调控玉米穗位高的蛋白及其编码基因和应用

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及调控玉米穗位高的蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：

2.玉米(zea mays l)是最主要的粮食、饲料和经济能源作物之一，其生产安全对国家粮食安全有着极其重要的作用。玉米穗位高是影响株型的主要因子，适当降低玉米的穗位高可以提高玉米的抗倒伏能力和适应更高的种植密度，有利于玉米产量的提高和生产安全。因此，挖掘控制玉米株型的相关基因，用于基础研究或分子设计育种，对培育玉米新品种具有重要意义。

技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是如何快速、准确的实现植物穗位高的调控。
4.为解决上述技术问题，本发明提供蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：
5.d1)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物穗位高中的应用；
6.d2)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物穗位高的产品中的应用；
7.d3)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育穗位低的植物中的应用；
8.d4)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育穗位低的植物的产品中的应用；
9.d5)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
10.所述蛋白质可为如下a1)、a2)或a3)：
11.a1)氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质；
12.a2)seq id no.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
13.a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质。
14.上述蛋白质来源于玉米。
15.其中，seq id no.1由2449个氨基酸残基组成。
16.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
17.所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag蛋白标签、his蛋白标签、mbp蛋白标签、ha蛋白标签、myc蛋白标签、gst蛋白标签和/或
sumo蛋白标签等。
18.进一步地，所述的应用中，所述蛋白质来源于玉米。
19.进一步地，所述的应用中，所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：
20.b1)编码上述蛋白质的核酸分子；
21.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
22.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
23.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
24.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
25.b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；
26.b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官。
27.进一步地，上述的应用中b1)所述核酸分子可为如下b1)至b3)任一项所示的dna分子：
28.b1)编码链的编码序列是seq id no.2第130-7479位所示的dna分子；
29.b2)编码链的核苷酸序列是seq id no.3所示的dna分子；
30.b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的dna分子；
31.上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
32.上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
33.进一步地，上述的应用中所述植物为下述p1)-p5)任一种：
34.p1)单子叶植物；
35.p2)禾本目植物；
36.p3)禾本科植物；
37.p4)玉蜀黍属植物；
38.p5)玉米。
39.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也
就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
40.上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
41.所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。
42.所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活，包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。
43.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过crispr-cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
44.为解决上述技术问题，本发明还提供所述的蛋白质和/或生物材料。
45.解决上述技术问题，本发明还提供降低玉米穗位高的方法，所述方法可包括f1)或f2)：
46.f1)通过敲除玉米中上述蛋白质的编码基因来降低穗位高；
47.f2)选用玉米基因组v4版本的140,251,860bp的基因型为gg的玉米作为亲本进行育种。
48.进一步地，所述的方法中，敲除玉米中所述蛋白质的编码基因可为将玉米中核苷酸序列是seq id no.3所示的dna分子进行下述至少一种突变：
