模拟胚胎滋养层细胞分化过渡态的细胞亚模型及其应用

1.本发明属于细胞模型技术领域，具体涉及模拟胚胎滋养层细胞分化过渡态的细胞亚模型及其应用。

背景技术：

2.全球不孕不育人已达到1.86亿，8％-12％育龄夫妇将受到影响。中国不孕不育总患病率从2007年的11.9％上升至2011年的15.5％；积极生育人中不孕率达25.0％。辅助生殖技术是目前不孕症的主要手段之一。目前我国年开展辅助生殖周期已达120万且逐年升高；但相应的临床妊娠率和活产率仅为30.0％和28.8％。较低的临床妊娠率主要源于较低的辅助生殖移植后胚胎种植率，各国胚胎种植率都不足50％，且随着年龄增长，胚胎种植率急剧下降，42岁以上种植率约4.5％。胚胎植入能力是影响胚胎种植结果的关键之一。哺乳动物由受精卵发育而来，经过多次分裂分化建立细胞极性形成囊胚，囊胚由滋养外胚层和内细胞团组成。内细胞团会逐步发育成胎儿，滋养外胚层细胞会在囊胚着床时和子宫上皮细胞接触，并相互作用，进一步分化成成熟的滋养层细胞，包括细胞滋养层(ctb)，及其互相融合形成的合胞体滋养层(stb)和分化形成的侵袭性绒毛外滋养层(evt)，并最终形成哺乳动物特有的胎盘组织。胎盘是孕妇与胎儿之间的联系纽带，在维持正常妊娠和胚胎正常发育中起到重要作用。胎盘-滋养层细胞的分化发育异常将影响胚胎植入能力，同时也可导致各种妊娠异常及妊娠疾病，包括胚胎种植失败、流产、先兆子痫、胎儿生长受限等，严重的可致孕妇及胎儿死亡。胎盘的绒毛由外层的stb及内层的ctb组成，ctb负责增殖，并向stb和evt分化，维持细胞数量；evt具有更强的侵袭性，可以侵袭进入子宫蜕膜间质完成胚胎种植，侵入母体螺旋动脉，重塑子宫脉管系统，影响胎儿血供的氧分压。因此围植入期滋养层细胞正常分化发育是胚胎成功种植、建立胎盘、保证后续胎儿成长发育的关键步骤之一。限于生殖医学伦理因素，人类胚胎着床具体机制的研究模型及其稀少，因模型样本数据的确少，目前尚缺乏有效的系统性研究，特别是针对着床的调控因子知之甚少，因此临床中也没有有效的胚胎评价标准、对胚胎种植失败尚缺乏有效的分析和干预手段，从而导致了较低的辅助生殖胚胎成功率。
3.目前的研究仅已知ctb会向stb和evt进行分化，但其中的分化过程是未知的，并且针对ctb向evt分化研究大多应用永生化的滋养癌细胞系，如jeg-3细胞系、htr-8/svneo细胞系、bewo细胞系等或者滋养层干细胞系作为研究模型。癌细胞系缺少分化能力，只能检测因子对evt细胞增殖、侵袭等能力的影响，而无法对具体的分化过程有进一步的研究。滋养干细胞系缺少整个囊胚环境和子宫内膜相互作用所形成的研究模型，不能最大程度上模拟人体内着床的过程和滋养细胞分化的过程。因此，本发明通过人囊胚和人子宫内膜细胞共培养体系最大程度上模拟体内的着床过程和滋养层细胞分化过程，发现了ctb向evt分化过程中的两个中间过渡态细胞亚，并明确了这两个亚的基因表达特征，将这两个过渡态亚作为重要研究对象，进一步应用于ctb向evt分化调控的研究。
4.而本发明提供的细胞模型，最大程度上模拟了人体内胚胎着床的过程，并精确靶
向到了细胞滋养层向绒毛外滋养层细胞分化时的过渡状态，以此为模型，应用于细胞滋养层向绒毛外滋养层细胞分化的研究。
5.与本发明最相近似的实现方案为公开号为cn115261336a的发明专利，人源胚外滋养层细胞模型在病毒高效制备、检测和药物筛选中的应用。该发明通过建立人源胚外滋养层细胞模型的建立，并应用于病毒高效制备、检测和药物筛选中。本发明提供了细胞滋养层(ctb)分化为绒毛外滋养层(evt)时过渡态亚模型的鉴定和应用方法，通过应用此细胞模型研究evt分化的调控因子，可以更进一步补充扩展滋养层细胞的分化手段、提供滋养层细胞和胎盘质量的检测标准，用于提高胚胎植入效率、辅助生殖成功率。

