一种基于qPCR技术进行鱼类监测的方法及其应用与流程

一种基于qpcr技术进行鱼类监测的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于qpcr技术进行鱼类监测的方法及其应用。

背景技术：

2.鱼类是水生生态系统中的重要组成部分，研究鱼类的分布情况能够直接反映水生生态系统的状态，尤其在鱼类保护过程中，对保护物种分布的监测尤其重要。传统的鱼类监测技术主要采用形态学检测方法，即通过网捕鱼类对渔获物进行形态鉴定分析。但是，通常渔获物种类不能完全代表水体中鱼类分布情况，且鉴于不同地区的鱼类因环境差异容易形成新的表型，影响研究人员极易错判。同时，这一过程会对鱼体造成损伤，往往耗时费力，可能会伤害到目标物种或者破坏调查点的生态系统。
3.鱼类监测的另一类常用技术是环境dna(edna)监测技术，该方法是指从水、土壤或沉积物等环境样品中提取鱼类dna片段并对其进行pcr扩增、测序和比对，从而鉴定水样中的鱼类多样性。如中国专利cn113564262a公开的鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的pcr引物、试剂或试剂盒和鉴定方法，该方法通过采用该pcr引物对水体中的edna进行pcr扩增，基于高通量测序方法，能够有效地解决水体中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题。但是，该方法采用鱼类通用引物开展环境dna测序分析，在实际使用中会出现假阳性的问题，检测结果与鱼类实际分布情况差距较大，不能直接反映水体中鱼类组成。
4.针对以上现状问题，本领域开发出以qpcr技术作为主要手段，开展区域特定鱼类监测工作的方法，与形态学鉴定方法相比能够避免鱼类反复捕捞带来的生物损伤，与环境dna测序方法相比，提高了测试分析的准确性和实效性。但是，鉴于不同地区鱼类分布的差异化较大，如何提高qpcr技术的可行性及操作性，对于鱼类的监测与保护具有积极的意义。

