一株表达ASFVP30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用

一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒及其构建方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒及其构建方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术：

2.日本脑炎(japanese encephalitis，je)是由日本脑炎病毒(japanese encephalitis virus，jev)引起的一种以人中枢神经系统疾病与猪繁殖障碍性疾病为特征的人兽共患病。该病主要通过蚊子的叮咬进行传播，猪是jev最重要的扩增宿主与储存宿主，猪感染jev后会产生高滴度的病毒血症，当蚊子吸食猪的血液后，可将病毒进一步传播给人类或猪。jev感染妊娠的母猪后，可引发流产、产生死胎或木乃伊胎，感染公猪后则引起睾丸炎、单侧睾丸肿大而不育，这给我国养猪业的持续发展造成严重的危害。
3.目前，商品化的疫苗接种仍是作为预防和控制jev感染的主要方法，包括传统的灭活病毒(p3毒株和hw1毒株)疫苗与减毒活病毒(sa14-14-2毒株)疫苗。然而，这些疫苗的制苗用毒株均是来源于基因iii型(giii)，而目前我国乃至整个亚洲地区主要是以gi型jev毒株流行为主，但当前尚无针对gi型毒株来源的疫苗。此外，现有的商品化疫苗对gi型毒株的保护效果并不理想，这使得gi型jev具有更大的危害性。
4.非洲猪瘟(african swine fever)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病。非洲猪瘟病程短、发病急、感染性强，可以感染任何种类和年龄段的家猪和野猪，能使生猪的患病率和死亡率达到100％。自2018年8月我国首次在辽宁省沈阳市发现非洲猪瘟疫情后，疫情迅速蔓延至全国23个省份，对我国养猪业造成了极其严重的经济损失。目前国内还还尚无针对asfv的疫苗，尽管一些国外的科学家已经对外公布非洲猪瘟疫苗研究生产成果，但其安全性与有效性仍值得进一步去评价。
5.asfv的p30蛋白是一种很重要的结构蛋白，有很强的免疫原性，能诱导机体产生中和抗体。本研究利用反向遗传学技术，通过在gi型jev 5
′
utr与c基因间引起asfv的p30基因，获得表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒。该重组病毒在制备一种既能抗gi型jev、又能抗asfv的疫苗中具有广阔的应用价值。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒及其构建方法与应用。
7.本发明的目的是这样实现的：一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒的构建方法，其特征是：包括如下步骤：
8.(1)、携带asfv p30蛋白基因的gi型日本脑炎病毒全长cdna感染性克隆的构建；
9.将asfv p30蛋白基因克隆入上游设置t7启动子的gi型日本脑炎病毒的cdna感染
性克隆质粒pok-rgi中，从而构建携带有asfv p30蛋白基因的重组病毒基因组cdna；具体步骤：
10.构建asfv p30蛋白基因上游携带有日本脑炎病毒c基因前102个碱基序列以及下游含有t2a序列的基因组片段f2，基因组片段f2由人工合成，其序列为seq id no.2；
11.以质粒pok-rgi为模板利用两对引物f1-f与f1-r以及f3-f与f3-r，扩增出基因组片段f1与f3，f1与f3序列为seq id no.1与seq id no.3；其中：
12.f1-f引物为：ggcggagcctatggaaaaacggctt；
13.f1-r引物为：ctggttttttagtcatggttgttcttccgttctaaaaaa；
14.f3-f引物为：gaatcccggcccttccgggatgaccaagaagccaggaggcccg；
15.f3-r引物为：ctttcccgaaaagtccacatccatttccc；
16.利用限制性内切酶not i和sac ii对感染性克隆载体pok-rgi进行酶切处理，回收酶切后的载体，相邻dna片段间有20～30bp的同源序列，将基因片段f1，f2，f3与用not i和sac ii酶处理的线性化感染性克隆载体pok-rgi进行等比例混合，并利用neb gibson assembly重组酶进行同源重组；随后，转化大肠杆菌top 10中，挑取单克隆菌落进行扩增与质粒提取，鉴定并测序正确的质粒命名为pok-rgi-p30；
17.(2)、重组病毒的拯救；
18.用限制性内切酶sal i将质粒pok-rgi-p30进行线性化处理后；利用t7体外转录试剂盒mmessage mmachine t7 transcription kit，以线性化质粒pok-rgi-p30为模板，体外转录获重组病毒的基因组rna全长；将重组病毒rna利用转染试剂lipofectamin messengermax转染至bhk-21细胞中，待出现典型细胞病变，获得拯救的rgi-p30重组病毒。
