同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物及其应用。

背景技术：

2.血流感染是指各种病原微生物通过各种途径入侵血液循环，在血液中繁殖并释放毒素和代谢产物，诱导细胞因子释放，从而引起的全身感染和炎症反应；进一步可能导致血压下降、凝血能力和纤溶系统的改变，出现脓毒症，表现为骤发寒战、高热、心动过速、皮疹、肝脾肿大以及精神神志改变等一系列临床症状，严重者可引起休克、弥漫性血管内凝血和多器官功能衰竭，甚至导致死亡。
3.近些年来，由于介入技术广泛开展，广谱抗菌药物、激素以及免疫抑制剂的广泛使用，血流感染呈现出发生率逐年上升、病原菌构成种类不断变化以及耐药性不断增强的趋势。血流感染在全球范围内发病率约为113-204例/10万，其发病率与中风和静脉血栓发病率接近，其主要病原菌类型包括大肠埃希菌(escherichia coli)、金黄葡萄球菌(staphyloccocus aureus)、克雷伯菌属细菌(klebsiella)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、肠球菌属细菌(enterococcus)、沙门菌属细菌(salmonella)、链球菌属细菌(streptococcus)以及凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negative staphylococcus)。
4.在许多研究中，大肠埃希菌是血流感染检出率最高的病原体，金黄葡萄球菌和铜绿假单胞菌检出率仅次之，上述三种病原体是导致血流感染患者死亡的三大病原菌。社区获得性感染和医院获得性感染的病原体组成存在一定的差别，其中，铜绿假单胞菌和凝固酶阴性葡萄球菌常与医院获得性感染相关，而在社区获得性感染的病例中，大肠埃希菌、肺炎链球菌以及其他链球菌属细菌则较为常见。在大多数经济落后资源匮乏的地区，沙门菌属细菌则成为了血流感染的主要病原菌，在一些研究中，沙门菌属细菌的检出率可达50％以上，检出率显著高于高收入国家；特别是在非洲一些国家，沙门菌属细菌引起的儿童血流感染发病率可能高达4000例/10万人，甚至高于疟疾的发病率。
5.在早期的国际人队列比较中，金黄葡萄球菌引起的血流感染发病率为20-30例/10万人，且没有明确的证据表明发病率随时间的推移而显著增加。但近期的一些研究发现，老年人中金黄葡萄球菌感染的发病率出现了一定程度的增长，不仅预后较差，复发率为5％-10％，且死亡率较高。在一项大于2000例病例的大型多中心研究中，30天内病例病死率高达21％。另外一项包含1851名病例的研究中，病死率则出现了23％-39％的波动，研究发现这些差异与年龄、是否为医院获得性感染及是否有并发症等一系列因素有关。研究发现各种高毒力基因型金黄葡萄球菌与其高致死率风险相关度极高，例如较为常见的多位点序列克隆复合物cc8型与转移性并发症以及高失败率存在较强的关联性，cc22型较cc30会导致更高的病死率。
6.作为重症监护室患者常见并发症，念珠菌引起的血流感染病例与日俱增，占临床血液检测阳性病例的4.5％，虽然医院感染管理以及抗真菌水平日渐提高，但念珠菌血
症的病死率依旧保持在30％左右，显著高于细菌性血流感染的病死率。念珠菌血症病死率高主要和患者健康状态有关，例如糖尿病、中性粒细胞减少或严重的全身性基础疾病等因素。对于老年人体，高龄是老年人死亡的主要危险因素。另外，致病性念珠菌种类会随着时间的推移而发生变化，尤其是由非白念珠菌引起的念珠菌血症，包括热带念珠菌、近平滑念珠菌以及光滑念珠菌等呈现增加的趋势，因此抗真菌也应进行调整与改进。
7.凝固酶阴性葡萄球菌是血培养最常见的分离菌，是血流感染的重要病原菌之一，但是由于其属于皮肤表面的常见定植菌，通常会被污染导致凝固酶阴性葡萄球菌的血培养阳性结果，并不能完全表征血流感染患者的真实病原。常规实验室检测方法均无法有效区分凝固酶阴性葡萄球菌是来自污染还是菌血症，一般情况下，只有通过2个部位或以上的血培养阳性才能进行相对有效的判断。
8.目前，血培养方法依然是诊断血流感染的金标准，它易于操作，在血培养报阳性结果后，可以采用生化鉴定和16s rrna/18s rrna基因测序进行菌种鉴定。但血培养存在阳性检出率低和检测时间长的缺点，已经无法满足临床早期快速诊断的需求，特别是由于人体皮肤表面的正常菌或环境中的常见细菌的存在，常见的如凝固酶阴性葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌等，若采血过程中不严格进行无菌操作就会引起污染，导致假阳性，在日常检测中需通过多个采样部位、多瓶培养以及增加采血量等方式来提高阳性率和准确率，增加了医护工作量。
9.在过去的二十年间，分子生物学技术的进步使微生物诊断有了革命性的进展，用于诊断血流感染的分子生物学方法不断涌现，有基于pcr的核酸扩增技术，以其高灵敏度和高特异性的特点不仅适用于血培养阳性的样本检测，同时也适用于全血标本；另外也有基于非核酸扩增技术的方法，诸如原位杂交、基因芯片、质谱法等。与原位杂交、基因芯片等检测手段相比，基于pcr的核酸扩增技术因成本相对较低且易于操作而得到广泛应用。
10.如授权公告号为cn101824470b的中国发明专利公开了一种基于ce-sscp的血液病原菌快速检测方法，该方法针对血液感染的金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16srrna基因的保守区域，设计相应的pcr通用引物并荧光标记，然后采用pcr反应对血液样本中的病原菌进行扩增以及电泳检测；授权公告号：cn101805789b的中国发明专利公开了一种基于机器码识别技术的血液病原菌快速检测方法，该方法针对血液感染的金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16srdna和23srdna的保守区域设计相应通用引物并荧光标记，然后采用pcr反应分别对七种病原菌标准菌株dna及待检测血液样本细菌基因组dna进行pcr扩增以及ce-sscp检测，检测结果进行机器码识别(二进制和十进制的编码)并进行比对。
11.然而上述的检测方法只能对7种血液感染细菌进行检测，不能同时对其他感染率较高的细菌进行检测，综合检出率较低。

技术实现要素：

12.本发明的发明目的是提供一种同时检测至少八种血流病原体的引物组合物及其应用，以解决现有技术中存在的问题。
13.为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
14.一种同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物，该引物组合物包括如下(1)-(33)组引物对中的至少八组引物对：
15.(1)用于检测鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.1所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.2所示核苷酸序列的反向引物；
