一种诱导性多能干细胞、制备方法及应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种诱导性多能干细胞、制备方法及应用。

背景技术：

2.孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders，asd)是一组在儿童早期发病，以交互性的社交交流和社交互动的持续受损害，受限的、重复的行为、兴趣或活动模式为主要临床特征，并限制或损害了日常功能的严重神经发育障碍性疾病。asd的临床表现个体差异性非常明显，甚至在同一家系中也存在很明显的表型异质性。由于病人来源的体外神经细胞获得有限且体外原代培养生存时间短，目前多采用动物模型重现患者表型并进行致病机理研究，但转基因动物模型很难完整模拟每一种asd疾病的发生。例如，16p11.2微缺失综合征，一种再发性、致儿童精神发育异常的基因组微失衡，目前多采用16p11.2微缺失动物模型重现患者表型并进行致病机理研究，但动物模型无法复制16p11.2微缺失患者的16p11.2区域内另外一条链的遗传物质或区域外的遗传物质，故很难通过动物模型研究其表型异质性的遗传基础以及致病机理。
3.自1998年thomsrr js等建立了第一株人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hesc)以来，hesc就受到科学家们的青睐，成为了干细胞研究热点。esc是一种具有强大分化潜能的多能干细胞，理论上可以诱导分化为三胚层所有特定的组织细胞，为人类再生医学和细胞替代提供了不会枯竭的细胞来源，也是人类进行发育研究时很好的细胞模型，但其研究一直倍受伦理学争议。
4.2007年，诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,ipscs)技术的出现，避免了伦理学问题，为多能干细胞的研究带来了新的飞跃。随着ipscs技术研究的不断深入，以及ipscs模型在人类疾病的研究中取得重大进展，为探索神经发育异常疾病的发病机制和细胞的替代性带来了新的契机。然而，目前还没有关于利用ipscs研究16p11.2微缺失综合征的报道。

技术实现要素：

5.为了解决上述的技术问题，利用ipscs技术研究16p11.2微缺失综合征相关的治病机理、药物，以及相关遗传性孤独症的，提高患者的生活质量。
6.第一方面，本发明提供了一种诱导性多能干细胞(ipscs)，所述ipscs包括两个细胞株。一株为遗传性非孤独症的ips细胞株16p11.2-681m(homo sapiens)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年9月8日，保藏编号为cctcc no：c2021248。另一株为遗传性孤独症的ips细胞株16p11.2-681(homo sapiens)，已保藏中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年9月8日，保藏编号为cctcc no：c2021249。
7.上述两株细胞的供体细胞来源于16p11.2微缺失携带者的离体组织。
8.在本发明的一个实施例中，16p11.2微缺失携带者来自于同一个16p11.2微缺失携带者核心家系，先证者为一女孩，其与母亲均携带16p11.2微缺失。先证者典型表现为孤独症，而母亲仅有过早期良性癫痫，证实16p11.2微缺失不仅在家庭间存在表型异质性，同时在同一家庭内也存在表型异质性。
9.优选地，所述的离体组织包括皮肤、毛发、牙组织、脐带、脐带血、外周血等。进一步优选地，所述离体组织为16p11.2微缺失携带者的外周血。选用外周血的优点是外周血无侵入性且容易获得。