19.步骤(1)中，所述的gi型日本脑炎病毒的cdna感染性克隆质粒pok-rgi，序列如seq id no.4所示。
20.步骤(2)中，所述的rgi-p30重组病毒，其基因组序列如seq id no.5所示。
21.利用所述的构建方法构建的一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒。
22.所述的构建方法构建的表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒在制备疫苗中的应用。
23.本发明方法先进科学，通过本发明，本发明的目的在于提供通过上述构建方法得到的表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒。确定上述的重组病毒的遗传稳定性，携带p30蛋白基因的重组病毒能够稳定传代并表达asfv的p30蛋白。还提供了表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒的应用。
24.本发明具有以下优点和效果：
25.(1)本发明提供了一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒的感染性克隆构建方法，构建方法采用了同源重组的技术手段，方法高效快捷。从研发目的看，有了这个重组病毒的平台，可以人为地对病毒基因组进行精准改造，快速获得到能在特定位点插入外源基因的jev重组质粒。可利用该平台开发抗gi型jev及其它传染性猪病的疫苗。
26.(2)本发明获得一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒，可作为研制能同时抵抗gi型jev和asfv感染的疫苗候选株，填补了国内外研究的空白。
27.(3)本发明构建的重组毒具有遗传稳定性，携带外源基因的重组病毒能够连续传代，且高效的表达asfv p30蛋白。
28.本发明公开了一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒及其构建方法与应用，本发明利用同源重组技术将asfv p30蛋白基因克隆入上游设置t7启动子的gi型日本脑炎病毒基因组中的5
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utr与c基因之间；p30蛋白基因的上游携带有日本脑炎病毒c基因的前102个碱基序列，保证了重组病毒的稳定；p30蛋白基因的下游含有t2a序列，保证了asfv p30蛋白能够被正确的剪切。获得重组病毒的基因组全长cdna后，利用t7启动子进行体外转录，获得病毒rna并转染bhk-21细胞，待细胞出现典型的细胞病变时，收集细胞上清即可获得表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒。该重组病毒具有遗传稳定型，能够稳定、高效的表达asfv p30蛋白。本发明提供的构建方法可快速获得含有asfv和gi型jev免疫原的重组病毒，从而为开发多效价疫苗奠定基础。
附图说明
29.图1为携带asfv p30基因的重组病毒cdna感染性克隆构建策略示意图。
30.图2a为rna转染后细胞病变图。
31.图2b为亲本毒yz-1与重组毒rgi-p30的间接免疫荧光鉴定。
32.图2c为亲本毒yz-1与重组毒rgi-p30感染细胞后的western blot验证图。
33.图3为重组病毒rgi-p30与亲本病毒yz-1的多步生长曲线图。
34.图4a为不同代次(p1、p5、p10)重组病毒中的p30基因rt-pcr检测图。
35.图4b为不同代次(p1、p5、p10)重组病毒感染bhk-21细胞后p30蛋白的间接免疫荧光验证图。
具体实施方式
36.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制详细说明。
37.以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
38.在本发明实施例中，携带有gi型jev毒株yz-1(genbank accession number:mz540901)基因组全长的cdna感染性克隆质粒pok-rgi，bhk-21细胞系以及感染非洲猪瘟病毒的猪阳性血清均由本实验实验室前期构建与保存。
39.在本发明实施例中，使用的其他试剂：转染试剂lipofectamin messengermax、mmessage mmachine