16.(2)用于检测洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.3所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.4所示核苷酸序列的反向引物；
17.(3)用于检测白念珠菌(candida albicans)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.5所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.6所示核苷酸序列的反向引物；
18.(4)用于检测光滑念珠菌(candida glabrata)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.7所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.8所示核苷酸序列的反向引物；
19.(5)用于检测近平滑念珠菌(candida parapsilosis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.9所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.10所示核苷酸序列的反向引物；
20.(6)用于检测热带念珠菌(candida tropicalis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.11所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.12所示核苷酸序列的反向引物；
21.(7)用于检测阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.13所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.14所示核苷酸序列的反向引物；
22.(8)用于检测粪肠球菌(enterococcus faecalis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.15所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.16所示核苷酸序列的反向引物；
23.(9)用于检测屎肠球菌(enterococcus faecium)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.17所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.18所示核苷酸序列的反向引物；
24.(10)用于检测大肠埃希菌(escherichia coli)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.19所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.20所示核苷酸序列的反向引物；
25.(11)用于检测流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.21所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.22所示核苷酸序列的反向引物；
26.(12)用于检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.23所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.24所示核苷酸序列的反向引物；
27.(13)用于检测产酸克雷伯菌(klebsiella oxytoca)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.25所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.26所示核苷酸序列的反向引物；
28.(14)用于检测肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.27所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.28所示核苷酸序列的反向引物；
29.(15)用于检测卡他莫拉菌(moraxella catarrhalis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.29所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.30所示核苷酸序列的反向引物；
30.(16)用于检测奇异变形杆菌(proteus mirabilis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.31所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.32所示核苷酸序列的反向引物；
31.(17)用于检测铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.33所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.34所示核苷酸序列的反向引物；
32.(18)用于检测肠道沙门菌(salmonella enterica)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.35所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.36所示核苷酸序列的反向引物；
33.(19)用于检测粘质沙雷菌(serratia marcescens)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.37所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.38所示核苷酸序列的反向引物；
34.(20)用于检测金黄葡萄球菌(staphyloccocus aureus)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.39所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.40所示核苷酸序列的反向引物；
35.(21)用于检测头状葡萄球菌(staphylococcus capitis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.41所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.42所示核苷酸序列的反向引物；
