一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒的制作方法

1.本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。

背景技术：

2.禽白血病病毒(avian leukosis virus，alv)属于反转录病毒科α反转录病毒属成员，感染禽类能够引起多种肿瘤性疾病。根据病毒囊膜蛋白抗原性差异、病毒干扰实验及宿主范围，目前alv可分为a～k 11个亚(alv-a～k)。仅a～e、j、k亚从鸡分离到，其余亚见于其他鸟类，其中a亚对蛋鸡危害较大，j亚对肉鸡危害严重。由于该病具有水平传播与垂直传播的能力，因而给养禽业造成了严重的危害，属于“国家中长期动物疫病防治规划”中必须净化的疫病。
3.我国对于禽白血病的通用检测标准是基于p27抗原的酶联免疫吸附试验(ny-t 680-2018禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法)，该方法在检测成本、灵敏度、特异性方面存在诸多缺陷。随着科技的发展，以pcr、lamp等分子生物学方法在禽白血病病毒的快速检测中得到逐步应用，但上述方法仍存在诸多缺陷。例如，pcr方法灵敏度相对偏低，检测时间也相对偏长；lamp方法较pcr方法灵敏度大幅提高，检测时间也缩短，但极易发生气溶胶污染，且因引物较多易造成引物二聚体，无法通过琼脂糖凝胶电泳辨别假阳性结果。
4.基于上述原因，本发明提供一种新型的禽白血病病毒核酸检测方法，可有效解决普通pcr和lamp检测中的缺陷仅使用一对引物，就可以达到简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