技术实现要素：

6.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供模拟胚胎滋养层细胞分化过渡态的细胞亚模型及其应用。可用于胚胎滋养层细胞向绒毛外滋养细胞分化过渡态细胞亚的鉴定。本发明提出了新的系统性研究细胞滋养层分化为绒毛外滋养层的模型，通过应用该细胞亚模型，可以进一步研究人类胚胎着床机制，到调控着床的分子靶标，并在模型上进行相应的验证。
7.为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
8.一方面，本发明提供了一种模拟胚胎滋养层细胞分化过渡态的细胞亚模型，其特征在于，所述细胞亚模型为子宫内膜细胞与围植入期胚胎共培养模型。
9.第二方面，本发明提供了所述的细胞亚模型的建立方法，包括以下步骤：
10.(1)收集临床子宫内膜样本，放入含1％青霉素-链霉素的dmem/f12培养基中，利用胶原酶i、胶原酶ⅳ和dna酶消化组织；
11.(2)用筛网过滤去除未消化的组织碎片，过滤后的悬液离心，得到子宫内膜细胞沉淀；
12.(3)子宫内膜细胞沉淀用含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的dmem/f12培养液吹打均匀，计数，接种于培养皿中，放置在细胞培养箱中进行培养，传代继续培养时换液成ivc1培养液；
13.(4)取第5-6天人类胚胎，削薄胚胎透明带，将完全孵出的囊胚放入上述铺有子宫内膜细胞的孔板中，每孔放入1个囊胚，放置于培养箱中进行培养；待孔中胚胎稳定黏附在底部时，移除ivc1培养基并替换成ivc2培养基继续培养。
14.第三方面，本发明提供了所述的细胞亚模型在模拟体内胚胎着床过程和滋养层细胞分化过程中的应用。
15.第四方面，本发明提供了两种细胞滋养层分化为绒毛外滋养层细胞时的过渡态细胞亚，通过所述的细胞亚模型鉴定得到。
16.所述的过渡态细胞亚，包括过渡态1亚和过渡态2亚，其中过渡态1亚为细胞滋养层开始分化的过渡态，过渡态2亚为细胞滋养层向绒毛外滋养层细胞分化的过渡态。
17.第五方面，本发明提供了所述的两种过渡态细胞亚的鉴定方法，包括以下步骤：
18.(1)建立子宫内膜细胞与围植入期胚胎共培养模型，消化成单细胞，挑取单细胞进行smart-seq2单细胞转录组建库，获得了共培养模型中第7至10天的胚胎单细胞、单独培养
的第6天及第7天胚胎单细胞和子宫内膜细胞的建库测序数据；
19.(2)通过对所获得的数据进行单细胞聚类并分析获得过渡态1亚和过渡态2亚。
20.所述的两种过渡态细胞亚在滋养层细胞分化中的应用。
21.所述的两种过渡态细胞亚在寻新的调控因子靶向调节细胞滋养层分化为绒毛外滋养层中的应用。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.本发明发现了两个植入期胚胎细胞滋养层向绒毛外滋养层细胞分化过程中的过渡态细胞亚，表征了这个过渡态细胞亚的分子特征，可用于鉴定这个细胞亚，并为研究胚胎着床过程和早期胎盘的发育，以及相关疾病的机制等提供一个新的研究对象。
24.本发明提供的细胞模型，最大程度上模拟了人体内胚胎着床的过程，并精确靶向到了细胞滋养层向绒毛外滋养层细胞分化时的过渡状态，以此为模型，应用于细胞滋养层向绒毛外滋养层细胞分化的研究。
附图说明
25.图1为单细胞聚类分析；
26.图2为过渡态细胞亚go分析；
27.图3为各亚细胞间通讯分析；
28.图4为细胞分化拟时序轨迹分析。
具体实施方式
29.以下将通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
30.实施例1：
31.通过在体外人胚胎培养体系中加入人子宫内膜细胞，建立了子宫内膜细胞与围植入期胚胎共培养体系，之后将胚胎-子宫内膜细胞共培养模型消化成单细胞，并挑取了单细胞进行smart-seq2单细胞转录组建库，获得了围植入期滋养层细胞建库测序数据。对所获得的数据进行单细胞聚类分析，将这些细胞分成相应细胞亚，根据ctb,stb,evt的相应特异性基因如cdx2、itga5、cyp19a1等的表达，推断出这三个滋养细胞亚；其余亚根据聚类树，判断出ctb向evt分化过程中的过渡态亚。提取过渡态亚的基因表达模式进行分析，横向和其他细胞亚的基因表达模式进行比较，纵向和各时间点样本表达模式进行比较，可以得到调控ctb向evt分化的新靶标，并针对新靶标在模型中进一步研究分析ctb向evt分化的动态过程。