10.优选地，所述ipscs中，在16p11.2区域内基因包括(smg1p2、spn、qprt、c16orf54、zg16、kif22、maz、prrt2、pagr1、mvp、cdipt、cdiptosp、sez6l2、asphd1、kctd13、tmem219、taok2、hirip3、ino80e、doc2a、c16orf92、tlcd3b、aldoa、ppp4c、tbx6、ypel3、gdpd3、mapk3、coro1a)，相较于非16p11.2微缺失携带者，这些基因在16p11.2微缺失携带者中的表达均降低，也证明了16p11.2微缺失的剂量效应。
11.经过进一步研究，发明人发现16p11.2区域内剩余单体型，由于存在一些启动子或增强子区域的变异，比如prrt2和mapk3基因的变异，可影响该基因的表达水平、下游磷酸化水平以及相应电生理改变，这些都成为16p11.2微缺失携带者出现孤独症、神经发育障碍的基础。
12.第二方面，本发明提供第一方面所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
13.供体细胞株的获取；
14.诱导性多能干细胞的构建和鉴定；以及
15.诱导性多能干细胞的培养。
16.优选地，所述供体细胞株来源于16p11.2微缺失携带者的离体组织。进一步优选地，所述的离体组织包括皮肤、毛发、牙组织、脐带、脐带血、外周血等。更优选地，所述离体组织为16p11.2微缺失携带者的外周血。
17.在本发明的一个实施例中，供体细胞株从16p11.2微缺失携带者外周血单核细胞诱导分化而来。血液样品采集就诊于首都儿科研究所遗传研究室的两位16p11.2微缺失携带者，两位16p11.2微缺失携带者为母女关系。
18.优选地，从按照上述方法制备的ipscs中选出性能优良的两株，经过鉴定后保藏于中国典型培养物保藏中心，其中一株为遗传性非孤独症的ips细胞株16p11.2-681m(homo sapiens)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年9月8日，保藏编号为cctcc no：c2021248。另一株为遗传性孤独症的ips细胞株16p11.2-681(homo sapiens)，已保藏中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年9月8日，保藏编号为cctcc no：c2021249。
19.优选地，诱导性多能干细胞的构建包括以下子步骤：
20.(1)分离培养外周血中的单个核细胞(pbmc)。
21.(2)转染。转染方式可采用逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或转座子介导中的任意一种，优选采用慢病毒进行选自慢病毒转染。
22.(3)采用pbmc培养基换液培养，去除病毒。
23.(4)将经过(3)处理的细胞接种到饲养层细胞上，进行培养。
24.(5)采用ipsc培养基诱导细胞。
25.(6)采用mtesr培养基培养诱导后的克隆，建立ipscs。
26.优选地，诱导性多能干细胞的鉴定包括以下子步骤：
27.(1)ipscs细胞形态学观察。构建好的ipscs呈集落样生长，克隆为扁平的岛状，具有清晰的边缘，稍微高于周边，内部细胞核质比高，核仁明显，排列紧密。
28.(2)碱性磷酸酶(ap)染。
29.(3)采用免疫荧光技术检测ipscs多能性。优选地，ipscs多能性抗体为oct4、sox2、ssea4和tra181。
30.(4)ipscs基因组稳定性检测。优选地，采用核型分析、全基因组芯片检测、str位点分析中的至少一种验证ipscs基因组稳定性。
31.优选地，ipscs的培养包括以下子步骤：
32.(1)基质胶matrigel的分装和包被。
33.(2)ipscs的复苏。
34.(3)ipscs的传代培养。
35.(4)ipscs的冻存。
36.第三方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括以下细胞中的至少一种：
①
保藏编号为cctcc no：c2021248的遗传性非孤独症的ips细胞株16p11.2-681m(homo sapiens)，
②
由16p11.2-681m诱导分化获得的细胞，
③
