NUA基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用

nua基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物耐盐胁迫技术领域，具体涉及一种nua基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用。

背景技术：

2.土壤盐渍化是影响全球粮食产量和质量的重要因素之一，并有日益增长的趋势；当前全球盐碱地面积约1
×
10
9 hm
²
，占陆地面积7%，我国盐碱地面积高达1
×
10
8 hm
²
。而作物耐盐性研究能够为开发、选育耐盐作物及盐渍化土地的利用提供依据，对推动农业可持续发展具有重要意义。
3.植物耐盐性是由多基因协同控制的复杂的数量性状；此类基因直接或间接参与离子积累和排斥、氧化还原反应和特定渗透调节物质的积累等。有研究报道，过表达ptvp1.1 (h
+
焦磷酸酶基因)的毛果杨根内na
+
减少h
+
增多，从而提高了植物耐盐性；osccd1 可能影响dreb2b和它的下游基因，过表达osccd1 基因增强了水稻幼苗对外源aba的响应，进而提高对渗透和盐胁迫的耐受性。植物盐响应基因数量庞大，表达模式多样化，致使盐功能基因表达网络十分复杂。在不同植物中继续寻耐盐差异基因，挖掘新基因和相关应答元件对作物抗盐性提高及高耐盐胁迫作物选育具有重要的意义。
4.公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