49.m1)将玉米基因组中序列3的第5936位胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t，该突变使上述蛋白质的编码基因在序列表中序列2的第3682位胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t，该突变使编码序列中密码子tgg变为tga，从而使编码蛋白提前终止；
50.m2)将玉米基因组中序列3的第2813位鸟嘌呤g突变为腺嘌呤a，该突变使上述蛋白质的编码基因在序列表中序列2的第2727位鸟嘌呤g突变为腺嘌呤a，该突变使编码序列中密码子tgg变为tga，从而使编码蛋白提前终止。
51.上述的方法中，所述玉米可包括玉米自交系。
52.上述的方法中，所述敲除可利用ems突变或crispr/cas9系统进行。
53.本发明还提供上述方法在创制玉米突变体植株和/或玉米育种中的应用。
54.基于ems突变获得了上述蛋白编码基因的突变玉米植株，突变株系自交获得的纯合植株与野生型表型鉴定和比较的结果表明：zm00001d011140基因突变可降低玉米自交系的穗位高，从而证明基因zm00001d011140在玉米穗位高表型中具有重要的生物学功能。
55.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
56.(1)对本发明zm00001d011140蛋白的编码基因进行基因突变后，玉米穗位高显著
降低。
57.(2)本发明为创制玉米突变体植株和/或玉米育种提供了更精准、高效、安全的技术方法，实现了对穗位高的精准改良，可以促进商业化玉米育种进程，克服传统育种的短板，缩短育种周期的同时不影响其他性状。
附图说明
58.图1为ep在8号染体定位到的位点。
59.图2为单倍型为aa的468份自交系与单倍型为gg的1101份自交系穗位高表型比较图。
60.图3为ems突变体目标区段序列比对结果。
61.图4为zm00001d011140基因突变体材料及其穗位高和相对穗位高表型。
具体实施方式
62.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
63.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
64.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
65.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
66.玉米自交系b73为从国家种质资源库申请获得。
67.下述实施例采用spss11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用one-way anova检验，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜0.01(**)表示具有极显著性差异，p＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
68.实施例1、目的基因的确定
69.1.1、玉米穗位高的测定和全基因组关联分析
70.在田间种植1604份玉米自交系材料，采用完全随机区组设计，设置2个重复，每个材料单行种植，行长3米，行宽0.6米，每行种植玉米13株。对成熟期玉米的株高(plant height,ph)、穗位高(ear height,eh)进行测量，取小区内所有植株测量数据的平均值，单位为cm。并利用株高和穗位高计算相对穗位高，计算公式为：ep＝eh/ph。
71.对成熟期玉米的株高(plant height,ph)、穗位高(ear height,eh)进行测量，取小区内所有植株测量数据的平均值，并利用株高和穗位高数据计算。
72.1.2、玉米穗位高相关基因zm00001d011140的鉴定
73.通过全基因组关联分析，在8号染体定位到一个控制穗位高和相对穗位高的明
显信号峰，如图1所示。与相对穗位高显著关联snp位于140,251,860bp(玉米基因组v4版本)位置，该关联位点位于zm00001d011140基因启动子862bp位置。
74.进一步对本研究所用的1604份材料进行单倍型分析，发现可明显分为两个单倍型，其中aa单倍型的穗位高和相对穗位高显著高于gg，从两类单倍型中选取携带aa单倍型材料昌7-2和携带gg单倍型材料郑58进行qrt-pcr，检测zm00001d011140基因在不同单倍型材料中相对表达量，发现zm00001d011140基因在穗位高的材料昌7-2中相对表达量显著高于穗位低材料郑58，如图2中b所示。因此，我们认为zm00001d011140是控制穗位高的候选基因。在此基础上，开展了该基因的功能验证。
75.zm00001d011140基因的基因组序列是如seq id no.3所示的dna分子，其编码序列是如seq id no.2所示的dna分子，其编码氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质，所编码蛋白质命名为zm00001d011140蛋白或蛋白质zm00001d011140。
76.实施例2、zm00001d011140基因组及编码基因的扩增及回收测序
77.2.1、候选基因基因组全长和cdna全长的获得
78.2.1.1、扩增候选基因所需植物材料的制备
79.选取籽粒饱满的玉米自交系b73种子，将种子种植在装有营养土的花盆中，每个盆种植3株，置于光照培养箱中培养(28℃，光照)。待幼苗长至六叶一心期时采集叶片，一部分用于提取基因组dna；另一部分叶片提取rna，-80℃保存。
80.2.1.2、玉米材料基因组dna的提取
81.1)将叶片迅速放入到已灭菌的研钵中，倒液氮充分研磨，期间不断加入液氮，研磨充分后加入2.0ml离心管中，加到离心管1/3处。
82.2)将提前配置好的ctab提取液事先放入65℃水浴锅中预热，然后在上一步中的离心管中加入800μl预热的ctab缓冲液，用力摇晃，使之充分混匀。
83.3)将混合好的提取液置于65℃恒温水浴30min，期间每隔10min晃动一次，使之充分发生反应。
84.4)取出经过充分反应的离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(体积比24:1)，缓慢混匀15min，静止10min。