保藏编号为cctcc no：c2021249的遗传性孤独症的ips细胞株16p11.2-681(homo sapiens)，
④
由16p11.2-681诱导分化获得的细胞。
37.优选地，所述组合物还可以包括健康人的细胞。所述健康人的细胞是指在对16p11.2微缺失综合征相关的遗传孤独症进行鉴别时的对照细胞。
38.优选地，所述组合物为药物组合物，进一步优选所述药物组合物为注射剂、微针剂或滴剂中的任意一种。
39.更优选地，所述药物组合物可选的包括药物辅料，进一步优选地，所述辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或缓冲剂等。
40.第四方面，本发明提供遗传性非孤独症的ips细胞株16p11.2-681m(homo sapiens)，或者遗传性孤独症的ips细胞株16p11.2-681(homo sapiens)的应用。
41.优选地，所述的应用选自：16p11.2微缺失综合征疾病模型构建、16p11.2微缺失综合征致病机理的研究、16p11.2微缺失综合征药物的筛选中的至少一种。
42.第五方面，本发明提供ips细胞株16p11.2-681m(homo sapiens)或者ips细胞株16p11.2-681(homo sapiens)在制备16p11.2微缺失综合征相关的疾病的药物中的应用。
43.第六方面，本发明提供ips细胞株16p11.2-681m(homo sapiens)或者ips细胞株16p11.2-681(homo sapiens)在细胞移植、器官再生中的应用。
44.第七方面，本发明提供一种与16p11.2微缺失综合征相关的产品，其包括下列内容中的至少一项：
45.遗传性非孤独症的ips细胞株16p11.2-681m(homo sapiens)、由16p11.2-681m诱导分化形成的细胞、由16p11.2-681m制备的药物、遗传性孤独症的ips细胞株16p11.2-681
(homo sapiens)、由16p11.2-681诱导分化形成的细胞、或者由16p11.2-681制备的药物。
46.本发明的有益效果：
47.一、本发明将16p11.2微缺失携带者的离体组织细胞诱导培养为ipscs，进一步可诱导成患者大脑皮层的特定神经前体细胞，为探索神经发育异常疾病的发病机制、药物筛选等提供了良好的细胞模型。
48.二、16p11.2微缺失ipscs的建立解决了患者体外神经细胞获得难且体外原代培养生存时间短的问题。为罕见病患者样本的获取提供了一种新的思路，并且避免了伦理学的争议。
49.三、由于ipscs的细胞供体为16p11.2微缺陷患者，保留了患者原本全套基因组结构，可以早期、客观地评价患者特有的神经细胞的特点及神经元的形态和功能，进而解释患者精神心理发育异常的生理结构基础，为研究复杂的精神类遗传性疾病提供了重要的技术支持。
附图说明
50.图1为本发明ipscs细胞系建立方法的操作流程示意图；
51.图2为本发明ipscs细胞克隆形态学鉴定结果，(a)为白光，(b)为ap染；
52.图3为本发明ipscs表面标志物的免疫荧光检测结果；
53.图4是本发明ipscs细胞系的染体核型检测结果；
54.图5为本发明16p11.2微缺失ipscs细胞的全基因组芯片分析结果；
55.图6为正常人ipscs细胞的全基因组芯片分析结果；
56.图7为本发明ipscs体外分化能力鉴定结果。
具体实施方式
57.下面结合说明书附图和具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。如无特殊说明，均为常规方法。除非另行定义，文中所用的专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
58.实施例1诱导性多能干细胞(ipscs)的构建及鉴定
59.1.1、供体细胞株的获取
60.细胞供体为就诊于首都儿科研究所遗传研究室的16p11.2微缺失携带者母女，已经完成遗传学诊断。采集患者血液样品用于后续操作。
61.1.1.1、诱导性多能干细胞的构建