32.1)植入期胚胎共培养模型的建立
33.收集临床子宫内膜样本，无菌生理盐水冲洗后，放入4℃预冷的含1％青霉素-链霉素的dmem/f12培养基中，2h内转移至洁净超净台中。超净台中用无菌pbs洗涤3次，去除样本中的血块和粘液，用无菌眼科剪将其剪碎并转移至15ml离心管中。配置含1％胶原酶i、胶原酶ⅳ和0.05％dna酶的消化液，并加入离心管充分混匀，37℃水浴锅中消化30分钟，期间反复摇动离心管使离心管充分混匀、均匀受热。用200目筛网过滤去除未消化的组织碎片，过滤后的悬液1000转每分钟离心5分钟，去除上清消化液，用1ml含青霉素-链霉素的dmem/f12
培养液重悬细胞沉淀。将重悬液继续1000转每分钟离心5分钟，去除上清，洗涤细胞沉淀。所得细胞沉淀用含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的dmem/f12培养液吹打均匀，计数，按5*106的密度接种于10cm培养皿中，放置在37℃、5％co2细胞培养箱中进行培养，之后传代至4孔板培养板继续培养，并换液成ivc1培养液。取第5-6天人类胚胎，通过激光辅助孵化的方法削薄胚胎透明带。将完全孵出的囊胚放入铺有子宫内膜细胞的4孔板中，每孔放入1个囊胚，放置于37℃培养箱中进行培养。待孔中胚胎稳定黏附在底部时，移除ivc1培养基并替换成ivc2培养基继续37℃培养。
34.2)植入期胚胎滋养单细胞的采集：消化为单细胞然后胚胎转移笔吸取的方法
35.胚胎-内膜共培养模型吸去ivc1或ivc2培养基，pbs清洗去除剩余培养基，加入0.25％胰酶溶液，轻微震荡，此时胚胎会从培养板底部脱落，在显微镜下用手持胚胎转移笔将胚胎转移至另一滴胰酶溶液液滴中，37℃消化5分钟，期间用胚胎转移笔反复吹打，分散胚胎细胞。消化完的单细胞转入含血清的培养基中终止消化，利用胚胎转移笔吸取单个细胞至pbs液滴中清洗干净。最后将含有单个细胞的液体(总体积小于0.3μl)放入含裂解液的pcr小管中，并按smart-seq2建库方法完成后续建库操作。
36.3)植入期胚胎滋养细胞的单细胞转录组测序及分析
37.使用smart-seq2单细胞测序方案。将细胞提取到裂解缓冲液中以释放总rna，并使用oligo-dt30vn引物和superscript iii逆转录酶将其转化为cdna，并使用kapa hifi hotstart readymix进一步预扩增；使用ampure xp珠纯化cdna产物，并使用nextera标记进行后续标记反应。调整cdna文库的浓度后制备为文库，利用高通量测序仪测序。
38.对原始rna测序数据，使用trimmatic软件进行数据整理，以去除测序适配器、低质量读数和碱基。在修整和质量控制之后，使用star将测序读长与人类基因组(grch38)进行比对。用featurecounts软件计算基因表达水平。
39.使用seurat v3 r包对单细胞转录组数据进行分析，在校正批次效应后。使用pca分析的“findvariablefeatures”功能识别2000个可变基因。基于“elbowplot”和“jackstraw”函数的结果，使用“findneighbors”和“findclusters”函数识别不同细胞亚。再利用”findmarkers”函数计算不同细胞亚的高表达基因，并进行基因富集分析，从而表征两个过渡态细胞亚的分子表达特征。
40.4)过渡态细胞亚的鉴定
41.本发明通过在体外人胚胎培养体系中加入人子宫内膜细胞，建立和鉴定了子宫内膜细胞与围植入期胚胎共培养体系，最大程度上模拟了人体内围植入期滋养层细胞的分化和发育过程。之后将胚胎-子宫内膜细胞共培养模型消化成单细胞，并挑取了单细胞进行smart-seq2单细胞转录组建库，获得了共培养体系中第7天至第10天的胚胎单细胞、单独培养的第6天及第7天胚胎单细胞和子宫内膜细胞的建库测序数据。
