施的方差稳定化）组合。最后，从本文所述的临床研究 （PERSEUS研究）检索特定感兴趣蛋白的归一化的患者的前水平（放射性PFS的预测性的 中值阈值- MAPK11: 9.46、STX1A: 9.06、MAP2K2: 11.9、TNFRSF17: 12.5、RGMB: 11.0、 LEPR:11.2、IL1B:11.1、ICAM3:10.4、F5:15.7、ANG:12.5、PIGR:12.6、TEK:11.3；所有中值阈 值作为如通过Somalogic技术测量的log2标度上的蛋白水平单位且在数据集的方差稳定化 归一化之后给出）。在没有现有数据集可用或测量血浆蛋白水平的技术不是SomaLogic技术 的情况下，中值总血浆水平 – 当它来自新技术或新患者体（对于相应指示，其优选包含 至少120个患者）时 - 优选地首先终止，然后可以基于新的体中值容易地进行分类。

特别优选地，如果所述血浆中的相应特定蛋白水平比相应特定蛋白水平的所述中 值阈值高至少2％、更优选高至少5％、甚至更优选高至少10％、特别是高至少25％，则将患 者分类为“高水平”。

特别优选地，如果所述血浆中的相应特定蛋白水平比相应特定蛋白水平的所述中 值阈值低至少2％、更优选低至少5％、甚至更优选低至少10％、特别是低至少25％，则将患 者分类为“低水平”。

优选地，根据本发明的所述特定蛋白包含

a) 一种或多种蛋白，其选自

和/或

b) 一种或多种蛋白，其选自

和/或还优选与所述特定蛋白具有至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、 并且特别是至少99％序列同源性的蛋白。

更优选地，根据本发明的所述特定蛋白包含

a) 一种或多种蛋白，其选自

和/或

b) 一种或多种蛋白，其选自

和/或还优选与所述特定蛋白具有至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、 并且特别是至少99％序列同源性的蛋白。

更优选地，如果相应体液、优选血浆中的如本文定义的高水平的一种或多种特定 蛋白包括一种或多种选自以下的蛋白，则患者的所述体液中的一种或多种特定蛋白的所述 高水平对于临床结果是有利的

甚至更优选一种或多种选自以下的蛋白

和/或还优选与所述特定蛋白具有至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、 并且特别是至少99％序列同源性的蛋白。

更优选地，如果相应体液、优选血浆中的如本文定义的低水平的一种或多种特定 蛋白包括以下蛋白，则患者的所述体液中的一种或多种特定蛋白的所述低水平对于用至少 一种泛αv整联蛋白抑制剂相应骨转移疾病的临床结果是有利的，

和/或还优选与所述特定蛋白具有至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、 并且特别是至少99％序列同源性的蛋白。

所述特定蛋白优选特征在于以下序列和/或序列ID（如通过UniProt ID以FASTA格 式标示的表1中列出的蛋白的氨基酸序列）：

ANG:

>sp|P03950|ANGI_人血管生成素 OS=智人 GN=ANG PE=1 SV=1

DCN:

>sp|P07585|PGS2_人核心蛋白聚糖 OS=智人 GN=DCN PE=1 SV=1

F5:

>sp|P12259|FA5_人凝血因子 V OS=智人 GN=F5 PE=1 SV=4

ICAM3:

>sp|P32942|ICAM3_人细胞间黏附分子3 OS=智人 GN=ICAM3 PE=1 SV=2

IL1B:

>sp|P01584|IL1B_人白介素-1β OS=智人 GN=IL1B PE=1 SV=2

LEPR:

>sp|P48357|LEPR_人瘦素受体 OS=智人 GN=LEPR PE=1 SV=2

MAP2K2

>sp|P36507|MP2K2_人双特异性丝裂原活化蛋白激酶激酶2 OS=智人 GN=MAP2K2 PE=1 SV=1

MAPK11

>sp|Q15759|MK11_人丝裂原活化蛋白激酶11 OS=智人 GN=MAPK11 PE=1 SV=2

PIGR:

>sp|P01833|PIGR_人聚合免疫球蛋白受体 OS=智人 GN=PIGR PE=1 SV=4

RGMB:

>sp|Q6NW40|RGMB_人RGM结构域家族成员B OS=智人 GN=RGMB PE=1 SV=3

STK17B:

>sp|O94768|ST17B_人丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶17B OS=智人 GN=STK17B PE=1 SV= 1

STX1A:

>sp|Q16623|STX1A_人突触融合蛋白-1A OS=智人 GN=STX1A PE=1 SV=1

TEK:

>sp|Q02763|TIE2_人血管生成素-1受体 OS=智人 GN=TEK PE=1 SV=2

TNFRSF17:

>sp|Q02223|TNR17_人肿瘤坏死因子受体超家族成员17 OS=智人 GN=TNFRSF17 PE=1 SV=2

根据本发明的特定蛋白还优选为与上述序列具有至少80％、更优选至少90％、甚 至更优选至少95％、并且特别是至少99％序列同源性的蛋白。

如本文进一步描述，对于患有骨转移疾病（包括但不限于转移性前列腺癌和转移 性去势抗性前列腺癌(mCRPC)）的个体，在用至少一种泛αv整联蛋白抑制剂（优选包括 Abituzumab或由Abituzumab组成）的情况下，第一组所述特定蛋白中的一种或多种蛋 白的高水平和/或来自第二组特定蛋白中的一种或多种蛋白的低水平预示着改善的临床益 处，优选如本文所述的临床益处。优选地，对于患有骨转移疾病（包括但不限于转移性前列 腺癌和转移性去势抗性前列腺癌(mCRPC)）的个体，在用至少一种泛αv整联蛋白抑制剂（优 选包括Abituzumab或由Abituzumab组成）的情况下，第一组所述特定蛋白中的一种或 多种蛋白的高水平和/或来自第二组特定蛋白中的一种或多种蛋白的低水平预示着改善的 总体存活和/或改善的无进展存活。