36.(22)用于检测表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.43所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.44所示核苷酸序列的反向引物；
37.(23)用于检测溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.45所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.46所示核苷酸序列的反向引物；
38.(24)用于检测人型葡萄球菌(staphylococcus hominis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.47所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.48所示核苷酸序列的反向引物；
39.(25)用于检测嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.49所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.50所示核苷酸序列的反向引物；
40.(26)用于检测无乳链球菌(streptococcus agalactiae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.51所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.52所示核苷酸序列的反向引物；
41.(27)用于检测米勒链球菌(streptococcus milleri)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.53所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.54所示核苷酸序列的反向引物；
42.(28)用于检测轻型链球菌(streptococcus mitis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.55所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.56所示核苷酸序列的反向引物；
43.(29)用于检测变异链球菌(streptococcus mutans)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.57所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.58所示核苷酸序列的反向引物；
44.(30)用于检测肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.59所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.60所示核苷酸序列的反向引物；
45.(31)用于检测化脓链球菌(streptococcus pyogenes)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.61所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.62所示核苷酸序列的反向引物；
46.(32)用于检测唾液链球菌(streptococcus salivarius)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.63所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.64所示核苷酸序列的反向引物；
47.(33)用于检测血链球菌(streptococcus sanguinis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.65所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.66所示核苷酸序列的反向引物。
48.该引物组合物能够同时实现十四种革兰氏阴性细菌、十五种革兰氏阳性细菌和四种真菌中至少八种血液感染病原体的定性检测，为病原体感染血液后的针对性提供有力的基础；各引物对的检测特异性强、检测灵敏度高；经检测，本发明的引物组合物对嗜麦芽窄食单胞菌、近平滑念珠菌、白念珠菌、大肠埃希菌、肠道沙门菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、溶血葡萄球菌、头状葡萄球菌和唾液链球菌的最低检出限为100copies/μl；对光滑念珠菌、卡他莫拉菌、热带念珠菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄葡萄球菌、人型葡萄球菌、变异链球菌、轻型链球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌和屎肠球菌的最低检出限为50copies/μl；对奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、产气克雷伯菌、表皮葡萄球菌、血链球菌、米勒链球菌、粪肠球菌和无乳链球菌的最低检出限为25copies/μl。
49.在上述的同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物中，在所有引物对中，正向引物的5’端均添加有荧光报告基团。
50.作为优选，嗜麦芽窄食单胞菌、奇异变形杆菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、白念珠菌、卡他莫拉菌、热带念珠菌的正向引物标记fam荧光基团；大肠埃希菌、肠道沙门菌、阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、粘质沙雷菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、产气克雷伯菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌的正向引物标记vic荧光基团；溶血葡萄球菌、金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、头状葡萄球菌的正向引物标记ned荧光基团；血链球菌、米勒链球菌、变异链球菌、轻型链球菌、唾液链球菌的正向引物标记rox荧光
基团；化脓链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、无乳链球菌的正向引物标记af591荧光基团。