技术实现要素：

5.本发明针对传统核酸检测技术在禽白血病病毒检测中存在的不足，特别是如何提高检测效率、灵敏度与特异性，提供了一种特异性检测禽白血病病毒的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
6.本发明技术方案如下：
7.本发明提供了一种特异性检测禽白血病病毒的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述禽白血病病毒的核酸检测试剂盒包括10
×
反应缓冲液、8000u/μl bst dna聚合酶、10mm dntps、检测引物、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、阳性对照和阴性对照；所述检测引物为seq id no.1的引物和seq id no.2的引物的组合。
8.本发明通过使用特别设计的一对检测引物，就可以实现特异性强、灵敏度高的优点。特别需要说明的是，本发明的试剂盒加入石墨化碳纳米管后的扩增条带，有单一的目的特异性条带(如图1所示)。本发明设计是在链交换扩增(使用一对引物进行等温扩增)的基础上改进的(仍使用一对引物，分两步进行扩增)。研究发现，在不加入石墨化碳纳米管的情况下，会出现类似链交换扩增的非特异性扩增现象(如图1所示，出现引物二聚体而特异性条带不清晰等)，所以通过加入石墨化碳纳米管等新型纳米材料可以最大限度的提高反应
特异性。石墨化碳纳米管对基因扩增的机制不明，据推测由于表面电荷性质，可与单链dna形成相对稳定的结构，而双链dna由于双链间氢健作用力更稳定，所以不会石墨化碳纳米管结合。因此，石墨化碳纳米管可以吸附多余未参加反应的引物单链，以防止引物二聚体的产生，有效提高反应特异性。
9.本发明的试剂盒中加入甜菜碱可帮助dna聚合酶顺利通过dna某些复杂二级结构，防止dna聚合酶从模板dna中解离。dna局部区域因含有多个复杂碱基(py-g-c)，会促使dna聚合酶的停滞，最终导致dna聚合酶停止有效延伸。而甜菜碱可提高dna小沟中富含鸟嘌呤和胞嘧啶区域的鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响dna分子结构，改变dna灵活性，帮助dna聚合酶沿着dna模板延伸。其次，甜菜碱可消除变性温度对碱基的依赖性。浓度依赖性降低高gc含量序列的tm，并使不同引物的tm相接近，最终降低dnatm值。此外，甜菜碱溶液可稳定dna-蛋白复合物。
10.进一步的，所述阳性对照为禽白血病病毒js11c1阳性模板，所述阴性对照为无菌生理盐水
11.进一步的，所述试剂盒检测体系的组分为：每20μl反应体系包括：2μl的10
×
扩增缓冲液、2μl dntps(1～10mm)、0.5μl聚乙二醇甲醚、1μl甜菜碱(8mm)、引物alv-f和alv-r(10μm)各2μl、0.8μlbst dna聚合酶(8000u/ml)、1μl石墨化碳纳米管溶液(10ng/μl)、0.2μl sybr green i(100
×
)、3μl模板和5μl无菌生理盐水。
12.进一步的，所述禽白血病病毒检测方法的反应流程为：74℃1秒，61℃1秒，循环总数45。
13.进一步的，所述10
×
反应缓冲液含有200mm tris-hcl，100mm(nh4)2so4，500mm kcl，20mm mgso4，1％曲拉通，ph 8.0～8.8。
14.进一步的，所述禽白血病病毒检测方法的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
15.进一步的，所述dntps包括dgtp、dctp、datp、dttp，各组分浓度均为2.5mm。
16.更进一步的，一种使用通用型禽白血病病毒检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
17.s1：试剂盒提取样品中的dna，得到检测模板。
18.s2：将缓冲液、bst dna聚合酶、dntps、sybr green i、甜菜碱、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液、检测引物以及dna模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积20μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量pcr仪进行扩增反应；
19.s3：当反应结束后，荧光曲线起峰(荧光值大于0.001)判定为阳性；当荧光曲线未起峰(荧光值小于等于0.001)时判定为阴性。或采用3％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
20.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
21.本发明根据美国生物技术信息中心基因序列数据库genbank中已公开的已知不同亚型禽白血病病毒全基因序列，通过多种比较基因组学技术比较分析，成功筛选获得禽白血病病毒的特异基因序列，进一步设计引物，优化反应条件，成功建立通用型禽白血病病毒核酸检测方法，具有灵敏度高，特异性强的优点。同时，本发明只需通过一次反应，即可对禽白血病病毒进行快速检测，相比传统的核酸检测方法，在检测时间与检测成本方面具有较
大优势，适合于批量检测。
附图说明
22.图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中：m为takara 20bp dna ladder(dye plus)，泳道1为含石墨化碳纳米管体系检测禽白血病病毒js11c1，泳道2为不含石墨化碳纳米管检测禽白血病病毒js11c1，泳道3为阴性对照；
23.图2为实施例3中抗干扰评价实验的检测结果。图中：1为禽白血病病毒的阳性模板；2为禽白血病病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡减蛋综合征病毒的混合阳性模板；3为阴性对照；
24.图3为实施例4中敏感性评价的检测结果。图中：1为2.4
×
103copies/μl，2为2.4
×
102copies/μl，3为2.4
×
101copies/μl，4为2.4
×
100copies/μl，5为2.4
×
10-1
copies/μl，6为阴性对照。
具体实施方式
25.下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
26.实施例1通用型禽白血病病毒核酸检测方法的建立
27.引物的设计：根据genbank数据库中已知的禽白血病病毒dna序列及其它物种dna序列，通过分析比对后，筛选出禽白血病病毒通用核苷酸序列，在此基础上设计、优选得到用于特异性检测禽白血病病毒的引物，如下表所示。
28.表1通用型禽白血病病毒核酸检测引物序列
[0029][0030]
模板制备：将禽白血病病毒js11c1接种df1细胞后进行病毒分离，使用商品化的试剂盒提取病毒基因组dna，作为待检模板。
[0031]
检测试剂的配制：10
×
反应缓冲液(其组分包括200mm tris-hcl，100mm(nh4)2so4，500mm kcl，20mm mgso4，1％曲拉通，ph 8.0～8.8)、dntps(包含dgtp、dctp、datp、dttp，各组分浓度均为2.5mm)、bst dna聚合酶(8000u/μl)、10μm检测引物、0.5μl聚乙二醇甲醚、甜菜碱、石墨化碳纳米管溶液、10
×
sybr green i。此外，设置石墨化碳纳米管缺省对照组。
[0032]
检测体系及扩增程序：检测体系为20μl，具体包括：2μl的10
×
扩增缓冲液、2μl dntps(1～10mm)、0.5μl聚乙二醇甲醚、1μl甜菜碱(8mm)、引物alv-f和alv-r(10μm)各2μl、0.8μl bst dna聚合酶(8000u/ml)、1μl石墨化碳纳米管溶液(10ng/μl)、0.2μl sybr green i(100
×
)、3μl模板和5μl无菌生理盐水。扩增程序的步骤包括74℃1秒，61℃1秒，循环总数45。
[0033]
检测结果的判定：当反应结束后，荧光曲线起峰(荧光值大于0.0001)判定为阳性；当荧光曲线未起峰(荧光值小于等于0.0001)时判定为阴性。或取5μl扩增产物，加1μl 6
×
loading buffer混匀，点样于3％琼脂糖凝胶电泳板孔中，100v电压，电泳40min，于凝胶成像仪下拍照判定，可见约50bp大小的条带，而缺省石墨化碳纳米管对照组几乎未见特异性条带，而出现了引物二聚体(如图1)。
[0034]
实施例2特异性评价实验
[0035]
用实施例1的方法进行本发明检测方法的特异性评价，将6种鸡源常见病毒(禽白血病病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡减蛋综合征病毒)的阳性模板按照实施例1所述方法进行检测，结果如表2所示，只有禽白血病病毒的检测结果为阳性，其它种属细菌均为阴性。
[0036]
表2本发明特异性评价试验结果
[0037][0038]
实施例3抗干扰评价实验
[0039]
用实施例1的方法进行本发明检测方法的敏感性评价。提取禽白血病病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡减蛋综合征病毒的阳性模板。将提取的模板分为2份，1号样品仅含禽白血病病毒阳性模板，2号样品为禽白血病病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和鸡减蛋综合征病毒阳性模板的等比例混合物，3号样品为阴性对照。按照实施例1所述方法进行检测，结果如图2所示，1号样品和2号样品均显示出明显的荧光曲线，3号样品无荧光曲线出现，表明本发明方法具有较好的抗干扰能力。
[0040]
实施例4灵敏度评价实验
[0041]
用实施例1的方法进行本发明检测方法的敏感性评价。将禽白血病病毒js11c1基因组dna测定原始浓度后10倍梯度稀释，对不同稀释梯度阳性模板进行扩增。由图3可知本发明方法检测禽白血病病毒的最低下限可达2.4拷贝(2.4
×
100copies/μl)，表明该方法具有较高的灵敏度和应用价值。
[0042]
实施例5稳定性评价实验
[0043]
用实施例1的方法进行本发明检测方法的重复性评价。以禽白血病病毒js11c1阳性模板分别进行10次扩增测试。结果见表3，由表可见，荧光信号时间阈值(tt)相对稳定(变异系数约为4.9％)，阴性对照无荧光信号时间阈值，表明该方法具有较好的稳定性。
[0044]
表3稳定性测试结果
[0045][0046][0047]
实施例6检测试剂盒的组装
[0048]
根据实施例1表中的序列合成禽白血病病毒特异性检测引物，用灭菌生理盐水稀释为10μm浓度，等体积混合后得到检测引物；阳性对照；禽白血病病毒js11c1阳性模板；核酸扩增试剂：10
×
反应缓冲液(其组分包括200mm tris-hcl，100mm(nh4)2so4，500mm kcl，20mm mgso4，1％曲拉通，ph 8.6～8.8)、dntps(包含dgtp、dctp、datp、dttp，各组分浓度均为2.5mm)、bst dna聚合酶(8000u/μl)、甜菜碱(8mm)、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液(10ng/μl)检测引物、阳性对照以及阴性对照(无菌生理盐水)。
[0049]
将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等)，组装成本发明所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒。
[0050]
实施例7临床病料检测
[0051]
临床收集的53份具有疑似禽白血病病毒病变的病料，经病毒分离和dna提取后备用。分别采用实施例1的方法和禽白血病病毒检测标准(db22t2921-2018)中的方法进行禽白血病病毒检测。结果如表4所示，53份临床病料中，本发明检测方法的阳性检出率为35.8％(19/53)，高于禽白血病病毒检测标准的检出率30.2％(16/53)。而禽白血病病毒检测标准检出的阳性病料(无论是a、b或j亚)使用本发明方法也均为阳性结果，而对3例检测标准结果为阴性的样品进行测序分型表明均为k亚禽白血病病毒。表明本发明试剂盒所建立的检测方法具有较好准确率。此外禽白血病病毒检测标准(db22t2921-2018)检测周期约需要4个小时时间，而采用本发明试剂盒检测仅需约半小时。
[0052]
表4临床样本检测结果
[0053]
[0054][0055]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：

