绿荧光碳点Mis-mPD-CDs在检测细胞核、微生物、动物和溶液pH值的应用

绿荧光碳点mis-mpd-cds在检测细胞核、微生物、动物和溶液ph值的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术，特别涉及一种绿荧光碳点在检测细胞核和活体ph值中的应用。

背景技术：

2.细胞的不同细胞器的ph显着不同，这对于其独特的生物功能至关重要(journal of the american chemical society 2014，136，12253-12256)。细胞器中ph值的异常会导致细胞功能失调，例如，线粒体、高尔基体和内体的酸化分别与凋亡细胞死亡、蛋白质糖基化和内化配体降解有关(nature genetics 2008，40，32-34)。同时，低ph会破坏蛋白活性(acs nano 2012，6，2917-2924)。因此，开发荧光传感器来检测活细胞中不同细胞器的ph值至关重要。
3.细胞核在dna复制、mrna和核糖体合成以及基因表达等多种细胞过程中发挥着核心作用(analytical chemistry 2019，91，9259-9265)。细胞核ph值的异常会导致核形态异常，并与多种疾病有关，包括心脏病(trends in genetics 2012，28，464-471)、骨骼肌病(nature reviews molecular cell biology 2002，3，575-585)、阿尔茨海默病(neuroreport1994，5，2529-2533)等。因此，监测细胞核的活动非常重要(frontiers in chemistry 2021，1018)。细胞核在生理条件下维持ph值约7.2(nature reviews molecular cell biology 2010，11，50-61)。因此，能够探测细胞核的ph值是了解生理和病理条件下细胞核功能的关键(molecular biology of the cell 2018，29，220-233)。然而，据我们所知，目前尚无可用于细胞核ph检测的技术。
4.碳点(cds)是一类新兴的碳衍生荧光纳米材料，近年来引起了人们的广泛关注(carbon 2022，191，636-645)。基于cds的荧光ph探针已被开发用于活细胞ph检测。然后大多数可用的源自cds的ph传感器仅在体外或整个细胞中检测ph，无法实现亚细胞器ph的检测(talanta 2017，162，65-71；nanoscale2014，6，3868-3874)。只有几种具有内在ph响应特性的细胞器靶向cds被构建用于监测溶酶体(nanoscale 2014，6，3868-3874)和内质网(nanoscale 2018，10，12788-12796)中的ph值。如，ye等人通过水热法制造了双光子荧光cds，以用作溶酶体ph值的荧光传感器(small 2019，15，1901673)。zhang等人报道了具有溶酶体靶向能力的功能性cds，实现了体外溶酶体ph检测(nanoscale 2018，10，14705-14711)。shuang等人应用月桂胺功能化cds和胺功能化cds分别追踪溶酶体和内质网的ph变化(nanoscale 2018，10，12788-12796)。然而，基于cds的细胞核ph荧光探针还未见报道。