tm t7体外转录试剂盒均购自赛默飞世尔科技；同源重组酶nebuilder hifi dna assembly master mix、pcr酶q5 high-fidelity dna polymerase、dna限制性核酸内切酶(not i,sal i与sac ii)、hrp标价的羊抗兔二抗、hrp标价的羊抗猪二抗，均购自于new england biolabs；jev ns3抗体(兔源)购自于genetex；alexa fluor 647-conjugated affinipure goat anti-rabbit igg(h+l)、alexa fluor 488-conjugated affinipure goat anti-pig igg(h+l)购自jackson immune research inc；dapi染料购自于索莱宝生物科技有限公司；引物与基因合成于南京金斯瑞生物科技有限公司。
40.实施例1：表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒的cdna感染性克隆构建构建策略如图1所示。
41.携带有gi型jev yz-1株(genbank accession number:mz540901)基因组全长的cdna感染性克隆质粒pok-rgi，利用限制性内切酶not i与sac ii进行双酶切处理。反应体系均为：质粒pok-rgi,2μg；10
×
reaction buffer，2μl；限制性内切酶not i，1μl；限制性内切酶sac ii，1μl；nuclease-free water，补充至20μl。反应条件为：37℃，2h。酶切结束后，利用核酸电泳进行片段的分离，胶回收酶切后的大片段。
42.根据gi型亲本毒yz-1株(genbank accession number:mz540901)的基因组序列，设计两对引物(f1-f与f1-r以及f3-f与f3-r)(表1)，以质粒pok-rgi为模板，扩增出基因片段f1与f3。pcr的反应体系均为：5
×
reaction buffer，10μl；10mm dntps，1μl；10μm forward primer，2.5μl；10μm reverse primer，2.5μl；template dna，0.5μl；q5 high-fidelity dna polymerases，0.5μl；nuclease-free water，33μl。扩增条件为：98℃30s，98℃15s，58℃15s，72℃30s，72℃10min，4℃10min，30个循环。
43.f1片段的5
′
端，f3片段的3
′
端分别与酶切后的载体pok-rgi具有同源臂序列。片段f2(seq id no.2)由人工合成，与片段f1，f2具有同源臂序列。将酶切后的载体质粒pok12-rgi，与f1，f2，f3片段进行同源重组。反应体系为：f1，f2，f3片段各100ng；线性化载体pok12-rgi 100ng；gibson assembly master mix(2
×
)，5μl；deionized h2o补充至10μl。反应条件为：50℃50min，4℃10min。将重组产物取2μl转化至感受态大肠杆菌top 10中，将转化后的大肠杆菌涂于卡那(k
+
)抗性的lb平板，将平板放于26℃培养箱中培养48h后，挑取单菌落进行pcr鉴定，鉴定为阳性的克隆进行质粒的提取与测序，测序正确的克隆命名为pok-rgi-p30。
44.表1.引物列表
[0045][0046]
实施例2：表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒的拯救与生物学特性分析
[0047]
2.1重组病毒的拯救
[0048]
利用体外转录技术获得重组病毒基因组rna全长，通过病毒rna转染bhk-21细胞进行病毒的拯救。利用限制性内切酶sal i，将实施例1中获得的重组病毒质粒pok-rgi-p30进行线性化处理，并回收产物。以线性化质粒pok-rgi-p30为模板，利用mmessage mmachine
tm t7体外转录试剂盒获得重组病毒的基因组全长。反应体系为：线性化载体，1000ng；2
×
ntp/cap，10μl；10
×
reaction buffer，2μl；enzyme mix，2μl；nuclease-free water补充至20μl。扩增条件为：37℃，2h；加入2μl turbo dnase，37℃反应15min。
[0049]
将bhk-21细胞提前接种于6孔板中，当细胞密度为60％～80％时，将转录获得的重组病毒rna利用转染试剂lipofectamin messengermax转染至bhk-21细胞中。待转染36h时，转染了重组病毒基因组的bhk-21细胞开始变圆、皱缩，出现典型的细胞病变(图2a)，收集病变的细胞上清即为拯救的病毒，并命名rgi-p30，为p0代病毒。
[0050]
2.2重组病毒的验证
[0051]