技术实现要素：

5.因此，本发明立足于克服现有技术的不足，利用分子生物学方法建立一种基于qpcr技术进行鱼类监测的方法及应用，所述方法具有可行性强、耗时短、操作简便、特异性强等优势。
6.为了解决上述问题，本发明所述一种基于qpcr技术鱼类监测的方法，包括以下步骤：
7.(1)采集待测流域内的鱼类样本，进行种类鉴定，并提取所述鱼类样本的dna；
8.(2)采集待测流域的水域样本进行dna提取，并根据目标鱼类的基因设计特异性引物对提取的水域样本dna进行qpcr扩增；
9.(3)对扩增结果进行对比分析，以确定待测水域中是否含有该种类的鱼类物种。
10.具体的，所述步骤(1)中，所述采集步骤包括采集所述鱼类样本的背部肌肉的步骤。
11.具体的，所述步骤(2)中，所述目标鱼类为宽鳍鱲，所述特异性引物包括：
12.上游引物：5'-tccgaagcccaatcaca-3'；
13.下游引物：5'-caggtcctttgggtttc-3'。
14.具体的，所述步骤(2)中，所述目标鱼类为马口鱼，所述特异性引物包括：
15.上游引物：5'-acgaggagcaggcatca-3'；
16.下游引物：5'-gtaggtgtatgttttggttta-3'。
17.具体的，所述步骤(2)中，所述目标鱼类为高体鳑鲏，所述特异性引物包括：
18.上游引物：5'-attaggaacgggcatca-3'；
19.下游引物：5'-cgccgcaatactatcaac-3'。
20.作为可以实施的方式，所述鱼类dna样本提取采用组织基因组dna小量提取试剂盒td325-50。
21.作为可以实施的方式，所述步骤(2)中，所述水域样本dna提取步骤采用细菌/真菌dna小量提取试剂盒td605-50。
22.作为可以实施的方式，所述qpcr扩增采用takara(tb green premix ex taq ii,cat#rr820a)试剂盒。
23.具体的，所述步骤(2)中，所述qpcr扩增步骤的扩增程序为：95℃、1min；95℃、10s；60℃、30s；共40个循环。
24.具体的，所述步骤(2)中，还包括设置内参基因实验组的步骤；
25.所述内参基因的引物包括：
26.上游引物：5'-acggtattgtgaccaactgggacg-3'；
27.下游引物：5'-catggcaggggtgttgaaggtct-3'。
28.具体的，所述步骤(3)中，所述对比分析步骤包括：当内参基因ct值小于25，且检测基因ct值可检出时，表明待测水域样本中包含检测的特定鱼类物种。
29.具体的，所述步骤(1)中，还包括收集所述流域中鱼类物种的基因并构建形成基因库的步骤。
30.本发明还公开了一种基于qpcr技术进行鱼类监测的方法在鱼类物种分步监测及鱼类物种保护领域的应用。
31.本发明所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，通过对水域范围内的鱼类物种进行采集调研的方式，采集区域内鱼类物种的基因，并针对不同的鱼类物种设计特异性引物，并利用特异性引物对环境水样dna进行qpcr扩增，以此确定待测水域的鱼类分布情况。本发明所述方法，通过设计特异性引物，有效避免了近缘种dna难以鉴定、检测误差大、以及假阳性等问题，准确率更高、特异性更强，具有一定的应用价值；同时减少了基因测序的流程，对实验过程进行了简化，缩短了检测时间。
32.本发明所述基于qpcr技术进行特定鱼类监测的方法，与现有捕捞方法和水声学方法相比，该方法采用的分子生物学手段具有特异性更强、对目标生物不造成干扰、样品采集便利等优势，在很大程度上提高了样品检测的可行性。
33.本发明所述基于qpcr技术进行特定鱼类监测的方法，可以通过采集不同水域的鱼类样本进行dna库的构建，进而根据区域物种的分布情况设计特异性引物以及相应的试剂盒类产品，实现对区域水样中鱼类分布情况的监测及保护。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
35.图1为本发明所述鱼类监测的技术流程图；
36.图2为实施例1中所述鱼类的特异性引物的跑胶实验结果图；
37.图3为实施例2中所述鱼类的特异性引物的跑胶实验结果图；
38.图4为实施例3中所述鱼类的特异性引物的跑胶实验结果图。
具体实施方式
39.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
40.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
41.实施例1
42.如图1所示的技术流程图，本实施例所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，包括如下步骤：
43.(1)2022年4月至9月，于北京市清河使用地笼的方式定量采集宽鳍鱲鱼类样本3条，并进行种类鉴定；割取所述鱼类背部肌肉样本，采用组织基因组dna小量提取试剂盒td325-50进行基因提取，并作为实验室分析样品冷藏带回，冷藏温度应保持在4℃以下，其余样品应按照hj 628-2011《生物遗传资源采集技术规范》规定原地放回；收集并保存所述流域中鱼类物种的基因并构建形成基因库。
44.(2)采集清河3个点位(s1，s5，s11)水域样本0.5-1l，冷藏带回实验室。24h内对选取0.45μm混合纤维滤膜对水样进行抽滤处理，保存滤膜，采用细菌/真菌dna小量提取试剂盒td605-50提取水样dna样本，提取好的dna在-20℃条件下保存备用。
45.根据步骤(1)中提取获得的所述宽鳍鱲鱼类线粒体12s基因的可变区域中提取基因组dna，设计宽鳍鱲特异性引物如下：
46.上游引物：5'-tccgaagcccaatcaca-3'；
47.下游引物：5'-caggtcctttgggtttc-3'；
48.根据目标鱼类的基因设计特异性引物对提取的水域样本dna进行qpc r扩增；并设置内参基因实验组引物如下：
49.上游引物：5'-acggtattgtgaccaactgggacg-3'；
50.下游引物：5'-catggcaggggtgttgaaggtct-3'；
51.qpcr扩增采用takara(tb green premix ex taq ii,cat#rr820a)试剂盒；扩增程序为95℃、1min，95℃、10s，60℃、30s，共40个循环，每个样品设置三次重复。对上述扩增产
物进行电泳跑胶，结果见附图2所示，证明本实施例设计引物的特异性。
52.(3)上述结果中，三个点位宽鳍鱲的目的基因ct值可检出，检测平均值分别为12.44、11.67、13.14，且三个点位内参基因ct值均小于25，qpcr实验结果与鱼类调查结果相符合。
53.实施例2
54.如图1所示的技术流程图，本实施例所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，包括如下步骤：
55.(1)2022年4月至9月，于北京市清河使用地笼的方式定量采集马口鱼鱼类样本3条，并进行种类鉴定；割取所述鱼类背部肌肉样本，采用组织基因组dna小量提取试剂盒(td325-50)进行基因提取，并作为实验室分析样品冷藏带回，冷藏温度应保持在4℃以下，其余样品应按照hj628-2011《生物遗传资源采集技术规范》规定原地放回。
56.(2)采集清河3个点位(s1，s5，s11)水域样本0.5-1l，冷藏带回实验室。24h内对选取0.45μm混合纤维滤膜对水样进行抽滤处理，保存滤膜，采用细菌/真菌dna小量提取试剂盒td605-50提取水样dna样本，提取好的dna在-20℃条件下保存备用。
57.根据步骤(1)中提取获得的所述马口鱼线粒体12s基因的可变区域中提取基因组dna，设计马口鱼特异性引物如下：
58.上游引物：5'-acgaggagcaggcatca-3'；
59.下游引物：5'-gtaggtgtatgttttggttta-3'；
60.根据目标鱼类的基因设计特异性引物对提取的水域样本dna进行qpc r扩增；并设置内参基因实验组引物如下：
61.上游引物：5'-acggtattgtgaccaactgggacg-3'；
62.下游引物：5'-catggcaggggtgttgaaggtct-3'；
63.qpcr扩增采用takara(tb green premix ex taq ii,cat#rr820a)试剂盒；扩增程序为95℃、1min，95℃、10s，60℃、30s，共40个循环，每个样品设置三次重复。对上述扩增产物进行电泳跑胶，结果见附图3所示，证明本实施例设计引物的特异性。
64.(3)上述结果中，三个点位马口鱼的目的基因ct值可检出，检测平均值分别为11.56、11.82、12.41，且三个点位内参基因ct值均小于25，qpcr实验结果与鱼类调查结果相符合。
65.实施例3
66.如图1所示的技术流程图，本实施例所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，包括如下步骤：
67.(1)2022年4月至9月，于北京市清河使用地笼的方式定量采集高体鳑鲏鱼类样本3条，并进行种类鉴定；割取所述鱼类背部肌肉样本，采用组织基因组dna小量提取试剂盒(td325-50)进行基因提取，并作为实验室分析样品冷藏带回，冷藏温度应保持在4℃以下，其余样品应按照hj628-2011《生物遗传资源采集技术规范》规定原地放回。
68.(2)采集清河3个点位(s1，s5，s11)水域样本0.5-1l，冷藏带回实验室。24h内对选取0.45μm混合纤维滤膜对水样进行抽滤处理，保存滤膜，采用细菌/真菌dna小量提取试剂盒td605-50提取水样dna样本，提取好的dna在-20℃条件下保存备用。
69.根据步骤(1)中提取获得的所述高体鳑鲏鱼类线粒体12s基因的可变区域中提取
基因组dna，设计高体鳑鲏特异性引物如下：
70.上游引物：5'-attaggaacgggcatca-3'；
71.下游引物：5'-cgccgcaatactatcaac-3'；
72.根据目标鱼类的基因设计特异性引物对提取的水域样本dna进行qpc r扩增；并设置内参基因实验组引物如下：
73.上游引物：5'-acggtattgtgaccaactgggacg-3'；
74.下游引物：5'-catggcaggggtgttgaaggtct-3'；
75.qpcr扩增采用takara(tb green premix ex taq ii,cat#rr820a)试剂盒；扩增程序为95℃、1min，95℃、10s，60℃、30s，共40个循环，每个样品设置三次重复。对上述扩增产物进行电泳跑胶，结果见附图4所示，证明本实施例设计引物的特异性。
76.(3)上述结果中，s5和s11点位高体鳑鲏的目的基因ct值可检出，检测平均值分别为22.86和23.94，s1未检出，且三个点位内参基因ct值均小于25，qpcr实验结果与鱼类调查结果相符合。
77.显然，上述实施例和对比例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：