62.1.1.1.1、分离培养外周血中的单个核细胞(pbmc)。
63.(1)先取4mledta抗凝的外周血于15ml离心管中，然后加入4ml的pbs稀释混合。再将加有4ml淋巴细胞分离液(lymphoprep【stem cell】)的15ml离心管倾斜45
°
，沿管壁缓缓加入稀释后的外周血，可见稀释血液和淋巴分离液明显分层。
64.(2)将(1)得到的液体在25℃、750g下水平离心30min。离心后管内从下到上分为三层细胞：红细胞和粒细胞、淋巴细胞分离液、血浆和pbs。在中层和上层液面处有以单个核细胞为主的白云雾状窄层。
65.(3)用1ml移液器头吸出白膜层放入新的15ml离心管，并加入五倍以上体积的pbs至总液体为12ml，清洗细胞，350g离心10min，重复离心一次。
66.(4)将(3)分离得到的pbmc用pbmc完全培养基重悬，接种于12孔板中，每孔加2ml pbmc培养基，培养14天，每天观察，隔天换液。其中的pbmc培养基配方如表1所示：
67.表1
[0068][0069][0070]
1.1.1.2、病毒转染
[0071]
(1)取经过1.1.1.1分离的pbmc细胞1.5
×
106cells/ml，于300g下离心5min，弃去上清，用2ml pbmc培养基重悬，然后取10μl细胞悬液，用细胞自动计数仪器计数。按照转染细胞密度为2.5
×
105个/ml，取重悬细胞加入15ml离心管中，然后加入pbmc培养基补足液体至200μl。
[0072]
(2)从冰盒中取出已分装好的含有转录因子的病毒(cytotune 2.0 sendai virus)，37℃水浴锅热激5s，在上述离心管中加入26μl的病毒(其中含有kos的10μl，含有hc-myc的10μl，含有hk1f4的6μl)。
[0073]
(3)用200μl pbmc培养基润湿24孔板，转移上述液体200μl至24孔板，然后用200μlpbmc培养液洗上述离心管后转移至24孔板。再用parafilm laboratory film封住24孔板，室温条件下2250rpm离心90min。离心后加入200μlpbmc培养基，放入37℃，5％co2的培养箱中培养24h。
[0074]
1.1.1.3、诱导性多能干细胞的诱导
[0075]
(1)取完成病毒感染后的24孔板，用pbmc培养基培养24h后换液，然后继续培养48h，去除病毒。
[0076]
(2)准备mef培养基，明胶包被培养皿，复苏feeder(灭活的mef细胞)，
[0077]
mef培养基配方如表2所示。
[0078]
表2
[0079][0080]
(3)将(1)培养得到的细胞接种到feeder上，使用pbmc培养基继续培养细胞24h，并保持培养皿不移动。
[0081]
(4)用ipsc培养基每天换液，观察克隆生长情况。ipsc培养基配方如表3所示。
[0082]
表3
[0083][0084]
(5)当观察到的克隆大小合适时，将克隆转移至新培养皿，用mtesr培养基每天换液，继续培养。
[0085]
1.1.2、诱导性多能干细胞(ipscs)的鉴定
[0086]
1.1.2.1、ipsc细胞形态学:
[0087]
经过步骤1.1.1培养后的细胞呈集落样生长，克隆为扁平的岛状，具有清晰的边缘，稍微高于周边，内部细胞核质比高，核仁明显，排列紧密，与人胚胎干细胞形态特征相似。
[0088]
1.1.2.2、碱性磷酸酶(ap)染
[0089]
(1)ipsc细胞传代后2-3天，吸弃细胞培养液，然后用d-pbs润洗2遍。
[0090]
(2)用4％多聚甲醛固定1min后吸去多余多聚甲醛，然后用d-pbs清洗两遍。
[0091]
(3)吸去d-pbs，加入新的d-pbs，碱性磷酸酶试剂a和试剂b各滴入一滴。室温避光放置20min。吸去染试剂，用d-pbs润洗1遍，加入1ml d-pbs溶液，倒置显微镜下观察并拍照，结果见图2。
[0092]
图2结果表明多能干细胞集落经ap染呈紫红，为ap染阳性，说明多能干细胞克隆具有较高的碱性磷酸酶活性，细胞处于未分化状态。
[0093]
