树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒、其制备方法及其应用与流程

1.本发明属纳米材料领域，具体涉及一种树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒的制备方法。

背景技术：

2.作为一种新型的纳米材料，荧光碳纳米颗粒(fluorescent carbon nanoparticles，fcns)已成为目前的研究热点，在光催化、化学分析、生物传感、生物成像和药物递送等多个领域得到了广泛的应用(a.simpson,r.r.pandey,et al.carbon,2018(127):122-130；胡胜亮等“荧光碳纳米颗粒：新进展和技术挑战”《化学进展》，2010.vol.22.no2/3)。
3.荧光碳纳米颗粒(fcns)表面存在大量的含氧或含氮基团，可与功能性物质结合形成复合材料，在实现表面功能化的同时，还可以改善表面缺陷，提高荧光量子产率，有利于fcns的应用(h.ali,s.k.bhunia,et al.acs appl.mater.interfaces,2016(8):9305-9313)。
4.聚酰胺-胺型树枝状大分子(polyamide amine dendrimer，pamam)结构独特、性能优异，常被用作药物载体材料。pamam内部含有大量的疏水空隙，可以用来包埋药物，同时，其末端含有大量带有正负电荷的氨基和羧基，可以通过静电作用或者共价连接的方式连接药物(z.zhang,y.a.lin,et al.j.neuroinflamm.,2020,17(1):319)。
5.因此，将聚酰胺-胺型树枝状大分子修饰到荧光碳纳米颗粒表面，合成pamam@fcns(树枝状大分子功能化碳纳米颗粒)，受到越来越多的科研工作者的关注。pamam@fcns有望成为一种兼具成像、靶向和一体化的多功能给药体系(i.matai,a.sachdev,et al.acs appl.mater.interfaces,2015(7):11423-11435；d.li,y.fan,et al.j.mater.chem.b,2019(7):277-285；d.li,l.z.lin,et al.bioact.mater.2021(6):729-739)。
6.但是，目前报道的pamam@fcns都是短波长(蓝-绿，440-570nm)荧光发射，容易受生物自体背景荧光干扰，且对生物组织有一定程度的损伤。而长波长(黄-红，570-760nm)荧光发射不仅可以减少自体荧光的干扰和对生物组织的损伤，而且具有更强的组织穿透能力，有利于示踪成像递药系统的研究(z.j.zhu,y.l.zhai,et al.mater.today,2019(30):52-79；m.r.zhang,r.g.su,et al.nano res.2019(12):815-821)。
7.长波长发射荧光碳纳米颗粒(fcns)有激发光依赖性和激发光非依赖性两种。激发光依赖性荧光碳纳米颗粒的发射波长随着激发波长的改变而改变，并且当激发波长增大时，其发射波长红移。因此，为了得到长波长发射，通常都是增大激发波长，但是这会引起荧光强度的急剧下降，不利于生物成像(h.j.zhao,j.k.duan,et al.chem.mater.2018(30):3438-3453)。相反地，对于激发光非依赖性fcns，当激发波长改变时，其荧光发射波长保持不变，故可以在其最佳激发波长处激发，以获得最强的荧光发射，灵敏度高，便于生物成像(x.w.hua,y.w.bao,et al.acs appl.mater.interfaces,2019(11):32647-32658)。
8.目前，国内外pamam@fcns的研究工作尚处在起步阶段，还未见有合成同时具有激
发光非依赖性和长波长发射两个特性的pamam@fcns的报道。

技术实现要素：

9.本发明的目的在于针对上面所述的问题，提供树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒、其制备方法及其应用。所述的树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒(pamam@fcns)是在荧光碳纳米颗粒(fcns)表面修饰聚酰胺-胺型树枝状大分子(pamam)得到，同时具有激发光非依赖性和长波长发射两个特性。因为pamam本身不发射荧光，所以，要求合成的荧光碳纳米颗粒(fcns)不仅激发光非依赖、发射长波荧光，而且还要含有可以与pamam偶联的基团。制备方法简便易行、成本低廉、适于推广，批量和绿生产。合成的pamam@fcns，可以作为新型成像示踪基因递送纳米载体。