拯救的p0代重组病毒rgi-p30利用间接免疫荧光试验(ifa)与western blot进行鉴定。将拯救的p0代毒rgi-p30及其亲本病毒rgi感染bhk-21细胞。感染24h后，弃掉细胞上清，细胞则利用4％多聚甲醛进行固定。细胞在室温条件下固定30min后，弃掉固定液并利用pbs洗涤细胞3遍，加入细胞封闭液(含1％bsa的pbs溶液)对细胞进行室温封闭1h，加入针对jev ns3的兔源抗体(genetex，1：500倍稀释)与asfv的阳性血清(1：500倍稀释)，在室温下作用1h后用pbs洗涤细胞3次，并加入1∶500稀释的alexa fluor 647-conjugated affinipure goat anti-rabbit igg(h+l)、alexa fluor 488-conjugated affinipure goat anti-pig igg(h+l)，于室温中避光作用1h，用pbs洗涤细胞3次后，细胞核利用dap进行染10min，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。结果显示感染重组病毒(rgi-p30)与亲本毒(rgi)的bhk-21细胞均可看见明显的红荧光，表明病毒成功拯救，且感染重组病毒(rgi-p30)组可见明显的绿荧光，表明重组病毒感染细胞后可成功表达asfv p30细胞(图2b)。
[0052]
进一步我们利用western blot进行验证，将病毒rgi-p30与yz-1感染bhk-21细胞24h后收集细胞样本，将细胞样本进行sds-page电泳及蛋白质电转移(转膜)。蛋白膜在含5％w/v脱脂奶粉的pbs缓冲液中37℃封闭2h，随后利用兔抗ns3抗体(1:1000)、asfv阳性血清(1：2000)进行4℃孵育过夜；孵育后，用pbst缓冲液洗涤膜3次后，与hrp标记山羊抗猪igg与山羊抗兔igg
[0053]
于室温下孵育1h，用pbst洗涤3次后，用化学发光检测试剂盒检测。结果显示感染重组病毒(rgi-p30)与亲本毒(yz-1)的bhk-21细胞中可见明显的ns3蛋白条带(图2c)，且重组病毒rgi-p30感染的bhk-21细胞中可见明显的asfv p30蛋白条带(图2c)。
[0054]
2.3重组毒rgi-p30的生长动力学分析
[0055]
分析比较重组病毒rgi-p30与亲本毒yz-1的生长动力学。bhk-21细胞提前培养在24孔板中，当细胞长满至单层细胞时，将实施例1中拯救的rgi-p30与亲本毒yz-1分别以0.01moi的剂量接种于bhk-21细胞，37℃培养箱中孵育2h后，弃掉细胞上清，加入含有2％fbs的新鲜培养基继续培养。在病毒感染后24h、36h、48h、60h、72h后分别收取细胞上清，细胞上清于4℃，12000rpm离心10min去除细胞杂质。随后，将细胞上清进行10倍梯度稀释，将稀释好的病毒液加入到长满bhk-21单侧细胞细胞的96孔板中，每孔加入100μl，各稀释度的病毒设8个重复，细胞继续在37℃培养箱中培养。感染后每天观察细胞的病变程度，待感染5～6天后记录细胞的病变孔数并按照reed-muench方法计算病毒的tcid
50
，绘制病毒的多步生长曲线。结果表明，rgi-p30在bhk-21细胞中相比于亲本病毒yz-1的复制能力更低(图3)。
[0056]
实施例3：重组毒rgi-p30的遗传稳定性分析
[0057]
将实施案例1中的重组病毒rgi-p30 p0代病毒在bhk-21细胞中进行连续传代，以分析p30基因在重组病毒基因组中的遗传稳定性以及在bhk-21细胞中的表达情况。bhk-21细胞提前培养于6孔板中，将拯救的p0代重组病毒以0.1moi的剂量感染bhk-21细胞。在感染36h后收取细胞样本与病毒上清，并定义为p1，之后将100μl p1代病毒液加入到bhk-21细胞中再次培养(定义为p2)。经过10轮类似的传代后，收取p1代次、p5代次、p10代次的细胞上清与细胞样本。对p1、p5、p10代次的病毒进行rna的提取，逆转录后利用利用引物(f:ccccgcgtattcccactagtgg；r:gcgtcaatgagtgttccaagttc)扩增包含p30基因的病毒基因组区域。结果显示不同代次间的rt-pcr产物的大小一致，测序后确认病毒一直稳定携带p30基
因，不发生外源基因的缺失或突变(图4a)。同时，将不同代次病毒感染的细胞进行间接免疫荧光验证，结果在不同代次病毒(p1，p5，p10)感染细胞后，可成功表达asfv p30蛋白(图4b)，表明外源基因p30在病毒的增殖传代过程中保持遗传稳定型，并能够稳定表达。
[0058]
seq id no.1:
[0059]
ggcggagcctatggaaaaacggctttggcggccgctaatacgactcactataggagaagtttatctgtgtgaacttcttggcttagtatcgttgagaagaatcgagagattagtgcagtttaaacagttttttagaacggaagaacaaccatgactaaaaaaccag
[0060]
seq id no.2：
[0061]
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[0062]
seq id no.3：
[0063]
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[0064]
seq id no.4：
[0065]
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技术特征：