51.本发明还提供了上述的同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物在制备血流感染病原体多重检测试剂盒中的应用。
52.本发明还提供了一种血流感染病原体多重检测试剂盒，该试剂盒中即含有上述的同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物。
53.作为优选，上述的血流感染病原体多重检测试剂盒还包含用于扩增人dna内参基因的引物对，以及用于扩增ic的引物对。
54.作为优选，在上述的血流感染病原体多重检测试剂盒中，所述的用于扩增人dna内参基因的引物对包括具有如seq id no.67所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.68所示核苷酸序列的反向引物。
55.作为优选，在上述的血流感染病原体多重检测试剂盒中，所述的用于扩增ic的引物对包括具有如seq id no.69所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.70所示核苷酸序列的反向引物。
56.同样地，在上述的血流感染病原体多重检测试剂盒中，所述的用于扩增人dna内参基因的引物对和所述的用于扩增ic的引物对中，正向引物的5’端均添加有荧光报告基团。
57.作为优选，上述的血流感染病原体多重检测试剂盒中还含有阳性对照，该阳性对照为含有所有阳性检测靶点、人dna内参和ic的重组质粒。
58.作为优选，上述的血流感染病原体多重检测试剂盒中还含有pcr反应液、热启动dna聚合酶以及ung酶，所述的pcr反应液包括dntps、dutp、mg
2+
和缓冲液。
59.与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
60.(1)本发明的引物组合物能够同时实现十四种革兰氏阴性细菌、十五种革兰氏阳性细菌和四种真菌中至少八种血液感染病原体的定性检测，为病原体感染血液后的针对性提供有力的基础；各引物对的检测特异性强、检测灵敏度高；经检测，本发明的引物组合物对嗜麦芽窄食单胞菌、近平滑念珠菌、白念珠菌、大肠埃希菌、肠道沙门菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、溶血葡萄球菌、头状葡萄球菌和唾液链球菌的最低检出限为100copies/μl；对光滑念珠菌、卡他莫拉菌、热带念珠菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄葡萄球菌、人型葡萄球菌、变异链球菌、轻型链球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌和屎肠球菌的最低检出限为50copies/μl；对奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、产气克雷伯菌、表皮葡萄球菌、血链球菌、米勒链球菌、粪肠球菌和无乳链球菌的最低检出限为25copies/μl。
61.(2)本发明的血流感染病原体多重检测试剂盒对三十三种常见血流感染病原体的检测周期短，并且采用dutp-ung酶防污染体系，该体系能够有效避免气溶胶污染影响pcr结果，从根本上避免假阳性结果的出现。
附图说明
62.图1为本发明的引物组合物对阳性靶点标准菌株的特异性扩增合并结果；
63.图2为本发明的引物组合物对阴性靶点标准菌株的特异性扩增合并结果；
64.图3为本发明的引物组合物对嗜麦芽窄食单胞菌的灵敏度测试结果；
65.其中，“25％-75％”表示上下四分位数；“range within 1.5iqr”表示上下边缘值；“median line”表示中位数；“mean”表示平均数；“outlier”表示异常值；下同；
66.图4为本发明的引物组合物对奇异变形杆菌的灵敏度测试结果；
67.图5为本发明的引物组合物对光滑念珠菌的灵敏度测试结果；
68.图6为本发明的引物组合物对近平滑念珠菌的灵敏度测试结果；
69.图7为本发明的引物组合物对白念珠菌的灵敏度测试结果；
70.图8为本发明的引物组合物对卡他莫拉菌的灵敏度测试结果；
71.图9为本发明的引物组合物对热带念珠菌的灵敏度测试结果；
72.图10为本发明的引物组合物对大肠埃希菌的灵敏度测试结果；
73.图11为本发明的引物组合物对肠道沙门菌的灵敏度测试结果；
74.图12为本发明的引物组合物对阴沟肠杆菌的灵敏度测试结果；
75.图13为本发明的引物组合物对产酸克雷伯菌的灵敏度测试结果；
76.图14为本发明的引物组合物对粘质沙雷菌的灵敏度测试结果；
77.图15为本发明的引物组合物对洋葱伯克霍尔德菌的灵敏度测试结果；
78.图16为本发明的引物组合物对鲍曼不动杆菌的灵敏度测试结果；
79.图17为本发明的引物组合物对肺炎克雷伯菌的灵敏度测试结果；
80.图18为本发明的引物组合物对产气克雷伯菌的灵敏度测试结果；
81.图19为本发明的引物组合物对铜绿假单胞菌的灵敏度测试结果；
82.图20为本发明的引物组合物对流感嗜血杆菌的灵敏度测试结果；
83.图21为本发明的引物组合物对溶血葡萄球菌的灵敏度测试结果；
84.图22为本发明的引物组合物对金黄葡萄球菌的灵敏度测试结果；
85.图23为本发明的引物组合物对表皮葡萄球菌的灵敏度测试结果；
86.图24为本发明的引物组合物对人型葡萄球菌的灵敏度测试结果；
87.图25为本发明的引物组合物对头状葡萄球菌的灵敏度测试结果；
88.图26为本发明的引物组合物对血链球菌的灵敏度测试结果；
89.图27为本发明的引物组合物对米勒链球菌的灵敏度测试结果；
90.图28为本发明的引物组合物对变异链球菌的灵敏度测试结果；
91.图29为本发明的引物组合物对轻型链球菌的灵敏度测试结果；
92.图30为本发明的引物组合物对唾液链球菌的灵敏度测试结果；
93.图31为本发明的引物组合物对化脓链球菌的灵敏度测试结果；
94.图32为本发明的引物组合物对肺炎链球菌的灵敏度测试结果；
95.图33为本发明的引物组合物对粪肠球菌的灵敏度测试结果；
96.图34为本发明的引物组合物对屎肠球菌的灵敏度测试结果；
97.图35为本发明的引物组合物对无乳链球菌的灵敏度测试结果。
具体实施方式
98.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明。
99.实施例1
100.1、引物设计
101.分别针对三十三种血流感染常见病原菌(鲍曼不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、产气克雷伯菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、肠道沙门菌、粘质沙雷菌、金黄葡萄球菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人型葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、无乳链球菌、米勒链球菌、轻型链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、唾液链球菌和血链球菌)、人dna内参基因、反应内参ic设计特异性引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表1所示。