10.为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
11.树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒，是在荧光碳纳米颗粒(fcns)表面修饰聚酰胺-胺型树枝状大分子(pamam)，同时具有激发光非依赖性和长波长发射两个特性。
12.所述的pamam@fcns的最大发射波长为585nm。
13.树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒的制备方法，步骤如下：
14.(1)将柠檬酸、三氨基苯超声至完全溶解后转移至高压反应釜中，通过水热法合成荧光碳纳米颗粒(fcns)，所得荧光碳纳米颗粒原液经透析、浓缩、沉淀、洗涤、干燥，制得荧光碳纳米颗粒固体；
15.步骤(1)中，三氨基苯的浓度为0.015～0.15mol/l，柠檬酸与三氨基苯的浓度比为1:1～1:80。
16.(2)取适量荧光碳纳米颗粒，溶解于超纯水中，依次加入nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)、edc(1-(3-二甲基氨基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、pamam(聚酰胺-胺型树枝状大分子)，调节ph值，采用edc偶联法将pamam偶联在荧光碳纳米颗粒表面，得到树枝状大分子修饰碳纳米颗粒pamam@fcn，所得pamam@fcns原液经透析、浓缩、冷冻干燥，制得pamam@fcns固体。
17.步骤(2)中，加入nhs，控制ph在4.0-7.0范围，活化荧光碳纳米颗粒表面的羧基；加入edc，调节ph在7.4-9.0碱性范围，进行荧光碳纳米颗粒和pamam之间的偶联。
18.荧光碳纳米颗粒的浓度为0.2～2.0mg/ml；pamam为0.0-5.0代；pamam的浓度是0.15～1.50mmol/l。
19.在fcns的合成中，本发明采用了设备简单、条件温和的水热法；在原料上，选择了ca(柠檬酸)和tab(三氨基苯)。柠檬酸富含羧基，可为后续荧光碳纳米颗粒的修饰提供偶联基团。三氨基苯富含氨基，可以合成n掺杂荧光碳纳米颗粒(fcns)，n作为提供过剩电子的n型杂质，使荧光碳纳米粒的费米能级和光学性质发生改变。目前，尚未见有将柠檬酸和三氨基苯两者结合作为前驱体合成荧光碳纳米颗粒的报道。
20.在表面修饰pamam前，本发明对荧光碳纳米颗粒(fcns)原液进行了后处理。首先，采用透析-沉淀相结合的方法，分离得到沉淀；然后，洗涤沉淀；最后，真空干燥。与传统的透析方法相比，透析-沉淀方法使得透析时间从48h以上缩短至3h，减少了损失，提高了产率。其次，利用纯化的荧光碳纳米颗粒进行表面修饰，可以消除pamam与剩余原料之间的副反应，提高反应效率。
21.在表面修饰pamam时，本发明采用edc(1-(3-二甲基氨基)-3-乙基碳二亚胺盐酸
盐)偶联的方法，通过在荧光碳纳米颗粒的羧基和pamam的氨基之间形成酰胺键，获得共价功能化的pamam@fcns。首先，加入nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)，控制ph在4.0-7.0酸性范围，活化荧光碳纳米颗粒表面的羧基；然后，加入edc，调节ph在7.4-9.0碱性范围，进行偶联。
22.树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒用作成像示踪基因递送纳米载体的应用，pamam@fcns可以与sirna结合形成稳定的复合物，有效递送sirna跨过生物膜进入细胞发挥基因沉默效应。
23.有益效果
24.(1)本发明采用edc偶联法合成pamam@fcns，设备简单、条件温和、绿环保、成本低、产率高。
25.(2)合成的pamam@fcns具有优异的光学性能(激发光非依赖、发射长波长黄荧光、量子产率高)、水溶性高、生物相容性好、细胞毒性低、细胞摄取能力强，能有效递送sirna进入细胞。