1.一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒的构建方法，其特征是：包括如下步骤：（1）、携带asfv p30蛋白基因的gi型日本脑炎病毒全长cdna感染性克隆的构建；将asfv p30蛋白基因克隆入上游设置t7启动子的gi型日本脑炎病毒的cdna感染性克隆质粒pok-rgi中，从而构建携带有asfv p30蛋白基因的重组病毒基因组cdna；具体步骤：构建asfv p30蛋白基因上游携带有日本脑炎病毒c基因前102个碱基序列以及下游含有t2a序列的基因组片段f2，基因组片段f2由人工合成，其序列为seq id no.2；以质粒pok-rgi为模板利用两对引物f1-f与f1-r以及f3-f与f3-r，扩增出基因组片段f1与f3，f1与f3序列为seq id no.1与seq id no.3；其中：f1-f引物为：ggcggagcctatggaaaaacggctt；f1-r引物为：ctggttttttagtcatggttgttcttccgttctaaaaaa；f3-f引物为：gaatcccggcccttccgggatgaccaagaagccaggaggcccg；f3-r引物为：ctttcccgaaaagtccacatccatttccc；利用限制性内切酶not i和sac ii对感染性克隆载体pok-rgi进行酶切处理，回收酶切后的载体；相邻dna片段间有20～30bp的同源序列，将基因片段f1，f2，f3与用not i和sac ii酶处理的线性化感染性克隆载体pok-rgi进行等比例混合，并利用neb gibson assembly重组酶进行同源重组；随后，转化大肠杆菌top 10中，挑取单克隆菌落进行扩增与质粒提取，鉴定并测序正确的质粒命名为pok-rgi-p30；（2）、重组病毒的拯救；用限制性内切酶sal i将质粒pok-rgi-p30进行线性化处理后；利用t7体外转录试剂盒mmessage mmachine t7 transcription kit，以线性化质粒pok-rgi-p30为模板，体外转录获重组病毒的基因组rna全长；将重组病毒rna利用转染试剂lipofectamin messengermax转染至bhk-21细胞中，待出现典型细胞病变，获得拯救的rgi-p30重组病毒。2.根据权利要求1所述的一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒的构建方法，其特征是：步骤（1）中，所述的gi型日本脑炎病毒的cdna感染性克隆质粒pok-rgi，序列如seq id no.4所示。3.根据权利要求1所述的一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒，其特征是：步骤（2）中，所述的rgi-p30重组病毒，其基因组序列如seq id no.5所示。4.利用权利要求1-2任意一项权利要求所述的构建方法构建的一株表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒。5.权利要求1-2任意一项权利要求所述的构建方法构建的表达asfv p30蛋白的重组gi型日本脑炎病毒在制备疫苗中的应用。

技术总结

本发明涉及一株表达ASFV P30蛋白的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用，利用同源重组技术将ASFV P30蛋白基因克隆入上游设置T7启动子的GI型日本脑炎病毒基因组中的5

技术研发人员：

李晨曦 李燕华 陈萱

受保护的技术使用者：

扬州大学

技术研发日：

2022.09.19

技术公布日：

2023/3/3