102.表1特异性引物设计
103.104.105.[0106][0107]
2、血流感染病原体多重检测试剂盒的制备
[0108]
采用上述引物组合物制备本发明的血流感染病原体多重检测试剂盒，该试剂盒包含引物组合物、pcr反应液(包含pcr酶系)、阳性对照以及阴性对照。其中引物组合物的组成由表2所示，pcr反应液的试剂组成如表3所示，阳性对照为包含所有检测靶点的扩增序列的重组质粒，阴性对照为rnase-free h2o。
[0109]
表2本实施例血流感染病原体多重检测试剂盒的引物组合物组成(50人份)
[0110]
[0111][0112]
表3本实施例血流感染病原体多重检测试剂盒的pcr反应液组成(50人份)
[0113][0114]
3、对阳性靶点标准菌株的特异性验证
[0115]
采用阳性靶点标准菌株(表4)培养后基因组提取物对本实施例血流感染病原体检
测试剂盒进行检测效果验证。
[0116]
表4阳性靶点标准菌株相关信息列表
[0117]
靶点名称标准菌株来源标准菌株编号鲍曼不动杆菌atccbaa-1709洋葱伯克霍尔德菌atcc17460白念珠菌atcc18804光滑念珠菌atcc2001近平滑念珠菌atcc22019热带念珠菌atcc750阴沟肠杆菌atcc23373粪肠球菌atcc19433屎肠球菌atcc19434大肠埃希菌atccbaa-2471流感嗜血杆菌atcc53763产气克雷伯菌atcc49469产酸克雷伯菌atccbaa-3059肺炎克雷伯菌atccbaa-1705卡他莫拉菌atccbaa-1425奇异变形杆菌atcc35659铜绿假单胞菌atcccrm-9027肠道沙门菌atcc35664粘质沙雷菌atcc14756金黄葡萄球菌atcc1422头状葡萄球菌atcc146表皮葡萄球菌atcc12228溶血葡萄球菌atcc29970人型葡萄球菌atcc27844嗜麦芽窄食单胞菌atcc13637无乳链球菌atcc12386米勒链球菌*n/an/a轻型链球菌atcc49456变异链球菌atcc25175肺炎链球菌atccbaa-2298化脓链球菌atcc12202唾液链球菌atccbaa-2593血链球菌atcc10556
[0118]
注：*米勒链球菌由于无标准菌株，故选用在血液中分离得到并经16s rrna测序鉴定的米勒链球菌代替。
[0119]
具体验证方法为：
[0120]
(1)核酸提取：根据细菌基因组dna提取试剂盒和真菌基因组dna提取试剂盒说明书分别对细菌和真菌进行基因组dna提取和纯化；
[0121]
(2)多重pcr：根据表5配制pcr反应体系，将配制好的体系振荡、混匀、离心后置于pcr仪上，在根据表6所示的反应程序进行多重pcr，而后准备电泳样品，每个电泳孔分别加入hi-di 8.7μl、size-500 0.3μl和pcr产物1μl，混匀后离心备用；
[0122]
表5多重pcr反应体系(单次反应)
[0123]
试剂加样量(μl)pcr反应液11引物组4模板核酸/阳性对照/阴性对照5体系总体积20
[0124]
表6多重pcr扩增程序
[0125][0126]
(3)毛细管电泳：将样品板置于3500dx基因分析仪中，选择“fragment”电泳方法进行电泳，具体操作方法详见3500dx操作说明书；
[0127]
(4)结果分析：根据以下判断标准对电泳结果进行分析：若特征靶点的峰高大于2000rfu，则判定为阳性结果，并判断血流感染病原体种类；若特征靶点的峰高小于等于500rfu，则判定为阴性结果；若特征靶点的峰高大于500rfu并小于等于2000rfu，则判定为灰区，需要重新取样并再次检测，若结果为阳性或灰区，则判定为阳性结果，并判断血流感染病原体种类，否则判定为阴性结果。
[0128]
如图1所示，本实施例的血流感染病原菌多重检测试剂盒对所有检测靶点扩增良好，扩增产物长度与预期长度一致，各个产物和引物间无明显干扰，特异性强。
[0129]
4、对阴性靶点标准菌株的特异性验证
[0130]
采用阴性靶点标准菌株(表7)培养后基因组提取物对本实施例血流感染病原体检测试剂盒进行检测(检测方法与阳性靶点标准菌株相同)，以验证本发明的血流感染病原体多重检测试剂盒的特异性。
[0131]
表7阴性靶点标准菌株相关信息列表
[0132]
靶点名称atcc编号结核分枝杆菌27294副百日咳博德特菌15237百日咳博德特菌10380肺炎衣原体vr-2282
沙眼衣原体vr-1477单核细胞增生李斯特菌7644肺炎支原体15531脑膜炎奈瑟菌53418解脲脲原体27618
[0133]
如图2所示，本发明的血流感染多重检测试剂盒对阴性标准菌株的检测结果均为阴性，即在样本中ic正常出峰，但均未检测到任何阳性靶点信号，表明本发明的试剂盒对其他阴性检测靶点具有较好的特异性，在多重pcr过程中不会因为非特异性扩增而造成假阳性结果的出现。
[0134]
5、灵敏度测试
[0135]
将测定浓度和纯度后的包含各检测靶点扩增片段的重组质粒分别进行2倍梯度稀释，得到从400copies/μl-25copies/μl共5个稀释梯度的阳性质粒作为标准模版，而后利用本发明的试剂盒对上述阳性质粒进行多重pcr反应，每个浓度梯度重复20次，获得每一个浓度的阳性重组质粒荧光信号值，并判断最低检出限；检测结果如图3至图33所示。
[0136]
结果显示，最低检出限为100copies/μl的检测靶点包括嗜麦芽窄食单胞菌、近平滑念珠菌、白念珠菌、大肠埃希菌、肠道沙门菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、溶血葡萄球菌、头状葡萄球菌、唾液链球菌；最低检出限为50copies/μl的检测靶点包括光滑念珠菌、卡他莫拉菌、热带念珠菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄葡萄球菌、人型葡萄球菌、变异链球菌、轻型链球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、屎肠球菌；最低检出限为25copies/μl的检测靶点包括奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、产气克雷伯菌、表皮葡萄球菌、血链球菌、米勒链球菌、粪肠球菌、无乳链球菌。综合所有靶点最低检出限数据，故本发明的血流感染病原体多重pcr检测试剂盒的最低检出限为100copies/μl。

技术特征：