附图说明
26.图1实施例16制备得到的fcns和实施例34制备得到的pamam@fcns的紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱图。
27.fcns在257nm和501nm有两个吸收峰，257nm处的吸收峰是由共轭双键c＝c的π-π*跃迁引起的；501nm处的吸收峰是由c＝n、c-n-c、c＝o和c-o的n-π*跃迁引起的(图1a)。
28.在fcns表面修饰pamam生成pamam@fcns后，fcns的257nm的吸收带基本不变，而501nm的吸收带明显向短波方向移动，吸收波长从501减小至443nm，蓝移了58nm(图1a)。
29.荧光发射光谱表明，fcns和pamam@fcns最大发射波长分别为623nm和585nm，均在长波长范围内(570-760nm)。与fcns比较，pamam@fcns的发射波长明显减小，蓝移了38nm，这可能是由表面缺陷引起的，pamam@fcns中氧位官能团占比减小，导致homo-lumo能带带隙变大(图1b)。
30.图2是实施例16制备得到的fcns和实施例34制备得到的pamam@fcns在不同波长光激发下的荧光性能。
31.由图2a可见，随着激发波长的改变，fcns和pamam@fcns的发射波长保持不变，说明两者都是激发光不依赖的，都具有优异的发光特性，可以应用于生物成像研究。但是，随着激发波长的改变，fcns和pamam@fcns的荧光强度发生明显的改变(图2b)。
32.fcns和pamam@fcns的最佳激发波长分别为420nm和440nm。
33.图3是实施例16制备得到的fcns和实施例34制备得到的pamam@fcns傅里叶红外光谱图。
34.由于fcns和pamam@fcns均含有-nh2，在两者的红外光谱图中都出现了n-h的不对称伸缩振动(ν
nhas
)和对称伸缩振动(ν
nhs
)吸收峰。但是，峰位发生了改变，fcns的ν
nhas
和ν
nhs
分别位于3313和3192cm-1
，而pamam@fcns的ν
nhas
和ν
nhs
分别位于3357和3300cm-1
，向高频方向移动。这是因为fcns中的-nh2来自于tab，与苯环发生了p-π共轭效应，吸收频率减小，而pamam@fcns中的-nh2来自于pamam，属于脂肪族伯胺，吸收频率较高。
35.尽管fcns和pamam@fcns中都含有-ch2，但是c-h伸缩振动峰(ν
ch
)，在fcns的红外光谱中并未出现，只出现在pamam@fcns的红外光谱图中，这是因为在fcns的合成原料中，ca含
有-ch2，但其用量极低(n
ca
:n
tab 1：60)，红外分析灵敏度并不高，未检出；而在pamam中-ch2的含量较高，将其修饰在fcns表面后，在2971cm-1
出现ν
ch
。
36.在fcns的红外光谱图中，1625cm-1
和1516cm-1
归属于苯环的骨架伸缩振动、1310cm-1
是芳香族胺的c-n伸缩振动、1198cm-1
是芳香环的c-h面外弯曲振动。但是，这四个吸收峰在pamam@fcns的红外吸收图中均消失，取而代之的，出现了仲酰胺的三个特征峰：c＝o伸缩振动(1645cm-1
)、n-h面内弯曲振动(1557cm-1
)和c-n伸缩振动(1252cm-1
)，这是因为pamam中含有大量的仲酰胺基团。
37.以上结果证实，pamam修饰在了fcns表面，pamam@fcns成功合成。
38.图4是实施例21制备得到的fcns和实施例21制备得到的pamam@fcns透射电子显微镜图。fcns严重聚集(图4a)，而pamam@fcns分散性良好。pamam@fcns呈球形、粒径80nm左右(图4b)。
39.图5是实施例34制备得到pamam@fcns对sirna的迁移影响示意图。游离的sirna带负电荷，会在电场作用下由负极向正极移动，在凝胶中产生明显的sirna迁移带。
40.当pamam@fcns与sirna重量比为0.625:1或1.25:1时，可在与游离sirna相同位置处观察到明亮的条带，表明pamam@fcns对sirna的迁移几乎没有影响。
41.当pamam@fcns与sirna质量比达到2.5:1时，可观察到加样孔内有明亮的sirna条带，并且有向下迁移的sirna条带，说明pamam@fcns未完全阻滞住sirna。