1.一种基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集待测流域内的鱼类样本，进行种类鉴定，并提取所述鱼类样本的dna；(2)采集待测流域的水域样本进行dna提取，并根据目标鱼类的基因设计特异性引物对提取的水域样本dna进行qpcr扩增；(3)对扩增结果进行对比分析，以确定待测水域中是否含有该种类的鱼类物种。2.根据权利要求1所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述采集步骤包括采集所述鱼类样本的背部肌肉的步骤。3.根据权利要求1或2所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述目标鱼类为宽鳍鱲，所述特异性引物包括：上游引物：5'-tccgaagcccaatcaca-3'；下游引物：5'-caggtcctttgggtttc-3'。4.根据权利要求1或2所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述目标鱼类为马口鱼，所述特异性引物包括：上游引物：5'-acgaggagcaggcatca-3'；下游引物：5'-gtaggtgtatgttttggttta-3'。5.根据权利要求1或2所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述目标鱼类为高体鳑鲏，所述特异性引物包括：上游引物：5'-attaggaacgggcatca-3'；下游引物：5'-cgccgcaatactatcaac-3'。6.根据权利要求1-5任一项所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述qpcr扩增步骤的扩增程序为：95℃、1min；95℃、10s；60℃、30s；共40个循环。7.根据权利要求1-6任一项所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，还包括设置内参基因实验组的步骤；所述内参基因的引物包括：上游引物：5'-acggtattgtgaccaactgggacg-3'；下游引物：5'-catggcaggggtgttgaaggtct-3'。8.根据权利要求1-7任一项所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述对比分析步骤包括：当内参基因ct值小于25，且检测基因ct值可检出时，表明待测水域样本中包含检测的特定鱼类物种。9.根据权利要求1-8任一项所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，还包括收集所述流域中鱼类物种的基因并构建形成基因库的步骤。10.权利要求1-9任一项所述基于qpcr技术进行鱼类监测的方法在鱼类物种分步监测及鱼类物种保护领域的应用。

技术总结

本发明提供了一种基于qPCR技术进行鱼类的监测方法及应用。该方法通过采集待测流域内的鱼类样本，进行种类鉴定；并提取所述鱼类样本的DNA；采集待测流域的水域样本进行DNA提取，并根据目标鱼类的基因设计特异性引物对提取的水域样本DNA进行qPCR扩增；对扩增结果进行对比分析，以确定待测水域中是否含有该种类的鱼类物种。本发明所述方法，通过设计特异性引物，有效避免了近缘种DNA难以鉴定、检测误差大、以及假阳性等问题，准确率更高、特异性更强，具有一定的应用价值；同时减少了基因测序的流程，对实验过程进行了简化，缩短了检测时间。间。间。