1.1.2.3、ipsc多能性检测
[0094]
利用免疫荧光技术检测ipsc多能性。ipsc多能性抗体选取为oct4、sox2、ssea4和tra181。具体步骤如下：
[0095]
(1)ipsc细胞传代后2-3天，吸弃培养基，然后每孔加4％的多聚甲醛0.5ml，室温固定20min。
[0096]
(2)吸弃多聚甲醛后，使用dpbs缓慢清洗细胞3遍，每次10min。
[0097]
(3)透膜：胞内和核内染用0.5％triton-x-100透膜30min(细胞膜抗原ssea-4不透膜)。
[0098]
(4)封闭：dpbs缓慢润洗3遍，每次10min，加入2％fbs-pbs液，室温封闭30min。
[0099]
(5)一抗孵育：每孔加入对应一抗后，4℃孵育过夜，其中抗体稀释比例为oct4(1:100)、sox2(1:100)、ssea4(1:100)、tra181(1:100)。
[0100]
(6)二抗孵育：吸弃一抗，d-pbs清洗细胞3遍，每次10min，再加荧光二抗(1:500)，室温避光染1小时。
[0101]
(7)dapi染：吸弃二抗，dpbs清洗细胞3次，每次10min，加入终浓度为1μg/ml的dapi染10min，dpbs清洗5min。加入适量d-pbs后激光共聚焦显微镜观察细胞并拍照，结果见图3。
[0102]
图3结果表明多能干细胞系具有多能性，从上到下依次为ips细胞表面标记物鉴定抗体oct4、ssea4、sox2、tral81进行免疫荧光检测示意图。
[0103]
1.1.2.4、ipsc基因组稳定性检测
[0104]
利用核型分析、全基因组芯片检测、str位点分析验证ipsc基因组稳定性检测，具体步骤如下：
[0105]
(1)采用35mm培养皿对ips细胞培养3～4天，然后换新鲜的培养液，加入0.25μg/ml秋水仙素，置于37℃，5％co2的培养箱3～4h。
[0106]
(2)按照1.1.3.4(3)的方法培养细胞，当克隆大小合适时，收集细胞至15ml离心管，1100rpm离心4min。
[0107]
(3)吸弃上清，然后用吸管滴加3滴预热至37℃的新鲜低渗液(0.4％kcl与0.4％柠檬酸钠1:1配制)，以气泡吹散沉淀，再将低渗液加至1ml，气泡吹匀后，置于37℃水浴锅5min。
[0108]
(4)低渗处理后加入7滴新鲜固定液(甲醇与冰醋酸3:1配制)，气泡混匀后，在1000rpm下离心4min。
[0109]
(5)吸弃上清，加入4ml固定液，气泡吹匀，室温静置40min后，在1200rpm下离心4min。
[0110]
(6)吸弃上清，加入2ml固定液，气泡吹匀，室温静置20min后，在1200rpm下离心4min。
[0111]
(7)吸弃上清，加入几滴固定液。气泡吹匀后，滴加在预冷至4℃的玻片上，然后将玻片在酒精灯外焰迅速移动几次，再将玻片置于65℃烘箱内8h以上。
[0112]
(8)用0.25％胰酶消化7～10s，然后立刻浸泡在清水中两次后，放入10％吉姆萨染液中染10～15min，然后用慢速流水从一侧清洗玻片，再放入65℃烘箱干燥。
[0113]
(9)采用laica染体分析仪观察至少20个分裂相，结果见图4。
[0114]
图4结果表明，ipsc传代超过10代后，所有ipsc均显示出正常的核型，没有染体畸变，ipsc遗传稳定。
[0115]
1.1.2.5、全基因组芯片(agilent4
×
180kb/agilent8
×
60kb定制芯片)的制备：
[0116]
(1)准备dna
[0117]
使用试剂盒从培养的ips细胞中提取、纯化dna，取0.2mlpcr管，做好标记，每个待测样本取1000ng/500ngdna，加无核酶水至20.2μl/10.1μl。然后根据待测样本的性别选择相同性别的对照dna，分别取1000ng/500ng，加无核酶水至20.2μl/10.1μl。
[0118]
(2)消化dna
[0119]
向(1)中每个pcr管内，加5.8μl/2.9μl的dna消化液。吹打混匀，短暂离心。然后将pcr管放入pcr仪内孵育，条件：37℃，2h；65℃，20min；4℃，hold。孵育结束后，每个样品取2μl pcr产物，用0.8％琼脂糖凝胶电泳明确消化情况。