在一个替代优选实施方案中，可以在根据本发明的方法中采用Intetumumab (CNTO-95)替代Abituzumab作为所述至少一种泛αv整联蛋白抑制剂。

所述特定蛋白的所述蛋白水平优选同时是负预后的，其表明由标记物进行的生物 学处理在疾病预后中起作用（汇总于表2中）。

表 1：

取决于Abituzumab下相应特定蛋白水平的临床结果：

表 2：

取决于SoC下相应特定蛋白水平的临床结果（优选通过放射性PFS (rPFS)测定）：

优选根据反应（完全和部分）、益处（反应和稳定疾病）和进行性疾病分析具有肿瘤 和/或转移的患者（优选也称为肿瘤病变或病变）的临床结果。优选使用实体瘤中的反应评 价标准（即RECIST标准）来评价病变，其中“完全反应”（CR）优选被定义为靶病变的消失；“部 分反应”（PR）优选被定义为靶病变的最长直径（iron metre）的总和减少至少30％，优选地 以基线总和最长直径作为参考；“进行性疾病”（PD）优选被定义为靶病变的最长直径的总和 增加至少20％，优选以从开始或出现一个或多个新病变后记录的最小总和最长直径作 为参考；且“稳定疾病”（SD）优选被定义为其缩小既不足以定性为部分反应，增加也不足以 定性为进行性疾病，优选以从开始后的最小总和最长直径作为参考。

优选地，将所述至少一种泛αv整联蛋白抑制剂，优选Abituzumab或Intetumumab （CNTO-95）与一种或多种化疗剂组合施用于所述个体。

前列腺癌和/或其转移的可涉及手术（例如，根治性前列腺切除术）、放疗（包 括近距离放疗（例如，前列腺近距离放疗）和外束放疗）、高强度聚焦超声（HIFU）、化疗、口服 化疗药物（替莫唑胺/ TMZ）、冷冻手术、激素疗法或其组合。

大多数激素依赖性癌症在一至三年后变得难治，并且尽管进行激素，但仍继 续生长。先前认为的“激素难治性前列腺癌”或“雄激素非依赖性前列腺癌”，术语去势抗性 已经取代了“激素难治性”，因为虽然它们不再对去势（通过化学或手术方式减少可用 的雄激素/睾酮/ DHT）有反应，但这些癌症仍然在雄激素受体活化上显示出对激素的依赖 性。然而，现在存在若干种可用于CRPC以改善存活的化疗。

此处的化疗剂优选包括但不限于多西他赛、卡巴他赛、贝伐单抗、多西他赛、沙利 度胺和泼尼松及其组合。例如，贝伐单抗、多西他赛、沙利度胺和泼尼松的组合已经显示临 床益处。

此处的化疗剂还优选包括但不限于西妥昔单抗、帕尼单抗、伊立替康、长春瑞滨、 卡培他滨、亚叶酸、奥沙利铂、顺铂、卡铂、5-氟尿嘧啶（5-FU）、贝伐单抗、阿柏西普和瑞格非 尼。

更优选地，使用选自以下的一种或多种化疗剂，甚至更优选两种或更多种，并且尤 其是一种、两种或三种化疗剂

a）醋酸亮丙瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特、曲普他列汀、戈舍瑞林、氟他胺、环丙孕酮、布舍 瑞林和地加瑞克，

b）唑来膦酸、帕米膦酸、氯膦酸二钠、阿仑膦酸和伊班膦酸，

和/或

c）阿比特龙、醋酸阿比特龙、泼尼松、恩扎鲁胺、二氯化镭Ra 223、多西他赛、 Sipuleucel-T、卡巴他赛和米托蒽醌。这对于患有骨转移疾病的个体是优选的，对于患有转 移性前列腺癌的个体、并且特别是患有转移性去势抗性前列腺癌（mCRPC）的个体是更优选 的。

个体的亚组似乎对雄激素信号传导阻断药物（包括但不限于促黄体生成激素释放 激素（LH-RH）激动剂和/或拮抗剂以及促性腺激素释放激素（GnRH）激动剂和/或拮抗剂有反 应。促黄体生成激素释放激素（LH-RH）以及促性腺激素释放激素（GnRH）是降低人体内睾酮 产生的激素药物。睾酮的这种下降通常在一段时间内减慢或停止前列腺癌的生长。因 此，在许多情况下优选施用这类化合物结合采用Abituzumab或Intetumumab (CNTO-95)治 疗。

在本发明的上下文中优选被视为化疗剂的另外的试剂包括sipuleucel-T、阿比特 龙和恩萨鲁胺。

疼痛在转移性癌症中是常见的，特别是在其骨转移的情况下是常见的。对于前列 腺癌也是如此，并且与骨转移相关的癌症疼痛可以用双膦酸盐、药物诸如阿片样物质和针 对已知转移的姑息性放射疗法。脊髓压迫可以随着向脊柱的转移而发生，并且可以用 类固醇、手术或放射疗法。