42.当pamam@fcns与sirna的质量比增加到3.75:1以上时，在加样孔内有明亮条带且无向下迁移的条带，说明sirna被pamam@fcns完全阻滞。
43.这些结果表明，适量的pamam@fcns可以与sirna结合形成稳定的复合物，因此有可能作为sirna的载体。
44.图6是实施例34制备得到pamam@fcns的细胞毒性示意图。0μg/ml-100μg/ml浓度范围内的pamam@fcns与pc12细胞共孵育48h后细胞活力均在85％以上，说明pamam@fcns在实验浓度范围内无细胞毒性。
45.图7是实施例34制备得到的pamam@fcns与组蛋白去乙酰化酶2(hdac2)特异性sirna(sihdac2)形成的纳米复合物转染pc12细胞6h后的hdac2蛋白表达水平示意图。
46.与未经转染的空白对照组相比，裸sihdac2转染pc12细胞几乎不影响其hdac2表达。经50μg/ml或100μg/ml的pamam@fcns与sihdac2形成的pamam@fcns/sihdac2复合纳米粒转染后，pc12细胞内hdac2的表达明显降低，特别是浓度为100μg/ml的pamam@fcns与sihdac2形成的纳米复合物。实验结果说明pamam@fcns在一定浓度范围内能有效递送sirna跨过生物膜进入细胞，发挥基因沉默效应。
具体实施方式
47.以下将结合附图和具体实施例具体说明本发明的技术方案：
48.本发明的技术方案中涉及简写的中文备注如下:
49.fcns(fluorescent carbon nanoparticles，荧光碳纳米颗粒)；
50.ca(柠檬酸，m.w.196.081，95％，上海麦克林生化有限公司)；
51.tab(三氨基苯，m.w.192.13，99.5％，国药集团化学试剂有限公司)；
52.pamam(polyamide amine dendrimer，聚酰胺-胺型树枝状大分子，0.0-5.0代，浓
度是0.15～1.50mmol/l，ph范围为4.0-9.0，上海瀚思化工有限公司)；
53.pamam@cnps(树枝状大分子功能化碳纳米颗粒)；
54.nhs(n-羟基琥珀酰亚胺，m.w.115.09，98％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；
55.edc(1-(3-二甲基氨基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，m.w.191.70，98％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；
56.乙酸乙酯(m.w.88.11，99.5％，国药集团化学试剂有限公司)；
57.以上所用试剂均为分析纯。实验室所用超纯水，自制。
58.实施例
59.树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒的制备方法，步骤如下：
60.(1)称取tab(三氨基苯)于离心管中，加入适量ca(柠檬酸)溶液和超纯水，控制总体积7ml，涡旋30s，超声使原料充分溶解。将溶液转移至30ml高压反应釜中，在干燥箱中110～150℃条件下反应2～6h，得到深褐荧光碳纳米颗粒(fcns)，取出，冷却至室温。
61.将上述fcns原液装入md 500规格的透析袋中，超纯水透析3h。用旋转蒸发仪60℃下浓缩至总体积的四分之一后，用乙酸乙酯沉淀。将得到的沉淀，10000rpt离心10min，弃去上清液，用乙酸乙酯洗涤沉淀3次。最后，将沉淀真空干燥，得到褐fcns固体。
62.该反应体系中tab的浓度为0.015～0.15mol/l，
63.ca：tab的浓度比为1:1～1:80；
64.(2)取适量fcns，溶解于超纯水中，加入nhs溶液，调节ph。加入edc溶液，放置于摇床中，在37℃下活化0.5～3h。调节ph，加入pamam，放置于摇床中，在37℃下反应3～10h。将pamam@fcns原液装入md 500规格的透析袋中，超纯水透析1h，旋转蒸发仪60℃下浓缩至溶液总体积的四分之一，冷冻干燥，称重。
65.该反应体系中fcns的浓度为0.2～2.0mg/ml，pamam为0.0-5.0代，pamam的浓度是0.15～1.50mmol/l，ph范围为4.0-9.0。
66.后面的实施例1-36考察了fcns和pamam@fcns的合成条件：