1.一种同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物，其特征在于，包括如下(1)-(33)组引物对中的至少八组引物对：(1)用于检测鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.1所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.2所示核苷酸序列的反向引物；(2)用于检测洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.3所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.4所示核苷酸序列的反向引物；(3)用于检测白念珠菌(candida albicans)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.5所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.6所示核苷酸序列的反向引物；(4)用于检测光滑念珠菌(candida glabrata)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.7所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.8所示核苷酸序列的反向引物；(5)用于检测近平滑念珠菌(candida parapsilosis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.9所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.10所示核苷酸序列的反向引物；(6)用于检测热带念珠菌(candida tropicalis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.11所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.12所示核苷酸序列的反向引物；(7)用于检测阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.13所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.14所示核苷酸序列的反向引物；(8)用于检测粪肠球菌(enterococcus faecalis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.15所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.16所示核苷酸序列的反向引物；(9)用于检测屎肠球菌(enterococcus faecium)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.17所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.18所示核苷酸序列的反向引物；(10)用于检测大肠埃希菌(escherichia coli)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.19所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.20所示核苷酸序列的反向引物；(11)用于检测流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.21所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.22所示核苷酸序列的反向引物；(12)用于检测产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.23所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.24所示核苷酸序列的反向引物；(13)用于检测产酸克雷伯菌(klebsiella oxytoca)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.25所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.26所示核苷酸序列的反向引物；(14)用于检测肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.27所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.28所示核苷酸序列的反向引物；(15)用于检测卡他莫拉菌(moraxella catarrhalis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.29所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.30所示核苷酸序列的反向
引物；(16)用于检测奇异变形杆菌(proteus mirabilis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.31所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.32所示核苷酸序列的反向引物；(17)用于检测铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.33所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.34所示核苷酸序列的反向引物；(18)用于检测肠道沙门菌(salmonella enterica)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.35所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.36所示核苷酸序列的反向引物；(19)用于检测粘质沙雷菌(serratia marcescens)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.37所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.38所示核苷酸序列的反向引物；(20)用于检测金黄葡萄球菌(staphyloccocus aureus)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.39所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.40所示核苷酸序列的反向引物；(21)用于检测头状葡萄球菌(staphylococcus