传统的癌症是放疗和化疗，其通常彼此组合。科学家和制药公司正在研究药 物以靶向不同类型的癌症，包括转移性骨病。

高强度聚焦超声（HIFU）被CE批准用于骨转移的姑息性护理。作为完全无副作用的 非侵入性，HIFU已经成功应用于癌症以破坏骨、脑、乳、肝、胰腺、直肠、肾、睾丸和 前列腺的肿瘤。

需要考虑的骨转移的一种选择是用双膦酸盐，其通常与其它化疗药物 和/或（抗）激素组合。二膦酸盐已在减少骨癌疼痛、骨破坏和肿瘤生长中展现出极大的 前景。

每月注射氯化镭-223（作为Xofigo，以前称为Alpharadin）已经在2013年5月被批 准用于具有骨转移的去势抗性前列腺癌（CRPC）。

特别优选地，将所述至少一种泛αv整联蛋白抑制剂、优选Abituzumab或 Intetumumab（CNTO-95）、更优选Abituzumab与两种或更多种化疗剂、优选称为护理标准 （SoC）联合施用于所述个体。

优选的护理标准（SoC）包括但不限于：

a）至少一种LHRH激动剂/拮抗剂，其优选选自亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林、比卡鲁胺、尼鲁 米特、曲普他列汀、戈舍瑞林、氟他胺、环丙孕酮、布舍瑞林和地加瑞克，

和/或

b）至少一种双膦酸盐，其优选选自唑来膦酸、帕米膦酸、氯膦酸二钠、阿仑膦酸和伊班 膦酸。

更优选的护理标准（SoC）包括但不限于：

a）至少一种LHRH激动剂/拮抗剂，其优选选自亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林、比卡鲁胺、尼鲁 米特、曲普他列汀、戈舍瑞林、氟他胺、环丙孕酮、布舍瑞林和地加瑞克，

和/或其药学上可接受的衍生物和/或盐；

以及

b）至少一种双膦酸盐，其优选选自唑来膦酸、帕米膦酸、氯膦酸二钠、阿仑膦酸和伊班 膦酸，

c）和/或其药学上可接受的衍生物和/或盐。

最优选的护理标准（SoC）包括：

a）亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林和/或其药学上可接受的衍生物和/或盐，

以及

b）唑来膦酸和/或其药学上可接受的衍生物和/或盐。

αv整联蛋白是参与细胞存活、增殖、迁移和血管发生的细胞粘附分子；它们在多种 癌症类型（包括前列腺癌）中失调(Legate KR,等人 Nat Rev Mol Cell Biol 2006;7:20– 31; Guise TA,等人 Clin Cancer Res 2006;12:6213s–16s)。

Abituzumab，一种人源化单克隆IgG2抗体，抑制在参与骨转移的去势抗性前列腺 癌（CRPC）细胞、肿瘤血管和破骨细胞上表达的αv-整联蛋白(Mitjans F,等人 J Cell Sci 1995;108:2825–38; Monnier Y, et al. Cancer Res 2008;68:7323–31). Abituzumab在 体内CRPC模型中证实了抗肿瘤活性，并且在先前用多西紫杉醇的mCRPC患者的I期研究 中耐受良好(Wirth M,等人 Eur Urol 2014;65:897–904)。

在一项随机、双盲、安慰剂对照、II期试验中，将总共180名患者1:1:1随机分组以 接受

a）护理标准（SoC），例如，用促黄体生成激素释放激素激动剂和双膦酸盐的连续治 疗，例如，用亮丙瑞林或醋酸亮丙瑞林和唑来膦酸（和/或其药学上可接受的衍生物和/或 盐）加安慰剂的连续，

b）如a）所述的SoC加abituzumab 750 mg，或

c）如a）所述的SoC加abituzumab 1,500 mg。

患者，直到发生骨或软组织病变中的rPD、骨骼事件、死亡或不可接受的毒性； 安慰剂组中后具有无症状或轻度症状的rPD的患者可以交换至abituzumab 1,500 mg （开放标签）。

采用abituzumab 1,500 mg的中位PFS适度长于abituzumab 750 mg或安慰剂：4.3 (95% CI:2.8-6.6)相比3.4 (95% CI:2.8-5.6)和3.3 (95% CI:2.8-4.8)个月；HR abituzumab 1,500 mg相比安慰剂:0.81 (95% CI:0.52-1.26)。接受abituzumab的患者比 接受安慰剂的患者经历骨进展的频率更低（23%的接受abituzumab的患者具有骨进展，相比 而言，42%的接受SoC的患者具有骨进展）。

