罗伊氏乳杆菌C2及在制备抑制单胺氧化酶药物中的应用的制作方法

罗伊氏乳杆菌c2及在制备抑制单胺氧化酶药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，更具体地说是涉及罗伊氏乳杆菌c2及在制备抑制单胺氧化酶药物中的应用。

背景技术：

2.单胺氧化酶(mao)在中枢神经系统细胞内神经递质的代谢中起着关键作用。在抑郁行为的啮齿动物模型和抑郁情绪的人类的前额叶皮层和前扣带皮层中检测到mao水平升高。因此，mao已被作为几种神经和神经退行性疾病的潜在药物靶点。mao抑制剂被有效地用于抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病等精神障碍的。然而，由于mao抑制剂药物会引起高血压危象的副作用，限制其广泛应用。因此，寻一种疗效可靠、毒副作用小的单胺氧化酶抑制剂作为临床抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病等精神障碍疾病的潜在药物具有重要意义。与传统药物相比，具有抑制单胺氧化酶活性的益生菌因其副作用小并且具有其他益生功效等特点，而被广泛关注。
3.肠道菌通过多种途径影响大脑生理，菌失调似乎在抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病等精神障碍疾病的发病机制中发挥作用。益生菌通过微生物-肠道-脑轴对中枢神经系统的功能具有多效性。在一项长达两年的随访研究中，研究人员观察到帕金森患者的肠道微生物发生了显著变化，产生丁酸盐的细菌减少。这些发现提出了一种基于恢复肠道菌的替代疗法，以防止或阻止帕金森病理的进展。先前的研究表明，鼠李糖乳杆菌gg被认为是诱导神经营养因产生和下调单胺氧化酶的主要贡献者，具有预防或抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病等精神障碍疾病的潜能。然而，目前益生菌在抑制单胺氧化酶活性的研究和应用依然较少。同时，当前国际益生菌专利申请集中于美、日、俄传统研发强国，而我国缺乏拥有自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。
4.因此，提供一株罗伊氏乳杆菌，并将其应用于在制备抑制单胺氧化酶药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌c2，并将其应用于在制备抑制单胺氧化酶药物中。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种罗伊氏乳杆菌c2，所述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)c2于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.21776，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为罗伊氏乳杆菌
lactobacillusreuteri。
8.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护罗伊氏乳杆菌c2在制备抑制单胺氧化酶药物中的应用。
9.优选地，所述罗伊氏乳杆菌c2能显著抑制斑马鱼体内单胺氧化酶的活性。
10.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种预防或抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病的药物，其特征在于，包括罗伊氏乳杆菌c2菌悬液。
11.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株罗伊氏乳杆菌c2，并提供了罗伊氏乳杆菌c2在制备抑制单胺氧化酶药物中的应用，罗伊氏乳杆菌c2是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，能够显著抑制斑马鱼体内单胺氧化酶的活性，具备应用于预防或抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病的潜能，此为利用罗伊氏乳杆菌c2开发预防或抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
13.图1附图为本发明罗伊氏乳杆菌c2在mrs琼脂平板上的菌落形态；
14.图2附图为本发明鼠李糖乳杆菌e2在mrs琼脂平板上的菌落形态；
15.图3附图为本发明罗伊氏乳杆菌c2和鼠李糖乳杆菌e2对斑马鱼体内单胺氧化酶活性的影响。
具体实施方式
16.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.实施例1罗伊氏乳杆菌c2、鼠李糖乳杆菌e2分离、鉴定及保藏
18.(1)分离：
19.1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1ml无菌生理盐水的1.5ml离心管中，用1ml无菌头充分吹打混匀，备用。
20.2)在6个无菌1.5ml离心管中各加入900ul的无菌生理盐水。
21.3)从第1个装有10-1
样品稀释液的离心管中，吸取100ul的液体加入第2个离心管(10-2
)，稀释到10-2
；
22.4)从第2个装有10-2
样品稀释液的离心管中，吸取100ul的液体加入第3个离心管(10-3
)，稀释到10-3
；
23.5)重复上个步骤，一直稀释到10-4
、10-5
、10-6
、10-7
。
24.6)从装有10-4
样品稀释液的离心管中吸取100ul的样品稀释液涂布在分别接种于
mrs固体培养基、bhi固体培养基中上，将100ul的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。
25.7)重复上个步骤，完成10-5
、10-6
、10-7
稀释梯度的稀释涂布。
26.8)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。
27.9)用接种环挑取平板上的单菌落划线至mrs固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。
28.10)将平板上的纯菌落接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
29.(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组dna，通过pcr技术利用16srdna通用引物27f和1492r扩增16srdna全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。
30.其中，通用引物27f和1492r的引物序列如下：
31.27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；seq id no.1；
32.1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’；seq id no.2。
33.实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16srdna鉴定，其中菌株c2被鉴定为罗伊氏乳杆菌，其16srdna序列如seq id no.3所示。
34.gcggctccctccataaaggttaggccaccgactttgggcgttacaaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaacggctttaagagattagcttactctcgcgagcttgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatctgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcactagagtgcccaacttaatgctggcaactagtaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtcattgcgtccccgaagggaacgccttatctctaaggttagcgcaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctccggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttgcagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcattccaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtcgcccggtttccgatgcacttcttcggttaagccgaaggctttcacatcagacctaagcaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtgactttctggttggataccgtcactgcgtgaacagttactctcacgcacgttcttctccaacaacagagctttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggtgttgctccatcaggcttgcgcccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtatggaccgtgtctcagttccattgtggccgatcagtctctcaactcggctatgcatcatcgccttggtaagccgttaccttaccaactagctaatgcaccgcaggtccatcccagagtgatagccaaagccatctttcaaacaaaagccatg；seq id no.3。