5.发明人研究发现，敲除nua基因或降低其表达，能够增加植物对盐胁迫的耐受；并通过鉴定拟南芥nua的t-dna插入突变体，发现突变体与野生型相比对盐胁迫的抗性明显提高。
6.根据本公开的一个方面，基于nua基因（如seq id no.1所示）或其同源基因能够实现对植物盐胁迫抗性的调控。
7.在本公开的一些实施例中，通过敲除植物中的nua基因或下调其表达以提高植物盐胁迫抗性。
8.根据本公开的另一个方面，利用nua基因干扰载体、沉默表达载体或下调表达载体进行植物盐胁迫抗性的提高或耐盐植物品种的选育。
9.根据本公开的另一个方面，t-dna插入突变体nua能够应用于提高植物盐胁迫抗性或选育耐盐品种等方面。
10.根据本公开的另一个方面，提供一种提高植物盐胁迫抗性的方法，包括以下步骤：获取nua基因或其同源序列，对nua基因或其转录产物进行敲除、插入、定点突变或精确修饰，以构建沉默表达载体或下调表达载体，并将其导入目标植株中，获得盐胁迫抗性提高的转基因植株。
11.在本公开的一些实施例中，所述目标植株为拟南芥、小麦、玉米、水稻、花生、大豆、
油菜、芝麻、棉花中的任意一种。
12.本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：1. nua基因的敲除或低表达能够提升植物对盐胁迫的耐受程度；通过crispr-cas9技术对nua基因进行敲除或降低其表达的编辑，可获得没有外源转化载体插入的非转基因编辑突变体，有利于在作物中推广应用。
13.2. 对拟南芥nua的t-dna插入突变体的耐盐性进行分析，发现该突变体与野生型相比对盐胁迫的抗性明显提高。
附图说明
14.图1为本技术一实施例中拟南芥nua突变体植株的基因型鉴定图。
15.图2为本技术一实施例中拟南芥nua突变体中t-dna的插入位点及方向的示意图。
16.图3为本技术一实施例中rt-pcr检测拟南芥nua突变体中nua基因的表达鉴定图。
17.图4为本技术一实施例中拟南芥nua突变体在盐胁迫下的生长状态对比照片。
18.图5为本技术一实施例中拟南芥nua突变体植株在盐胁迫下的存活率统计图。
19.图6为本技术一实施例中拟南芥nua突变体植株在盐胁迫下地上部分的叶绿素含量统计图。
具体实施方式
20.在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂、原料如无特别说明，均为市售渠道获得；所涉及的检测、测试方法，如无特别说明，均为常规方法。
21.拟南芥nua基因是动物tpr（translocated promoter region）的同源基因，编码一类核孔锚定蛋白，是核孔复合体（npc，nuclear pore complex）的一部分。nua参与植物体内蛋白的sumo化修饰（small ubiquitin-related modi
ﬁ
er）。sumos是一类分子量约为15 kd的蛋白，几乎存在于所有真核生物中。sumo化修饰是一种蛋白翻译后修饰，在植物生长发育、开花调控等方面起非常重要的作用。esd4基因编码一个sumo蛋白酶，参与植物的去sumo化修饰。nua与sumo蛋白酶esd4相互作用，调节esd4的去sumo化活性，nua和esd4突变体中蛋白的sumo化水平都比野生型高。但是，目前并未发现nua在植物盐胁迫中的功能及作用的相关报道。nua可以与aba信号通路中的snrk2蛋白激酶相互作用，负调控aba的信号转导，其功能缺失突变体对aba超敏感，所以nua可能通过此机制参与植物的盐胁迫。
22.本技术通过以下实施例进行了验证。
23.实施例一：拟南芥nua突变体耐盐胁迫验证试验（一）nua突变体的获取拟南芥nua（基因号at1g79280）的t-dna插入突变体nua的获取：购自于abrc（https://abrc.osu.edu/stocks/number/cs39980）；该突变体t-dna的插入位点及方向如图2所示。
24.（二）nua突变体的基因型鉴定1. 播种：将拟南芥nua突变体种子置于1.5ml离心管中，分别用 70%乙醇和无水乙
醇消毒种子10 min。然后将种子铺于灭菌的滤纸上，等乙醇挥发后，均匀撒在1/2 ms培养基上。然后在4℃放置48小时春化，最后放置于光照培养箱中培养。
25.2. dna提取：取一片生长4周的拟南芥莲座叶至 1.5 ml 离心管中，用研磨棒将材料磨碎；加 300 μl dna 抽提 buffer，再次研磨至没有大的组织碎片；加 300 μl 异丙醇，颠倒混匀；13000 rpm 离心 8 min，弃上清；加入 800 μl 75%乙醇，悬浮沉淀；13000 rpm 离心 4 min，弃上清；倒置于吸水纸上晾干；加入 100 μl ddh 2
o，溶解后于-20℃保存。
26.注：dna提取缓冲液：0.25 m edta（ph 8.0），0.5% sds，0.25 m nacl ，0.2 m tris-hcl（ph 7.5）。
27.3. pcr鉴定：采用三引物法鉴定，引物序列如下：nua_f: tgaaccaattccatactgcatc，nua_r: atttctcatgttcagtctccag，sail_lb1: gccttttcagaaatggataaatagccttgcttcc；pcr体系：5 μl pcr mix，0.2 μl引物1，0.2 μl引物2，2 μl dna模板，2.6 μl ddh2o。
28.pcr程序：退火温度58℃，延伸2min，35个循环。
29.4. 电泳：结果如图1所示，用引物nua_f和nua_r扩增，col-0野生型可扩增出1600 bp左右的条带，但是nua纯合突变体无条带。用引物nua_r和sail_lb1扩增，nua纯合突变体可扩增出约850 bp左右的条带，但是col-0野生型无条带。
30.（三）rt-pcr检测拟南芥nua突变体中nua基因的表达1. rna提取：取0.1 g生长7天的拟南芥col-0野生型和nua纯合突变体幼苗，液氮研磨；加入1ml trizol，混合均匀，室温放置10 min；加入200 μl氯仿，剧烈震荡，冰上放置10 min；离心20 min（4 ℃，13000 rpm），取上清约500 μl至新的离心管中；加入等体积即500 μl异丙醇，混匀，-20 ℃放置30min；离心10min（4 ℃，13000 rpm），弃上清；加入1ml depc水配置的75%乙醇，洗涤沉淀两次，每次离心5min（4 ℃，13000 rpm）；rna晾干后，加入depc水50 μl溶解rna。
31.2.反转录：按试剂盒中的说明步骤（yeasen hifair
ꢀ®ꢀⅲꢀ
1st strand cdna synthesis supermix for qpcr）。
32.3. rt-pcr：以上述步骤所得的cdna为模板，以actin2基因（基因号：at3g18780）为内参，调整模板上样量，然后扩增nua基因片段。
33.结果如图3所示，col-0野生型中有nua基因的表达，但是nua突变体中nua无表达，表明突变体中nua基因被敲除。
34.nua引物如下：nua_rt_f：gcttctgtcgctgaggctagac，nua_rt_r：gctcggatttctgaatacagtc；pcr产物大小为364 bp。
35.actin2引物如下：act_rt_f：atggaagctgctggaatccac，act_rt_r：ctcggccttggagatccacatc；
pcr产物大小为278 bp。
36.（四）盐胁迫处理1. 含nacl的1/2 ms培养基的配置。在100 ml常规1/2 ms培养基中加入0.8766 g nacl（150 mm）或1.1688 g nacl（200 mm），灭菌后倒入培养皿中。
37.2. 将拟南芥nua和col-0野生型拟南芥种子播种到1/2 ms培养基上，垂直生长4天后，转移到含有150 mm nacl的1/2 ms培养基上，继续垂直生长5天（见图4）。结果如图4中箭头所示，盐胁迫处理的拟南芥幼苗子叶发生白化现象，突变体与野生型相比更抗盐胁迫。接下来通过存活率和地上部分的叶绿素含量两个指标对植株耐盐胁迫的程度进行量化统计。
38.3. 存活率统计盐胁迫处理的拟南芥幼苗子叶发生白化现象，子叶仍为绿的幼苗视为存活的幼苗，据此统计存活率。
39.结果如图5所示，在盐胁迫下nua突变体的存活率明显高于野生型，差异极显著，表明nua突变体比野生型更耐盐胁迫。
40.4. 叶绿素含量测定
①
将上述各处理所得的幼苗，取其地上部分，称重，放置于10 ml离心管中，加入95%乙醇，避光，摇床上放置过夜。
41.②
取200 μl用酶标仪测定波长在663 nm和645 nm处的吸光值。
42.③
计算叶绿素的含量，公式如下：ca=(12.7
×
od
663-2.69
×
od
645
)
×
稀释倍数/重量；cb=(22.9
×
od
645-4.68
×
od
663
)
×
稀释倍数/重量；ca代表叶绿素a的含量mg/g；cb代表叶绿素b的含量mg/g。
43.④
统计叶绿素含量的差异，都以各自在1/2 ms培养基上生长的幼苗的叶绿素含量视为100%，统计百分比。
44.结果如如图6所示，与1/2ms培养基上相比，在盐胁迫处理后，nua突变体的地上部分叶绿素含量降低程度明显低于野生型，表明nua突变体更耐盐胁迫。
45.尽管已描述了本发明的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
46.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本技术权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