用于血浆蛋白分析的血液取样被安排在前。对周期1中的前从150名患者 获取的样品进行血浆蛋白分析（基于高度蛋白特异性适体[SomaLogic系统]）。

同时测定的1,129个血浆蛋白水平的初始集合在数据水平上限于888种蛋白，以避 免由于血浆制备期间的细胞裂解或血小板活化引起的潜在偏差。使用不同的归一化程序、 数据集和生物标记物二分化阈值进行九个全局生物标记物搜索分析，其目的是过滤作为 Abituzumab成功的预测性生物标记物的特定蛋白。不同蛋白是否是预测性生物标记物 的判断基于根据（SoC或Abituzumab）和生物标记物水平（连续水平，以及使用研究的患 者体的中值作为阈值的二分化类别“高”和“低”）的结果（OS或PFS）的评价。对每种蛋白进 行统计测试以鉴定可以被认为是预测性的那些蛋白。统计学检验是现有技术并且包括在 内。在其它标准中，存在用于检测针对不同组（Abituzumab和SOC；阈值p <=0.05）的结 果的差异（这里为OS和/或PFS）的对于选定体，如例如生物标记物“高”和生物标记物“低” 体的对数轶检验，以及研究和连续标记物水平之间的相互作用效果的结果的独立性 （相互作用项p <= 0.05）的Cox回归模型。此外，对于“高”和“低”亚组，基于接受SOC的 患者组，使用对数轶检验（阈值p <= 0.05）评估标记物水平的预后。

所述特定蛋白包括核心蛋白聚糖（DCN），一种已知在TGF-β生物学中具有作用的蛋 白，如同一些被abituzumab抑制的αv整联蛋白一样(Munger JS, Sheppard D. Cold Spring Harb Perspect Biol 2011;3:a005017)。

此外，对其它标记物的生物学背景的分析表明，与abituzumab的已知分子相互作 用（骨代谢调节和血管生成）相关的标记物似乎在用abituzumab的中预示OS和/或PFS。

因此，令人惊讶地发现，每种鉴定的生物标记物血浆蛋白的血浆水平均是不良存 活预后，并且与单独的SoC相比，采用abituzumab预测了存活和/或无进展存活的增加。

因此，临床研究提供了关于abituzumab的药代动力学和免疫原性的数据，以及能 够进行搜索预测性生物标记物的分析，并且令人惊讶地提供体液中的特定预测蛋白水平， 特别是允许预测用至少一种泛αv整联蛋白抑制剂（优选包括泛αv整联蛋白抑制剂 abituzumab）下的结果的特定血浆蛋白水平。

Abituzumab是单克隆抗-αv抗体，在本文中也称为DI-17E6、DI17E6、EMR62242和/ 或EMD 525797。

DI17E6是针对α-v整联蛋白（受体）的经工程改造特别定制的IgG2杂合单克隆抗 体。采用该抗体的癌症减少与该类型的相关的副作用，首先是免疫反应，从而降低 免疫原性。所述抗体在WO 2009/010290中有详细描述，其公开内容整体并入本文。

其高变区（CDR）衍生自鼠mAb 17E6（EMD 73034）。这种亲本小鼠IgG1抗体描述于例 如Mitjans等人(1995; J.Cell Sci.108, 2825)和专利US 5,985,278和EP 719 859。小鼠 mAb 17E6由杂交瘤细胞系272-17E6产生并以登录号DSM ACC2160保藏。

其轻链结构域衍生自人源化单克隆抗EGFR抗体425 (马妥珠单抗(matuzumab))。 该抗体详细描述于例如EP 0 531 472B1中，并且衍生自其小鼠对应物425（小鼠MAb 425， ATCC HB9629）。该抗体针对人A431癌细胞系产生，并发现其结合人类表皮生长因子受体 （EGFR）的外部结构域上的多肽表位。马妥珠单抗已在临床试验中显示高效力。

通常，根据本发明使用的DI17E6包含：

(i) 衍生自小鼠单克隆抗αv整联蛋白抗体17E6的CDR轻链和重链区

(ii) 取自人源化单克隆抗EGFR抗体425的轻链框架区，

(iii) 衍生自小鼠单克隆抗αv整联蛋白抗体17E6的重链框架区，其任选地在特定位置 包含一个或多个氨基酸突变，和

(iv) 衍生自人IgG2的重链恒定区和人恒定κ轻链区，

其中在所述IgG2结构域中，IgG2铰链区被人IgG1铰链结构域替换，且；

其中任选地已进行IgG2内的一个或多个突变。

具体地，用于如所要求保护的和如上下文所述的临床试验中的DI17E6（命名 为“DI-17E6γ2h(N297Q)”或“EMD 525797”）具有以下氨基酸序列：

(i) 可变和恒定轻链序列(SEQ ID No. 1):

(ii) 可变和恒定重链序列(SEQ ID No. 2):

其中加下划线的序列代表具有CDR（粗体，与亲本小鼠抗体相同）的可变区。修饰的IgG1 铰链区由EPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID No. 3)代表，而AQ是IgG2结构域内的取代。

然而，如WO 2009/010290中所示，也可以根据本发明的教导使用DI17E6的变体。因 此，在以下重链框架区内包含一个或多个修饰的DI17E6变体

（其中一个或多个粗体和下划线的位置被突变）可用于所述前列腺癌患者。更详细 地，以下位置重链框架区在一个突变、多个或全部以下位置可以被突变：A9、E13、M20、K38、 R40、A72、S76、Q82、G85、T87、S91和S113。这些变体与由其上述序列定义的DI17E6相比显示 相同或非常相似的生物活性和功效。

一般而言，所述本发明还包括与未修饰的DI17E6在功能上和/或药学上相同或相 似的DI17E6抗体的修饰和变体，并且其中CDR区和重链和轻链可变区与DI17E6的各个可变 区相比 在其氨基酸序列中具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％同一性。此 外，本发明还包括与未修饰的DI17E6在功能上和/或药学上相同或相似的DI17E6抗体的修 饰和变体，并且其中恒定区与DI17E6的各个恒定区相比在其氨基酸序列上具有至少80％、 或至少85％、或至少90％、或至少98％同一性。抗体的IgG链的恒定区中的改变可以改善特 定性质，如免疫原性、ADCC等。