42.如图1所示，通过对所获得的数据进行单细胞聚类，如图1a鉴定出植入前后胚胎滋养细胞的不同亚，包括两个过渡态细胞亚。这些细胞被分为6个细胞亚，根据ctb,stb,evt的相应特异性基因如cdx2、itga5、cyp19a1等的表达，推断出三个滋养细胞亚。如图1d显示特异性表达基因itga5鉴定evt细胞亚；如图1e显示特异性表达基因cdx2鉴定ctb细胞亚；如图1f显示特异性表达基因cyp19a1鉴定stb细胞亚。如图1c所示为第6天至第10天各时期样本对应的细胞亚，其中第6天样本均为ctb细胞，而在ctb分化过程中存
在两个过渡态亚，这两个亚主要来源于第7天和部分第8天的共培养样本，提示这个时段是滋养细胞谱系分化的命运决定时期。如图1b中细胞亚聚类树可见过渡态2亚和evt细胞亚高度相近，ctb与过渡态1亚相近，提示两种过渡态细胞亚在ctb分化过程，尤其在evt细胞形成过程中的潜在关系。
43.如图2通过基因本体分析(gene ontology，go分析)，两个过渡态细胞亚相比ctb细胞，过渡态1亚在胎盘发育、氧化呼吸活性方面有显著上升，过渡态2亚在上皮样细胞增殖、细胞迁移方面能力显著提升。通过细胞间通讯分析，如图3所示ctb细胞与其他各类细胞具有最强的交互关系，过渡态1亚的交互强度高于过渡态2亚，过渡态2亚主要和evt亚有较高的交互强度和较高的交互数量。通过细胞分化拟时轨迹分析，如图4所示，不同聚类得到的细胞亚的拟时轨迹中可见ctb完全处于分化的最起始端，过渡态1亚也主要位于起始端。过渡态2亚已经接近分支点，提示其接近发生分化的状态；evt细胞亚中包括了仍在分化以及分化完成的细胞，同时stb细胞完全处于分化终末端。对应各时期样本分布发现，细胞发生实质性分化(分支点1)主要发生在第8天，其包括了各分化阶段的细胞类型，并且过渡态2亚在其中表现明显。
44.进一步证明了过渡态2亚是ctb向evt细胞分化的重要过渡态状态，而过渡态1是ctb开始分化的重要过渡状态。过渡态2亚的基因表达模式将极大的影响evt细胞的分化，而过渡态1亚的基因表达模式可以表征ctb的分化功能和状态。因此可以将过渡态1和2细胞亚作为一个新的重要研究模型分析ctb向evt细胞分化的过程。
45.实施例2：过渡态细胞亚的应用
46.过渡态1和2亚的基因表达特征，其中过渡态1亚的基因表达特征如下表1所示，过渡态2亚的基因表达特征如下表2所示。
47.表1过渡态1亚基因表达特征
48.[0049][0050]
表2过渡态2亚基因表达特征
[0051]
基因名称平均log2fc值校正p值fabp51.4357135132.58e-24rps4y11.0597012971.48e-18ddx3y0.877298422.32e-19hsp90ab10.7609093652.26e-15peg100.7292811270.000392dnmt3b0.7276693164.59e-08c1qbp0.7089794838.68e-09hspe10.7038064041.37e-15npm10.6968656537.42e-11psmc40.6915578863.93e-14hspd10.6735888888.86e-07set0.6683142372.28e-14fkbp40.66655841.11e-12anp32e0.6647011312.10e-13mrfap10.6514468642.79e-12
[0052]
对过渡态2细胞亚与其他细胞亚的基因表达模式进行对比，可以发现基因fabp5、rps4y1表达差异倍数较大，分别为1.435713513和1.059701297，并及其显著，校正p值均小于0.001说明fabp5、rps4y1为过渡态2亚的基因表达特征。按同样方法表征过渡态1细胞亚可以发现fscn1、nlrp7、ctsv、calm2、pim1、hspd1、nlrp2、hand1在过渡态1亚中表达差异倍数较大，均大于1.3。而在基因表达特征中，可以寻新的调控因子靶向调节ctb分化为evt。
[0053]
通过靶向该因子在人类围植入期胚胎滋养层中的表达模式，特别是在细胞滋养层向绒毛外滋养层细胞分化过渡态细胞中的表达变化。可以进一步研究人类胚胎着床机制，
丰富滋养层细胞分化手段；同时，将从基因分子层面提供人类胚胎和胎盘质量评价的新标准，方便临床通过检测胚胎中特征基因表达情况进行最佳移植胚胎的筛选，分析流产胎盘的具体流产原因并针对性处理，最终可能提高胚胎种植率、提高辅助生殖成功率、提高妊娠率等服务临床。