[0120]
其中dna消化液的配方如表4所示。
[0121]
表4
[0122][0123][0124]
(3)dna加标签
[0125]
将每个pcr产物短暂离心，然后每个样品pcr管中加2.5μl随机引物，混匀。将pcr样品放入pcr仪内孵育，条件为：95℃，3min；4℃，hold，孵育结束，每个样品管加入标签液21μl/11.5μl，混匀后，pcr仪孵育，条件为37℃，2h；65℃，10min；4℃，hold。然后清洗加标签的dna，pcr产物短暂离心后，分别转移至标记好的1.5ml离心管内。然后向每个离心管内加入430μl1
×
te(ph8.0)，吹打混匀。再将每管转移至标记好的2ml离心管的离心柱内。在4000
×
g下离心10min。弃去下液，将离心柱放回离心管内，往各离心柱内加480μl1
×
te(ph8.0)。在14000
×
g下离心10min，弃去下层离心液，将各离心柱倒置在新的2ml收集管内。在1000
×
g下离心1min。然后将溶液放在冰上孵育5min，用移液器上下吹打10次，将各样本与其相对应的对照加标签的dna转移至同一个新的1.5ml离心管。
[0126]
上述标签液配方如表5所示。其中对照样本加cyanine3-dutp，待测样本加cyanine5-dutp。
[0127]
表5
[0128][0129]
(4)杂交前准备
[0130]
向(3)中的每个加标签的1.5ml的离心管内分别加66μl/29μl杂交液，上下吹打混匀。然后转移至0.2mlpcr管内，pcr仪孵育：95℃，3min；37℃，30min。杂交液的配方如表6所示。
[0131]
表6
[0132][0133]
(5)杂交
[0134]
将agilent4
×
180kb/agilent8
×
60kb芯片取出，平放在实验台上。然后将pcr孵育后的溶液按照110μl/45μl加至芯片中间，盖上盖玻片，避免气泡产生，摇晃芯片，使液体覆盖整个芯片，把芯片放在杂交炉内杂交，65℃，20rpm
×
24h。
[0135]
(6)清洗芯片
[0136]
准备好3个染缸、1个500ml的玻璃瓶、washbuffer1、washbuffer2、蒸馏水。然后用自来水清洗3个染缸，后用蒸馏水清洗3个染缸。向玻璃瓶内加入约500ml washbuffer2，然后将染缸ⅲ和玻璃瓶放在37℃培养箱孵育过夜，使用前取出。将经过(5)杂交后的芯片取出，芯片垫圈面朝下，芯片编号面朝上，将其浸润于洗缸ⅰ中，用镊子将垫圈与芯片分离，将芯片放入装有芯片架的500ml washbuffer1的洗缸ⅱ中，在磁力搅拌下，清洗5min。然后将装有芯片的芯片架移入装有500ml washbuffer2的染缸ⅲ中，磁力搅拌下清洗1min。最后将装有芯片的芯片架取出，放置于无尘纸上晾干。晾干后置于专用芯片夹内，待扫描。
[0137]
(7)扫描芯片并分析数据
[0138]
采用scan array 4000扫描芯片，并用feature extraction v9.5进行数据提取，然后采用dna analystic 5.0软件进行全基因组cnvs分析，分析结果见图5和图6。
[0139]
图5和图6对比的结果表明16p11.2微缺失携带者ipscs携带16p11.2微缺失，正常人未携带基因拷贝数变异。
[0140]
(8)str验证
[0141]
使用试剂盒从培养的ips细胞中提取、纯化的dna，然后将提取的dna送上海天昊科技有限公司完成检测，检测的位点包括：d3s1358，d13s317，d16s539，d18s51，d2s1338，csf1po，th01，vwa，d21s11，d7s820，d5s818，tpox，d8s1179，d19s433，fga。str验证结果表明ipsc均来源于其对应的pbmc，验证了ipsc的基因组稳定性，此外证明无细胞交叉污染。
[0142]
1.1.2.6、畸胎瘤形成实验:
[0143]