因此，根据本发明的用途，还可以采用DI17E6的功能性衍生物、生物活性变体或修 饰。

因此，在本发明的上下文中，术语“Abituzumab”和/或“DI17E6”优选还包括：

其生物活性变体或修饰，其包含CDR区和重链和轻链可变区，这些区与Abituzumab的可 变区相比在氨基酸序列上具有80％-95％同一性；

生物活性变体或修饰，其包含与Abituzumab的恒定区相比在氨基酸序列上具有至少 80％-98％同一性的恒定区；

在重链框架区内包含一个或多个修饰的抗体

其中一个或多个粗体和下划线位置被突变，并且不同于abituzumab的原始相应序列；

和/或

包含人IgG1恒定区而非人IgG2恒定区、或人IgG2铰链区而非人IgG1铰链区的修饰的 DI17E6抗体。

Intetumumab或CNTO-95是人单克隆抗体，其优选用于实体瘤。它还是抗αv整 联蛋白抗体，其优选地包含人重链和人轻链可变区，这些可变区包含分别如SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，如下所示：

和/或

基因座 ABN29020 119 aa 线性 PAT 07-FEB-2007

定义 来自专利US 7163681的序列7。

登录 ABN29020

版本 ABN29020.1 GI:125142205

DB源 登录ABN29020.1

关键词。

来源 未知。

生物 未知。

未分类的。

参考文献 1 (残基1至119)

作者 Giles-Komar,J., Snyder,L., Trikha,M.和Nakada,M.T.

标题 Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses

杂志 专利: US 7163681-A 7 16-JAN-2007;

Centocor, Inc.; Malvern, PA;

US;

评述 CAMBIA Patent Lens: US 7163681

特征 位置/限定符

来源 1..119

/生物="未知"

来源

1 qvqlvesggg vvqpgrsrrl scaasgftfs rytmhwvrqa pgkglewvav isfdgsnkyy

61 vdsvkgrfti srdnsently lqvnilraed tavyycarea rgsyafdiwg qgtmvtvss

//

基因座 ABN29021 108 aa 线性 PAT 07-FEB-2007

定义 来自专利US 7163681的序列8。

登录 ABN29021

版本 ABN29021.1 GI:125142207

DB源 登录ABN29021.1

关键词.

来源 未知。

生物 未知。

未分类的。

参考文献 1 (残基1至108)

作者 Giles-Komar,J., Snyder,L., Trikha,M. and Nakada,M.T.

标题 Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses

杂志 专利: US 7163681-A 8 16-JAN-2007;

Centocor, Inc.; Malvern, PA;

US;

评述 CAMBIA Patent Lens: US 7163681

特征 位置/限定符

来源 1..108

/生物="未知"

区域 2..107

/区域名称="IgV_L_kappa"

/注="免疫球蛋白(Ig)轻链，κ型，

可变(V)结构域; cd04980"

/db_xref="CDD:143181"

区域 8..100

/区域名称="IG_样"

/注="免疫球蛋白样; smart00410"

/db_xref="CDD:214653"

位点 顺序(12,104,106..107)

/位点_类型="其它"

/注="链内结构域界面"

/db_xref="CDD:143181"

位点 25..27

/位点_类型="其它"

/注="L1高变区"

/db_xref="CDD:143181"

位点 顺序(32,49,93)

/位点_类型="其它"

/注="抗原结合位点"

/db_xref="CDD:143181"

位点 顺序(34,36,38,43,46,50,87)

/位点_类型="其它"

/注="异二聚体界面[多肽结合]"

/db_xref="CDD:143181"

位点 66..70

/位点_类型="其它"

/注="L2高变区"

/db_xref="CDD:143181"

位点 顺序(92..94,96..98)

/位点_类型="其它"

/注="L3高变区"

/db_xref="CDD:143181"

来源

1 eivltqspat lslspgerat lscrasqsvs sylawyqqkp gqaprlliyd asnratgipa

61 rfsgsgsgtd ftltisslep edfavyycqq rsnwppftfg pgtkvdik

//

Intetumumab在WO02/12501和美国专利号7,163,681中进一步表征，所述专利的公开内 容通过引用整体并入本申请。

优选地，也可以在本发明中采用Intetumumab的功能性衍生物、生物活性变体或修 饰。

为了易于使用，优选在本发明的上下文中作为生物标记物有活性的一种或多种蛋 白，即

和/或

b) 一种或多种蛋白，其选自

也优选统称为本发明的“特定蛋白”或“所述特定蛋白”，

并且优选也个别称为“该特定蛋白”或“所述特定蛋白”。

如本文所使用，术语“序列同源性”是本领域技术人员所理解的，且用于确定序列 同源性的方法也是本领域已知的。

如本文所使用，优选使用BLAST算法测定序列同源性。BLAST优选代表基本局部比 对搜索工具，并且是用于比较初级生物学序列信息，诸如不同蛋白的氨基酸序列或DNA序列 的核苷酸的算法。BLAST搜索使得研究者能够将查询序列与序列的文库或数据库进行比较， 并且鉴定类似于高于特定阈值的查询序列的文库序列。BLAST算法和执行它的计算机程序 由美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Stephen Altschul、Warren Gish和David Lipman， 宾夕法尼亚州立大学的Webb Miller和亚利桑那大学的Gene Myers开发。它可以在NCBI网 站上获得。替代实施方式包括AB-BLAST（以前称为WU-BLAST）、FSA-BLAST（最后更新于2006 年）和ScalaBLAST。