技术特征：

1.一种模拟胚胎滋养层细胞分化过渡态的细胞亚模型，其特征在于，所述细胞亚模型为子宫内膜细胞与围植入期胚胎共培养模型。2.如权利要求1所述的细胞亚模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)收集临床子宫内膜样本，放入含青霉素-链霉素的dmem/f12培养基中，利用胶原酶i、胶原酶ⅳ和dna酶消化组织；(2)用筛网过滤去除未消化的组织碎片，过滤后的悬液离心，得到子宫内膜细胞沉淀；(3)子宫内膜细胞沉淀用含胎牛血清和青霉素-链霉素的dmem/f12培养液吹打均匀，计数，接种于培养皿中，放置在细胞培养箱中进行培养，传代继续培养时换液成ivc1培养液；(4)取第5-6天人类胚胎，削薄胚胎透明带，将完全孵出的囊胚放入上述铺有子宫内膜细胞的孔板中，每孔放入1个囊胚，放置于培养箱中进行培养；待孔中胚胎稳定黏附在底部时，移除ivc1培养基并替换成ivc2培养基继续培养。3.如权利要求1所述的细胞亚模型在模拟体内胚胎着床过程和滋养层细胞分化过程中的应用。4.两种细胞滋养层分化为绒毛外滋养层细胞时的过渡态细胞亚，其特征在于，通过如权利要求1所述的细胞亚模型鉴定得到。5.如权利要求4所述的过渡态细胞亚，其特征在于，包括过渡态1亚和过渡态2亚，其中过渡态1亚为细胞滋养层开始分化的过渡态，过渡态2亚为细胞滋养层向绒毛外滋养层细胞分化的过渡态。6.如权利要求4或5所述的两种过渡态细胞亚的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)建立子宫内膜细胞与围植入期胚胎共培养模型，消化成单细胞，挑取单细胞进行smart-seq2单细胞转录组建库，获得了共培养模型中的胚胎单细胞、单独培养的胚胎单细胞和子宫内膜细胞的建库测序数据；(2)通过对所获得的数据进行单细胞聚类并分析获得过渡态1亚和过渡态2亚。7.如权利要求4或5所述的两种过渡态细胞亚在滋养层细胞分化中的应用。8.如权利要求4或5所述的两种过渡态细胞亚在寻新的调控因子靶向调节细胞滋养层分化为绒毛外滋养层中的应用。

技术总结

本发明属于细胞模型技术领域，具体涉及模拟胚胎滋养层细胞分化过渡态的细胞亚模型及其应用。一种模拟胚胎滋养层细胞分化过渡态的细胞亚模型，所述细胞模型为子宫内膜细胞与围植入期胚胎共培养模型。两种细胞滋养层分化为绒毛外滋养层细胞时的过渡态细胞亚，通过所述的细胞亚模型鉴定得到。本发明发现了两个植入期胚胎细胞滋养层向绒毛外滋养层细胞分化过程中的过渡态细胞亚，表征了这个过渡态细胞亚的分子特征，可用于鉴定这个细胞亚，并为研究胚胎着床过程和早期胎盘的发育，以及相关疾病的机制等提供一个新的研究对象。象。象。