1.nua基因或其同源基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，敲除植物中的nua基因或下调其表达以提高植物盐胁迫抗性。3.nua基因干扰载体、沉默表达载体或下调表达载体在植物盐胁迫抗性提高或耐盐植物品种选育中的应用。4.t-dna插入突变体nua在提高植物盐胁迫抗性或选育耐盐植物品种中的应用。5.一种提高植物盐胁迫抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：获取nua基因或其同源序列，对nua基因或其转录产物进行敲除、插入、定点突变或精确修饰，以构建沉默表达载体或下调表达载体，并将其导入目标植株中，获得盐胁迫抗性提高的转基因植株。6.根据权利要求5所述提高植物盐胁迫抗性的方法，其特征在于，所述目标植株为拟南芥、小麦、玉米、水稻、花生、大豆、油菜、芝麻、棉花中的任意一种。

技术总结

本申请公开了一种NUA基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用，旨在解决植物耐盐性提高及耐盐植物品种选育缺乏有效技术手段的技术问题。本申请研究发现，敲除NUA基因或降低其表达，能够增加植物对盐胁迫的耐受；并通过鉴定拟南芥NUA的T-DNA插入突变体，发现突变体与野生型相比对盐胁迫的抗性明显提高。通过CRISPR-Cas9技术对NUA基因进行敲除或降低其表达的编辑，可获得没有外源转化载体插入的非转基因编辑突变体，有利于在作物中推广应用。有利于在作物中推广应用。有利于在作物中推广应用。