根据查询序列可获得不同类型的BLAST。例如，发现小鼠中以前未知的基因之后， 科学家通常将进行人类基因组的BLAST搜索，以观察人类是否携带相似的基因；BLAST将基 于序列的相似性鉴定人类基因组中类似于小鼠基因的序列。BLAST算法和程序由NIH的 Stephen Altschul、Warren Gish、Webb Miller、Eugene Myers和David J. Lipman设计，并 于1990年在Journal of Molecular Biology上发表。

在本发明的上下文中，本文所述的蛋白的序列同源性优选基于使用BLASTp产生的 最长局部比对来测定。

在本发明的上下文中，个体，特别是人类个体优选也称为患者。

如本文所使用，关于数量、量、剂量、小时、时间、定时、持续时间等的术语“约”优选 理解为是指关于所述数量、量、剂量、小时、时间、定时、持续时间等的“大约”。更优选地，术 语“约”是指关于数量、量、剂量、小时、时间、定时、持续时间的给定具体值的+/- 10％，更优 选+/- 5％。

如果没有另外说明，以“mg”诸如500mg、1000mg等给出的施用于个体、人类个体或 患者的量优选地是指“平坦”施用的各自量，即作为不针对相应个体、人类个体或患者的体 重和/或体表调整的固定剂量。

如果没有明确指示，如本文所使用的例如关于化合物、试剂、癌症共剂、癌症 化疗剂等的数量的术语“一种或多种”优选是指“一种或多于一种”，因此优选包括“两种或 更多种”（或“两种或多于两种”）、 “三种或更多种”（或“三种或多于三种”）和/或“四种或更 多种”（或“四种或多于四种”）。因此，如本文所使用的术语“一种或多种”优选包括数字1、2、 3、4、5、6和/或更高数字。关于试剂、癌症共剂、癌症化疗剂的数量，其特别优选包括数 字1、2、3、4和/或5，甚至更优选数字1、2、3和/或4，特别是数字1、2和/或3。

优选地，本发明的特别优选的主题涉及方面、主题、用途、方法和/或实施方案，其 中在一个主题中组合本文所述的方面、主题、用途、方法和/或实施方案中的两个或更多个 的一个或多个特征。

下面借助于实施例更详细地解释本发明。本发明可以在整个要求保护的范围内进 行，并且不限于本文给出的实施例。

给出以下实施例以帮助本领域技术人员通过举例的方式更好地理解本发明。这些 实施例不旨在限制由权利要求书赋予的保护范围。对于在实施例中定义的化合物和用途举 例的特征、性质和优点可以归属于在实施例中没有具体描述和/或定义、但属于权利要求书 所定义范围内的其它化合物和用途。

实施例部分

实施例1

PERSEUS II期临床研究

c) 亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林和/或其药学上可接受的衍生物和/或盐，

以及

唑来膦酸和/或其药学上可接受的衍生物和/或盐，

PERSEUS II期临床研究

在这项随机、双盲、安慰剂对照、国际II期试验中，将总共180名患者1:1:1随机分组以 接受

a) 护理标准（SoC），例如，用促黄体生成激素释放激素激动剂、优选亮丙瑞林、醋酸亮 丙瑞林和/或其药学上可接受的衍生物和/或盐，以及双膦酸盐、优选唑来膦酸和/或其药学 上可接受的衍生物和/或盐加安慰剂的连续，

b) abituzumab 750 mg加SoC，或

c) abituzumab 1,500 mg加SoC。

药代动力学分析

•药代动力学分析亚组中每组包括相等数量的患者。

•在的第1、3、4、5、6和7周期的不同时间点安排血液取样用于药代动力学评估。

•根据标准的非房室方法使用程序KINETICATMv4.1.1(Innaphase)计算药代动力学参 数。

免疫原性

•在第1、3、5和6周期于给药前，以及在结束时的随访和安全性随访中，安排用于免 疫原性的血液取样。

•使用经验证的ELISA方法集中评价针对abituzumab的抗体的产生。

生物标记物分析

•收集存档的肿瘤块或穿刺活检材料以探索整联蛋白及其配体以及与血管生成和基础 疾病相关的蛋白的肿瘤表达及其与临床结果的潜在关系。

—样品的可用性必须在患者筛选时确认

—使用免疫组织化学进行分析。

•在前安排血液取样用于血浆蛋白分析。

•对周期1中的前从150名患者获取的样品进行血浆蛋白分析（基于高度蛋白特异 性适体[SomaLogic系统]）。

—同时测定的1,129个血浆蛋白水平的初始集合在数据水平上限于888种蛋白，以避免 由于血浆制备期间的细胞裂解或血小板活化引起的潜在偏差。

—使用不同的归一化程序、数据集和生物标记物二分化阈值进行九个全局生物标记物 搜索分析，其目的是基于独立于生物学注释的数据稳健性过滤生物标记物蛋白。搜索过程 包括一组标准，其确保所鉴定的蛋白对于具有低或高水平的患者与结果（这里是示例性放 射性PFS）显著（p <0.05）相关。这些检验尤其包括根据中位数阈值的生物标记物低和生物 标记物高的组中的Abituzumab的/未的患者的存活（这里为PFS）的差异的对数轶 检验，基于Cox回归模型的对连续标记物水平和之间的结果（这里为PFS ）的相互影响 的检验。