(1)将培养的ips细胞用dispase消化液消化处理，然后收集于15ml离心管中，常温离心(1000rpm，3min)，弃掉上清，用350μl dpbs重悬，1ml注射器吸取放置于冰上。
[0144]
(2)将细胞沉淀注射于裸鼠腹股沟皮下，完成标记。
[0145]
(3)裸鼠培养6～8周后在细胞沉淀注射处可观察到包块，待包块生长到足够大小时将裸鼠处死，利用眼科剪和镊子分离出包块，并将其浸泡至4％甲醛溶液中。
[0146]
(4)对包块完成石蜡包埋与切片，随后完成苏木精-伊红(h&e)染。
[0147]
(5)在倒置显微镜下观察he染结果，到内中外三个胚层对应的的组织结构，拍照，结果见图7。
[0148]
图7的结果显示将人多能干细胞直接注射到小鼠中可直接形成具有血管组织的复杂结构，从上到下为内胚层、中胚层和外胚层，也是鉴定干细胞多能性的黄金标准。
[0149]
1.1.3、诱导性多能干细胞的培养：
[0150]
1.1.3.1、配制ipscs培养相关的试剂
[0151]
配制ipscs培养的mtesr培养基、relesr
tm
消化液(产品货号05872)、冻存液、matrigel工作液、dpbs、dmem/f12等，然后将各种液体试剂放置于室温。各试剂配方如下：
[0152]
mtesr培养基(50ml)：49ml mtesr basal medium+1ml mtesr 5xsupplement；冻存液：90％ksr+10％dmso；matrigel工作液(10ml)：10mldmem/f12+10μl matrigel。
[0153]
1.1.3.2、基质胶matrigel的分装和包被：
[0154]
先将matrigel原液于4℃下过夜解冻，然后用预冷至-20℃的200μl头将matrigel原液分装至预冷至-20℃的600μlep管中，-20℃保存。然后按照表7的方式包被培养皿，将培养皿置于4℃下保存。
[0155]
表7
[0156][0157]
1.1.3.3、ipscs的复苏：
[0158]
(1)将上述包被的培养皿置于37℃下孵育1h以上，然后吸弃matrigel，加入适量的含y27632的mtesr培养基(1μl y27632/2ml mtesr)，备用。
[0159]
(2)取出液氮中保存的ipscs，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻旋转冻存管加速其溶化，并避免液面浸没管盖以上，当解冻至只剩下一个小冰晶时取出，用75％酒精消毒后放入通风柜中。缓慢吸取解冻细胞，沿管壁缓慢滴入装有4.5mldmem/f12的15ml离心管中，缓慢上下吹打混匀。
[0160]
(3)将(2)中的离心管在室温下，1000rpm，离心5min，弃上清后用(1)制备的含y27632的mtesr培养基重悬细胞，吹吸均匀后加入培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
[0161]
1.1.3.4、ipscs的培养：
[0162]
(1)在ipscs复苏传代的第二天，用显微镜观察细胞，吸弃全部培养基，用dmem/f12清洗，吸弃清洗液后加入新鲜的mtesr培养基，继续培养，每天观察、换液。
[0163]
(2)在显微镜下观察ipscs生长情况，细胞密度为70％～90％时可以传代，如遇分化情况，需要手动去除。
[0164]
(3)取待传代的细胞培养皿，吸弃原培养基后，用dpbs轻轻洗一遍，加入relesr
tm
消化液(产品货号05872)1ml，停留50s后吸出，留100μl左右薄膜层，37℃消化5～7min，添加1ml mtesr培养基终止消化，轻轻拍打培养皿30-60s，待克隆团散成合适大小，收集集落，加入含y27632的mtesr培养基的新培养皿中，混匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养。第二天镜下观察细胞，全量换液，按照常规进行细胞日常维护。
[0165]
1.1.3.5、ipscs的冻存：
[0166]