1.一种通用型禽白血病病毒新型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：1)反应缓冲液；2)检测引物：正向引物alv-f和反向引物alv-r，所述的alv-f和alv-r引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示；3)dna聚合酶；4)dntps；5)sybr green i；6)甜菜碱；7)聚乙二醇甲醚；8)石墨化碳纳米管。2.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌新型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：9)阳性对照：禽白血病病毒js11c1阳性模板；10)阴性对照：无菌生理盐水。3.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液含有tris-hcl、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁和曲拉通。4.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：正向引物alv-f和反向引物alv-r的浓度均为10pmol/μl。5.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测反应体系为：每20μl反应体系包括：2μl的10
×
扩增缓冲液、8mm dntps 2μl、0.5μl聚乙二醇甲醚、1～10mm甜菜碱1μl、10μm引物alv-f和alv-r各2μl、8000u/ml bst dna聚合酶0.8μl、10ng/μl石墨化碳纳米管溶液1μl、0.2μl 100
×
sybr green i、3μl模板和5μl无菌生理盐水。6.权利要求1-5任意一项所述的一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒在制备检测禽白血病病毒的试剂中的应用。7.一种使用权利要求1-5任意一项所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：s1：试剂盒提取样品中的dna，得到检测模板。s2：将缓冲液、bst dna聚合酶、dntps、sybr green i、甜菜碱、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液、检测引物以及dna模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积20μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量pcr仪进行扩增反应；s3：当反应结束后，荧光曲线起峰，即荧光值大于0.001判定为阳性；当荧光曲线未起峰，即荧光值小于等于0.001，时判定为阴性；或采用3％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。

技术总结

本发明公开了一种通用型禽白血病病毒新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述试剂盒包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、SYBR Green I、检测引物，所述检测引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。与传统检测试剂盒和检测方法相比，本发明方法具有简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，在检测时间与检测成本方面具有显著优势，适合于批量检测。适合于批量检测。适合于批量检测。