67.fcns的合成，考察了原料比(实施例1-6)、原料用量(实施例7-10)、反应温度(实施例11-14)和反应时间(实施例15-18)。
68.pamam@fcns的合成，考察了fcns的浓度(实施例19-22)、pamam种类(实施例23-26)、pamam用量(实施例27-31)和反应时间(实施例32-36)。具体实施方案和实验结果见表1。
69.表1
70.71.[0072][0073]
从实施例1-18可见，合成fcns的最佳条件为：nca:ntab＝1：60，tab 0.5mol，反应温度130℃，反应时间3h。在此条件下，合成的fcns的荧光发射波长623nm，量子产率9.4％。结果表明，成功合成了长波长发射fcns，为下一步的fcns表面修饰pamam提供了性能优异的原料。
[0074]
实施例19-36显示，随着合成条件的改变，pamam@fcns的荧光发射波长几乎不变，基本稳定在585nm左右；而pamam@fcns的荧光量子产率的变化却很大，在相同条件下，pamam越小，修饰后的pamam@fcns的荧光量子产率越高。但是，pamam越小，其载药量也会越少。
[0075]
综合考虑，pamam@fcns的最佳合成条件为：fcns 0.95mg/ml，浓度0.045μmol/ml，pamam3.0代，反应时间7h。
[0076]
上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒，其特征在于，是在荧光碳纳米颗粒表面修饰聚酰胺-胺型树枝状大分子得到pamam@fcns，其同时具有激发光非依赖性和长波长发射两个特性；所述的pamam@fcns的最大发射波长为585nm。2.权利要求1所述的树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将柠檬酸、三氨基苯超声至完全溶解后转移至高压反应釜中，通过水热法合成荧光碳纳米颗粒，所得荧光碳纳米颗粒原液经透析、浓缩、沉淀、洗涤、干燥，制得荧光碳纳米颗粒固体；（2）取适量荧光碳纳米颗粒，溶解于超纯水中，依次加入nhs、edc、pamam，调节ph值，采用edc偶联法，在荧光碳纳米颗粒的羧基和pamam的氨基之间形成酰胺键，通过共价功能化，将pamam偶联在荧光碳纳米颗粒表面，得到树枝状大分子修饰碳纳米颗粒pamam@fcn，所得pamam@fcns原液经透析、浓缩、冷冻干燥，制得pamam@fcns固体。3.根据权利要求2所述的树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，加入nhs，控制ph在4.0-7.0范围，活化荧光碳纳米颗粒表面的羧基；加入edc，调节ph在7.4-9.0碱性范围，进行荧光碳纳米颗粒和pamam之间的偶联。4.根据权利要求2所述的树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，三氨基苯的浓度为0.015~0.15 mol/l，柠檬酸与三氨基苯的浓度比为1:1~1:80。5.根据权利要求2所述的树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中荧光碳纳米颗粒的浓度为0.2~2.0 mg/ml；pamam为0.0-5.0代；pamam的浓度是0.15~1.50 mmol/l。6.权利要求1所述的树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒，用作成像示踪基因递送纳米载体的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，是pamam@fcns与sirna结合形成稳定的复合物，有效递送sirna跨过生物膜进入细胞发挥基因沉默效应。

技术总结

本发明公开了树枝状大分子功能化荧光碳纳米颗粒、其制备方法及其应用。首先，将柠檬酸、三氨基苯通过水热法合成荧光碳纳米颗粒FCNs，然后采用EDC偶联法，在荧光碳纳米颗粒的羧基和PAMAM的氨基之间形成酰胺键，通过共价功能化，将PAMAM偶联在荧光碳纳米颗粒表面，得到树枝状大分子修饰碳纳米颗粒PAMAM@FCNs。其同时具有激发光非依赖性和长波长发射两个特性，能有效递送siRNA跨过生物膜进入细胞，在新型成像示踪基因递送纳米载体研究方面具有潜力。与现有技术相比，本发明的制备方法简便易行、成本低廉、适于推广。适于推广。适于推广。