在显微镜下观察ipscs生长情况，当细胞密度为70％～90％时，取待传代的细胞培养皿，吸弃原培养基后，用dpbs轻轻洗一遍，加入relesr
tm
消化液(产品货号05872)1ml，停留50s后吸出，留100μl左右薄膜层，37℃消化5～7min，添加1ml mtesr培养基终止消化，轻轻拍打培养皿30-60s，待克隆团散成合适大小，收集集落于15ml离心管中，200g离心2min，吸弃上清，用冻存液重悬细胞并移入冻存管中，将装有细胞的冻存管置于程序降温盒中，于4℃下放置30min，再于-80℃下冷冻过夜后转入液氮保存。
[0167]
从上述冻存的ipscs中选取性能优良的两株，保藏于中国典型培养物保藏中心。其中一株为遗传性非孤独症的ips细胞株16p11.2-681m(homo sapiens)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年9月8日，保藏编号为cctcc no：c2021248。另一株为遗传性孤独症的ips细胞株16p11.2-681(homo sapiens)，已保藏中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年9月8日，保藏编号为cctcc no：c2021249。
[0168]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种诱导性多能干细胞，其特征在于：所述的诱导性多能干细胞为遗传性非孤独症的ips细胞株16p11.2-681m(homo sapiens)，保藏编号为cctcc no：c2021248，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年9月8日。2.一种诱导性多能干细胞，其特征在于：所述的诱导性多能干细胞为遗传性孤独症的ips细胞株16p11.2-681(homo sapiens)，保藏编号为cctcc no：c2021249，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年9月8日。3.权利要求1或权利要求2所述的诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：供体细胞株的获取；诱导性多能干细胞的构建和鉴定；以及诱导性多能干细胞的培养。4.一种组合物，其特征在于：所述组合物包括：权利要求1所述的诱导性多能干细胞或由其诱导分化获得的细胞；和/或权利要求2所述的诱导性多能干细胞或由其诱导分化获得的细胞。5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括健康人细胞，所述的健康人细胞用做鉴定16p11.2微缺失综合征的阴性对照。6.权利要求1或权利要求2所述的诱导性多能干细胞的应用，其特征在于：所述的应用选自：16p11.2微缺失综合征疾病模型构建；16p11.2微缺失综合征致病机理的研究；16p11.2微缺失综合征药物的筛选。7.权利要求1或权利要求2所述的诱导性多能干细胞在制备16p11.2微缺失综合征相关的疾病的药物中的应用。8.权利要求1或权利要求2所述的诱导性多能干细胞在细胞移植、器官再生中的应用。

技术总结

本发明公开了一种诱导性多能干细胞、制备方法及应用。该iPSCs包括两个细胞株，分别为保藏编号为CCTCC NO：C2021248的遗传性非孤独症的iPS细胞株16p11.2-681M(Homo sapiens)，和保藏编号为CCTCC NO：C2021249的遗传性孤独症的iPS细胞株16p11.2-681(Homo sapiens)。本发明中的iPSCs保留了患者原本全套基因组结构，能早期、客观地评价患者特有的神经细胞的特点及神经元的形态和功能。该iPSCs的建立解决了患者体外神经细胞获得难且体外原代培养生存时间短的问题，为探索神经发育异常疾病的发病机制、药物筛选等提供了良好的细胞模型。药物筛选等提供了良好的细胞模型。药物筛选等提供了良好的细胞模型。