—该过程鉴定了15种生物标记物血浆蛋白：DCN(SomamerID:SL004081; UniProt ID: P07585)，

结果

生物标记物分析

•肿瘤样品的IHC分析迄今未发现任何相关的生物标记物。

•记录鉴定的14种生物标记物血浆蛋白为什么被判定为活性的且高于或低于中值的水 平是否被判定为预测性的详情显示于表1、表2和/或图1至24中的一个或多个中。

—生物标记物蛋白包括核心蛋白聚糖（DCN），一种已知在TGF-β生物学中具有作用的蛋 白，如同一些被abituzumab抑制的αv整联蛋白一样

—此外，对其它标记物的生物学背景的分析表明，与abituzumab的已知分子相互作用 （骨代谢调节和血管生成）相关的标记物似乎预测用abituzumab的OS。

•所鉴定的14种生物标记物血浆蛋白中的一些的血浆水平在良好或不良存活的SoC下 是预后的，并且与单独的SoC相比，所有14种预测用的存活增加。表1、表2和/或图1至24中的 一个或多个显示所鉴定的14种预测标记物蛋白（如例如TEK）对PFS的预后和预测值。

实施例2

蛋白质组亲和力测定方法

蛋白质组亲和测定的所有步骤均在室温下进行，除非另有说明。

样品解冻和铺板。

在-80℃下保存的100％血清或EDTA-血浆的等分试样通过在25℃水浴中温育10分 钟来解冻。解冻后，在混合期间和样品稀释之前将样品储存在冰上。通过轻柔涡旋（Vortex Genie, Scientific Industries上，设置＃4）8秒来混合样品。通过在4℃下将16μL解冻的 样品转移到每孔含有64 μL适当的样品稀释液的96孔板(Hybaid Omnitube 0.3 mL, ThermoFisher Scientific)中来制备20％样品溶液。用于血清的样品稀释液为含有0.6 mM MgCl₂、2 mM EGTA、2 μM Z-Block_2、0.05% Tween的0.8x SB17，用于EDTA-血浆的样品稀释 液为含有0.8 mM MgCl₂、2mM EGTA、2 μM Z-Block_2、0.05% Tween的0.8x SB18。将该板保 存在冰上，直到开始下一样品稀释步骤。

10％、1％和0.03％ SOMAmer溶液的制备。SOMAmers分组为三个独特的混合物。通 过用每种SOMAmer测定血清或血浆的稀释系列并鉴定给出信号的最大线性范围的样品稀释 度来经验地确定SOMAmer在混合物中的放置。SOMAmer的分离和与样品的不同稀释液（10％、 1％或0.03％）混合允许测定跨越蛋白浓度的10⁷-倍范围。由于这两种培养基的蛋白组成的 差异，预期血浆和血清之间的定制SOMAmer混合物的组成略有不同。制备用于10％、1％和 0.03％血清和血浆的定制储液SOMAmer溶液，并以8x浓度储存在SB17T中。对于每次测定运 行，将三种8x SOMAmer溶液分别1:4稀释到SB17T中以达到2x浓度。将每种稀释的SOMAmer主 混合物加热至95℃ 5分钟，然后37℃ 15分钟。将55μL每种2xSOMAmer混合物手动移液到96 孔板中，得到具有10％、1％或0.03％ SOMAmer混合物的三个板。与样品混合后，血清的最终 个体SOMAmer浓度范围为0.25-4nM，血浆的最终个体SOMAmer浓度范围为0.5nM。

平衡。通过使用Beckman Coulter Biomek Fx^P (Beckman Coulter)将20％样品1: 10稀释到SB17T中来制备2％样品板。通过将2％样品板1:31稀释到SB17T中来制备0.06％样 品板。然后通过将55μL样品加入55μL适当的2x SOMAmer混合物中，将三份样品稀释液转移 到它们各自的SOMAmer溶液中。用箔密封物(Microseal ‘F’ Foil, Bio-Rad)密封板，并在 37℃下温育3.5小时。

Catch-1微珠板的制备。将133.3μL SB17T中的7.5％链霉抗生物素蛋白-琼脂糖微 珠浆液加入三个预洗涤的0.45μm滤板的每个孔中。每孔的微珠用200μl SB17T洗涤一次，使 用真空过滤以除去洗涤液，然后重悬于200μl SB17T中。

Catch-1微珠捕获。除非另有说明，所有后续步骤均由Beckman Coulter Biomek Fx^P机器人进行。3.5小时平衡后，将100μL的10％、1％和0.03％平衡结合反应转移到它们各 自的Catch-1链霉抗生物素蛋白琼脂糖滤板上，并振荡温育10分钟。通过真空过滤除去未结 合的溶液。每组Catch-1微珠用190μL SB17T中的100μM生物素洗涤，然后用190mL SB17T洗 涤，使用真空过滤以除去洗涤液。将190 μL SB17T加入Catch-1板中的每个孔中并在25℃下 振荡温育10分钟。通过真空过滤除去洗涤液，并使用甲板上印迹站(on-deck blot station)将滤板的底部印迹以除去液滴。