技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是提供一种绿荧光碳点在检测细胞核和活体ph值的应用。
6.技术方案：本发明所述的绿荧光碳点在检测细胞核和活体ph值中的应用。
7.进一步地，所述绿荧光碳点mis-mpd-cds以牙刷树miswak，mis和甲苯二胺m-phenylenediamine，mpd为原料制备得到。
8.进一步地，溶液包括自然水样或废水。
9.进一步地，检测步骤包括：
10.(1)不同ph浓度的溶液样品与mis-mpd-cds混合；
11.(2)对步骤(1)中获得的混合溶液用荧光光谱仪进行荧光强度的检测；
12.(3)通过定量溶液中的mis-mpd-cds荧光强度来检测溶液的ph值。
13.进一步地，mis-mpd-cd的浓度为10-1000μg/ml。
14.进一步地，微生物包括细菌或真菌。
15.进一步地，检测方法包括：
16.(1)把细胞核、细菌或真菌先用不同浓度的ph溶液处理，后与mis-mpd-cds共孵育；
17.(2)孵育后进行荧光强度的观察，进行荧光强度的检测；
18.(3)通过定量细胞内的mis-mpd-cds荧光强度来检测细胞内ph值。
19.进一步地，mis-mpd-cd的浓度为10-1000μg/ml，孵育时间为2-60min。
20.进一步地，所述动物包括斑马鱼、鼠、果蝇。
21.进一步地，检测方法包括：
22.(1)动物先用不同浓度的ph溶液处理，后与mis-mpd-cd共孵育，其中，mis-mpd-cd的浓度为50-1000μg/ml，孵育时间为30-120min；
23.(2)孵育后在共聚焦荧光显微镜下进行观察；
24.(3)通过荧光强度的检测用于定量分析生物体内的ph值。牙刷树首先打磨成粉并溶解于水中。
25.有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点为：该荧光碳点mis-mpd-cds能实现亚细胞水平和生物体水平的成像和ph值检测。其次，与已有cds相比，mis-mpd-cds具有较宽的ph响应范围，具有ph 2-7和ph 7-12两个线性响应范围。
26.通过合成一种荧光碳点，用于开拓溶液中、细胞核中和生物体中的ph值的检测方法，应对现有细胞核ph值检测困难的问题。
附图说明
27.图1为荧光碳点的透射电镜成像图；
28.图2为荧光碳点的粒径分布频率(frequency)示意图；
29.图3为荧光碳点的荧光图谱图；
30.图4为荧光碳点检测ph值能力的评价；
31.图5为荧光碳点染细胞核的能力评价；
32.图6为荧光碳点检测细胞核内ph值的能力评价；
33.图7为荧光碳点检测斑马鱼内ph值的能力评价。
具体实施方式
34.实施例1 mis-mpd-cds荧光碳点的制备
35.牙刷树根研磨成细粉后，将100mg牙刷树根粉末和30mg间苯二胺溶解在30ml蒸馏
水中。将所得溶液移入80ml聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，并在180℃下加热12h。冷却至室温后，将溶液以15000rpm离心15min以收集上清液，进一步通过0.22μm滤膜过滤。最后将所得mis-mpd-cds溶液4℃保存备用。
36.实施例2 mis-mpd-cds荧光碳点的透射电镜观察：
37.将过滤好的mis-mpd-cds荧光碳点用去离子水稀释，取10μl滴在铜网上，用透射电镜(malvern instruments，nano zs，united kingdom)进行观察，如图1所示。透射电镜观察的结果显示该荧光碳点近似球形结构且分布均匀。
38.实施例3 mis-mpd-cds荧光碳点粒径分布检测
39.按比例尺测量图1透射电镜观察得到的荧光碳点的直径，统计其粒径分布，如图2所示，显示该荧光碳点的平均粒径约为19.6nm。
40.实施例4 mis-mpd-cds荧光碳点荧光光谱检测
41.mis-mpd-cds在水中的荧光光谱分别通过荧光分光光度计(rf-5301pc，shimadzu，japan)进行检测。如图3所示，显示该荧光碳点发出绿光，在波长440nm激发下有510nm处的最高发射峰。
42.实施例5 mis-mpd-cds荧光碳点的检测ph值的能力评价
43.将mis-mpd-cds与不同ph值(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12)的溶液混合，mis-mpd-cds的终浓度为50μg/ml。在440nm激发下测量混合溶液在510nm处的荧光强度。如图4所示，随着ph值的升高，mis-mpd-cds荧光强度减弱。在ph 2-7和ph 7-12范围内具有良好的线性关系。
44.实施例6 mis-mpd-cds荧光碳点的染细胞核的能力评价
45.用mis-mpd-cds分别与a549细胞孵育30min后，另外再同时使用mis-mpd-cds和专用于细胞核的商业染料hoechst 33342孵育上述细胞10min。用荧光共聚焦显微镜观察细胞。由图5中可知，与mis-mpd-cds孵育过的动物细胞显示绿荧光，表明mis-mpd-cds可以进入动物细胞中。此外，细胞中的绿荧光与hoechst 33342的蓝荧光很好地重叠，这表明mis-mpd-cds有细胞核染功能。
46.实施例7 mis-mpd-cds荧光碳点的检测细胞核内ph值的评价
47.a549细胞先用不同ph值(ph 1，3，7或9)的溶液中处理1h，然后与100μg/ml的mis-mpd-cds孵育1h。然后使用流式细胞仪检测。如图6所示，随着ph值的增加，a549细胞核中mis-mpd-cds荧光的强度降低，表明mis-mpd-cds可用于动物细胞核ph值的检测。
48.实施例8 mis-mpd-cds荧光碳点的检测斑马鱼内ph值的评价
49.斑马鱼用不同ph值(ph 1，3，7或9)的溶液中处理1h，然后用100μg/ml的mis-mpd-cds孵育1h。通过荧光共聚焦显微镜观察样品的荧光强度。如图7所示，斑马鱼的荧光强度随ph值升高而降低，表明mis-mpd-cds可以用于检测斑马鱼体内的ph值。

技术特征：

1.一种绿荧光碳点mis-mpd-cds在检测细胞核、微生物、动物和溶液ph值的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述绿荧光碳点mis-mpd-cds以牙刷树miswak，mis和甲苯二胺m-phenylenediamine，mpd为原料制备得到。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：溶液包括自然水样或废水。4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：检测步骤包括：(1)不同ph浓度的溶液样品与mis-mpd-cds混合；(2)对步骤(1)中获得的混合溶液用荧光光谱仪进行荧光强度的检测；(3)通过定量溶液中的mis-mpd-cds荧光强度来检测溶液的ph值。5.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：mis-mpd-cd的浓度为10-1000μg/ml。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：微生物包括细菌或真菌。7.根据权利要求1或6所述的应用，其特征在于：检测方法包括：(1)把细胞核、细菌或真菌先用不同浓度的ph溶液处理，后与mis-mpd-cds共孵育；(2)孵育后进行荧光强度的观察，进行荧光强度的检测；(3)通过定量细胞内的mis-mpd-cds荧光强度来检测细胞内ph值。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：mis-mpd-cd的浓度为10-1000μg/ml，孵育时间为2-60min。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述动物包括斑马鱼、鼠、果蝇。10.根据权利1或9所述的应用，其特征在于：检测方法包括：(1)动物先用不同浓度的ph溶液处理，后与mis-mpd-cd共孵育，其中，mis-mpd-cd的浓度为50-1000μg/ml，孵育时间为30-120min；(2)孵育后在共聚焦荧光显微镜下进行观察；(3)通过荧光强度的检测用于定量分析生物体内的ph值。

技术总结

本发明公开了绿荧光碳点Mis-mPD-CDs在检测细胞核、微生物、动物和溶液pH值的应用。以牙刷树和间苯二胺为原材料，通过一步水热法获得荧光碳点Mis-mPD-CDs。Mis-mPD-CDs可用于评估溶液中、细胞核中、微生物、动物等中的pH值。此外，Mis-mPD-CDs可以进入A549细胞，靶向细胞核进行荧光成像；也可以进入活体斑马鱼的体内，并对生物体组织进行荧光成像。因此，Mis-mPD-CDs检测细胞核和生物体内的pH值。本发明为原位实时检测细胞核中和生物体中的pH值提供了强有力的工具。供了强有力的工具。供了强有力的工具。