capitis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.41所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.42所示核苷酸序列的反向引物；(22)用于检测表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.43所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.44所示核苷酸序列的反向引物；(23)用于检测溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.45所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.46所示核苷酸序列的反向引物；(24)用于检测人型葡萄球菌(staphylococcus hominis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.47所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.48所示核苷酸序列的反向引物；(25)用于检测嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.49所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.50所示核苷酸序列的反向引物；(26)用于检测无乳链球菌(streptococcus agalactiae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.51所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.52所示核苷酸序列的反向引物；(27)用于检测米勒链球菌(streptococcus milleri)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.53所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.54所示核苷酸序列的反向引物；(28)用于检测轻型链球菌(streptococcus mitis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.55所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.56所示核苷酸序列的反向引物；(29)用于检测变异链球菌(streptococcus mutans)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.57所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.58所示核苷酸序列的反向引物；
(30)用于检测肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.59所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.60所示核苷酸序列的反向引物；(31)用于检测化脓链球菌(streptococcus pyogenes)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.61所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.62所示核苷酸序列的反向引物；(32)用于检测唾液链球菌(streptococcus salivarius)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.63所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.64所示核苷酸序列的反向引物；(33)用于检测血链球菌(streptococcus sanguinis)的引物对，该引物对包括具有如seq id no.65所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.66所示核苷酸序列的反向引物。2.如权利要求1所述的同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物，其特征在于，在所有引物对中，正向引物的5’端均添加有荧光报告基团。3.如权利要求1或2所述的同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物在制备血流感染病原体多重检测试剂盒中的应用。4.一种血流感染病原体多重检测试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1或2所述的同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物。5.如权利要求4所述的血流感染病原体多重检测试剂盒，其特征在于，还包含用于扩增人dna内参基因的引物对，以及用于扩增ic的引物对。6.如权利要求5所述的血流感染病原体多重检测试剂盒，其特征在于，所述的用于扩增人dna内参基因的引物对包括具有如seq id no.67所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.68所示核苷酸序列的反向引物。7.如权利要求5所述的血流感染病原体多重检测试剂盒，其特征在于，所述的用于扩增ic的引物对包括具有如seq id no.69所示核苷酸序列的正向引物和具有如seq id no.70所示核苷酸序列的反向引物。8.如权利要求5所述的血流感染病原体多重检测试剂盒，其特征在于，所述的用于扩增人dna内参基因的引物对和所述的用于扩增ic的引物对中，正向引物的5’端均添加有荧光报告基团。9.如权利要求4所述的血流感染病原体多重检测试剂盒，其特征在于，还含有阳性对照，该阳性对照为含有所有阳性检测靶点、人dna内参和ic的重组质粒。10.如权利要求4所述的血流感染病原体多重检测试剂盒，其特征在于，还含有pcr反应液、热启动dna聚合酶以及ung酶，所述的pcr反应液包括dntps、dutp、mg
2+
和缓冲液。

技术总结

本发明公开了一种同时检测至少八种血流病原体的引物组合物及其应用。该引物组合物能够同时实现十四种革兰氏阴性细菌、十五种革兰氏阳性细菌和四种真菌中至少八种血液感染病原体的定性检测，为病原体感染血液后的针对性提供有力的基础；各引物对的检测特异性强、检测灵敏度高，其中，对部分血流病原体的最低检出限可达100copies/μL，对部分血流病原体的最低检出限可达50copies/μL，对部分血流病原体的最低检出限可达25copies/μL。病原体的最低检出限可达25copies/μL。病原体的最低检出限可达25copies/μL。