蛋白的生物素化。将DMSO中的100 mM NHS-PEO4-生物素的等分试样在37℃下解冻 6分钟，并用pH 7.25的SB17T稀释至1mM。将100μL的NHSPEO4-生物素加入每个Catch-1滤板 的每个孔中，并振荡温育5分钟。通过将150μL SB17T中的20 mM甘氨酸加入含有NHS-PEO4- 生物素的Catch-1板中来猝灭每个生物素化反应。将板振荡温育1分钟，真空过滤，并向板中 的每个孔中加入190μL 20mM甘氨酸SB17T。将板温育一分钟，摇动，然后通过真空过滤除去。 将190μL SB17T加入每个孔中并通过真空过滤除去。随后将Catch-1板的孔通过加入190 μL SB17T洗涤三次，在振荡温育1分钟，随后真空过滤。在最后一次洗涤后，将板在1 mL深孔板 上以1000 rpm离心1分钟，以在洗脱之前除去外来体积。离心在甲板(deck)外进行。

动力学攻击和光-裂解。将85μL SB17T中的10mM硫酸葡聚糖加入滤板的每个孔中。 将滤板置于BlackRay光源下的Thermal Shaker (Eppendorf)上，并振荡照射10分钟。通过 每次以1000rpm离心1分钟，将光裂解溶液从每个Catch-1板依次洗脱到共同的深孔板中。

Catch-2微珠捕获。在整体中，将MyOne-链霉抗生物素蛋白C1微珠用等体积的20mM NaOH洗涤两次，每次5分钟，并用等体积的SB17T洗涤三次。将微珠重悬浮于SB17T中至10 mg/mL的浓度。重悬浮后，将50μL该溶液手动移液到96孔板的每个孔中，并在4℃下储存，直 至Catch-2。在Catch-2期间，通过磁性分离除去洗涤上清液。将所有光裂解的洗脱液移液到 MyOne磁珠上，并在25℃下振荡温育5分钟。通过磁性分离从MyOne微珠去除上清液，并将75 μL SB17T转移到每个孔中。将板在37℃下振荡混合1分钟，然后将75 μL 60％甘油（在SB17T 中）在37℃下转移到每个孔中。将板在37℃下再振荡混合一分钟。通过磁性分离除去洗涤 液。这些洗涤重复两次。在从MyOne珠中除去第三甘油洗涤液后，向每个孔中加入150 μL SB17T，并将板在37℃下振荡温育1分钟，然后通过磁性分离除去。在磁性分离之前，使用150 μL SB19T温育1分钟来最后一次洗涤MyOne微珠。

Catch-2微珠洗脱和中和。

通过将每个孔的微珠与105μL 100 mM CAPSO pH 10、1 M NaCl、0.05% Tween振荡 温育5分钟，从MyOne微珠洗脱SOMAmer。在磁性分离期间，将90μL每种洗脱物转移到含有10 μL of 500 mM HCl、500 mM HEPES、0.05% Tween-20、pH 7.5的新96孔板中。

杂交。将20μL每种中和的Catch-2洗脱液转移到新的96孔板，并将5μL含有杂交对 照(10 Cy3 SOMAmers)的10x掺料的10x Agilent Block (Oligo aCGH / ChIP-on-chip杂 交试剂盒，Large Volume，Agilent Technologies 5188-5380)加入每个孔中。从机器人取 出板后，将25 μL 2x Agilent杂交缓冲液(Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit, Agilent Technologies)手动移液到含有中和的样品和封闭缓冲液的板的每个孔中。 将40μL的该溶液手动移液到杂交衬垫载玻片(Hybridization Gasket Slide – 8个微阵 列/载玻片格式，Agilent Technologies)的每个“孔”中。根据制造商的方案将含有具有20x dT接头的与每个SOMAmer的40个核苷酸选择区域互补的每个阵列10个探针的定制Agilent 微阵列载玻片置于衬垫载玻片上。将每个组件(Hybridization Chamber Kit - SureHyb enabled, Agilent Technologies)紧紧夹住，并装载到杂交烘箱中，在60℃下以20 rpm旋 转19小时。

杂交后洗涤。将大约400 mL洗涤缓冲液1(Oligo aCGH/ChIP-on-chip洗涤缓冲液 1, Agilent Technologies)置于两个单独的玻璃染皿的每一个中。将十二个载玻片/衬 垫组件中的六个依次拆分成含有洗涤缓冲液1的第一染皿。

一旦拆分，将载玻片快速转移到含有洗涤缓冲液1的第二染皿中的载玻片架中。 将载玻片在洗涤缓冲液1中温育5分钟，同时通过磁力搅拌棒混合。然后将载玻片架转移到 37℃洗涤缓冲液2 (Oligo aCGH/ChIP-onchip洗涤缓冲液2，Agilent Technologies)中，并 使之在搅拌下温育5分钟。将载玻片架转移到含有乙腈的第四染皿中，并在搅拌下温育5 分钟。

微阵列成像。微阵列载玻片用微阵列扫描仪(Agilent G2565CA微阵列扫描仪系 统，Agilent Technologies)在Cy3通道中以5μm分辨率在100％PMT设置和在0.05下激活的 XRD选项下成像。使用具有GE1_105_Dec08方案的Agilent特征提取软件版本10.5.1.1处理 所得tiff图像。