35.菌株c2单菌落接种到mrs固体培养基上，在37℃厌氧下生长良好，菌落乳白、呈球形、边缘整齐，表面光滑(图1)。菌株c2已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年02月01日，分类命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillusreuteri，保藏编号为cgmccno.21776。
36.从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16srdna鉴定，其中菌株e2被鉴定为鼠李糖乳杆菌，其16srdna序列如seq idno.4所示。
37.gacggctcgctccctaaaagggttacgccaccggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcctcggttaagccgagggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcacgccgacaacagttactctgccgaccattcttctccaacaacagagttttacgacccgaaagccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctctcagttcggctacgtatcattgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatacgccgcgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttggatttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccactcgttcaaaattaaatcaagatgcaagcacctttcaataatcagaactcgttcgactgca；seq id no.4。
38.菌株e2单菌落接种到mrs固体培养基上，在37℃厌氧下生长良好，菌落圆形、白、表面光滑(图2)。菌株e2已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年02月01日，分类命名为鼠李糖乳杆菌lactobacillusrhamnosus，保藏编号为cgmccno.21770。
39.实施例2罗伊氏乳杆菌c2、鼠李糖乳杆菌e2菌悬液(菌体)的制备
40.将罗伊氏乳杆菌c2、鼠李糖乳杆菌e2活化培养后分别接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经pbs两次洗涤后，将菌体用pbs重新悬浮，调整细胞浓度为调整细胞浓度为1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml得到菌悬液(菌体)。
41.实施例3罗伊氏乳杆菌c2、鼠李糖乳杆菌e2对斑马鱼体内单胺氧化酶活性的影响
42.盐酸氯吉林购自medchemexpress公司；单胺氧化酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。
43.将野生型ab系斑马鱼(5dpf)置于于六孔板中。实验设置正常组、阳性对照组(盐酸氯吉林)、菌株干预组(1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml、1
×
106cfu/ml罗伊氏乳杆菌c2或鼠李糖乳杆菌e2)，每组设置6个复孔，每孔30条鱼。正常组每孔加入5mlpbs；阳性对照组每孔加入5ml5μmol/l盐酸氯吉林溶液；1
×
104cfu/ml干预组加入1
×
104cfu/ml罗伊氏乳杆菌c2或
鼠李糖乳杆菌e2，1
×
105cfu/ml干预组加入1
×
105cfu/ml罗伊氏乳杆菌c2或鼠李糖乳杆菌e2，1
×
106cfu/ml干预组加入1
×
106cfu/ml罗伊氏乳杆菌c2或鼠李糖乳杆菌e2，每孔5ml，28℃孵育，24h后更换新溶液；孵育72h后收集斑马鱼至1.5ml离心管，每管20条斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入100μl的冷pbs，用s-18ks手持微量电动组织匀浆器将斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，12000
×
g，4℃离心10min，收集上清液于离心管中，使单胺氧化酶测定试剂盒检测上清液中单胺氧化酶活性。
44.采用spss19.0软件统计处理数据，实验数据均用x
±
sd数据表示，用t-检验分析，与正常组相比：
####
p《0.001；用单因素方差分析,与正常组相比：***p《0.005，****p《0.001。
45.由图3可知，盐酸氯吉林组斑马鱼体内单胺氧化酶活性为0.12
±
0.02u/min/ml，与正常组(0.55
±
0.06u/min/ml)相比差异性显著(p《0.001)，表明本次斑马鱼体内单胺氧化酶活性的检测实验有效。
46.鼠李糖乳杆菌e2浓度为1
×
106cfu/ml时，斑马鱼体内单胺氧化酶活性为0.45
±
0.02u/min/ml，与正常组(0.55
±
0.06u/min/ml)相比差异性显著(p《0.005)。另外，罗伊氏乳杆菌c2浓度为1
×
104cfu/ml、1
×
105cfu/ml和1
×
106cfu/ml时，斑马鱼体内单胺氧化酶活性分别为0.44
±
0.03u/min/ml、0.38
±
0.03u/min/ml和0.24
±
0.02u/min/ml，与正常组(0.55
±
0.06u/min/ml)相比差异性显著(p《0.005)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，罗伊氏乳杆菌c2对斑马鱼体内单胺氧化酶的抑制作用均强于鼠李糖乳杆菌e2，具有预防或抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病的潜能。
47.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：

1.一种罗伊氏乳杆菌c2，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)c2，于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.21776，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillusreuteri。2.权利要求1所述的一株罗伊氏乳杆菌c2在制备抑制单胺氧化酶药物中的应用。3.权利要求2所述的应用，所述抑制单胺氧化酶药物用于预防或抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌c2能够显著抑制斑马鱼体内单胺氧化酶的活性。5.一种抑制单胺氧化酶的药物，其特征在于，包括罗伊氏乳杆菌c2菌悬液。

技术总结

本发明公开了一种罗伊氏乳杆菌C2及在制备抑制单胺氧化酶药物中的应用，属于微生物技术领域。罗伊氏乳杆菌C2于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21776，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillusreuteri。罗伊氏乳杆菌C2能够显著抑制斑马鱼体内单胺氧化酶的活性，具备应用于预防或抑郁症、焦虑、帕金森病和阿尔茨海默病的潜能。阿尔茨海默病的潜能。阿尔茨海默病的潜能。