85.5)将离心管放入到离心机中，12000rpm离心20min。
86.6)小心吸取上清液于另一洁净的2.0ml离心管中，加入等体积经过预冷(-20℃)的异丙醇，轻混摇匀，将离心管放置到-20℃的冰箱中冷冻30min，至大量白沉淀析出。
87.7)用灭菌的头将白沉淀勾出，放入另一洁净的离心管中，加入500ul 75％的乙醇冲洗2-3次。
88.8)离心，倒掉75％的乙醇，用头吸走多余的乙醇后于室温干燥，用1
×
te溶解dna。
89.9)加入rnase进行纯化(终浓度为10ug/ul)，37℃保温箱恒温放置1h。
90.10)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)抽提一次，高速离心(12000rpm)10min，小心吸取上清，再用等体积氯仿/异戊醇(体积比24:1)抽提一次，高速离心(12000rpm)10min。
91.12)用预冷的无水乙醇沉淀dna，离心(12000rpm)10min。
92.13)倒掉乙醇，彻底晾干，以免抑制下游的pcr反应，加入适量te溶解，于-20℃冰箱
保存备用。
93.2.1.3、玉米材料总rna的提取和纯化
94.使用gene-better公司的多糖多酚植物总rna提取试剂盒(带gdna过滤器)提取植物总rna，具体操作方法如下(以下所用实验器皿都经过高温灭菌处理，以除掉rnase)：
95.1)在经过180℃高温处理过的无rnase的研钵中倒入液氮，之后从-76℃超低温冰箱中取出冻存的叶片，加入液氮充分研磨，期间不断补充液氮，研磨充分。
96.2)在向离心管中加入样品之前，先将无rnase的1.5ml的离心管完全浸于液氮中速冻，之后迅速加入研磨的样品，样品不宜加入过多一般加到1/3处(约50mg)，向离心管中加入500ul裂解液和50ul plantaid旋涡震荡20s,使其充分裂解。
97.3)将裂解物13000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的plantaid。
98.4)取裂解物上清转到一个新的离心管。加入与上清体积相同的无水乙醇，立即吹打混匀，不要离心。
99.5)将混合物(每次小于720ul，多可以分两次加入)加入一个基因组dna过滤器中，13000rpm离心2min，弃掉废液。
100.6)将基因组dna过滤器放在一个干净的2ml离心管内，在基因组内过滤器内加入500ul裂解液rlt plus，13000rpm离心30s，收集滤液，用移液器较精确估计过滤体积，加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
101.7)立刻将混合物加入一个吸附柱ra中，13000rpm离心2min，弃掉废液。
102.8)加700ul去蛋白液rw1，室温放置1min，13000rpm离心30s，弃掉废液。
103.9)加入500ul漂洗液rw，13000rpm离心30s弃掉废液。加入500ul漂洗液rw，重复一遍。将吸附柱ra放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
104.10)取出ra吸附柱，放入一个rnase free离心管中，在吸附膜中间加入30-50ul rnase free water，室温放置1min，13000rpm离心1min。
105.1％琼脂糖凝胶电泳18min鉴定所提取rna的质量，并用分光光度计测定所提取rna的浓度，吸取适量的rna用于纯化和反转，剩余的rna放置于-76℃长期保存。
106.2.1.4、反转录合成第一链cdna
107.利用2.1.3提取的的总rna为模板，参考transgen公司one-step gdna removal and cdna synthesis supermix说明书反转录合成cdna，操作步骤如下：
108.20ul反转录反应体系(置于0.2ml无rnase离心管)
109.110.50℃孵育30min，85℃加热5s使酶失活，迅速转至冰上。将cdna原液稀释5倍，用内参基因gadph进行pcr扩增，检测反转效果，-20℃保存备用。
111.2.1.5、候选基因组dna的扩增
112.从玉米maize gdb数据库(https://www.maizegdb.org/)下载参考基因组b73对应的候选基因序列，在基因组5'utr和3'utr区域利用primer5软件设计引物，以2.1.2提取获得的基因组dna为模板扩增候选基因组全长dna，扩增体系如下：
[0113][0114]
其中，引物序列如下：
[0115]
primer 1 5
’‑
gccggctttgcagagatcgac-3’；
[0116]
primer 2 5
’‑
ttgcacaacagcttccataga-3’；
[0117]
primer 3 5
’‑
gtccatccatatagctgcgaaa-3’[0118]
primer 4 5
’‑
atgcacaattaagcattcactg-3’；
[0119]
primer 5 5
’‑
gtcaagtgttgttaagctgatac-3’；
[0120]
primer 6 5
’‑
gcaagcagaacagagtcgctct-3’；
[0121]
primer 7 5
’‑
gcgtctacactcatatgact-3’；
[0122]
primer 8 5
’‑
gtctacaatcctatcacagacat-3’；
[0123]
primer 9 5
’‑
catgtctatttcccatttcccga-3’；
[0124]
primer 10 5
’‑
gcaattagacaaaagccacgtat-3’；
[0125]
primer 11 5
’‑
gatctggagggcctctggag-3’；
[0126]
primer 12 5
’‑
ctaacaccagcttcatgttca-3’；
[0127]
primer 13 5
’‑
gcttctgtgtgggttcgg-3’；
[0128]
primer 14 5
’‑
tcgacgctaaatgaactctgtcc-3’；
[0129]
primer 15 5
’‑
caaactttactgcaaccagt-3’；
[0130]
primer 16 5
’‑
tcttcaatccgtgcttgggtt-3’；
[0131]
primer 17 5
’‑
gttgcctgcagtccaatcgc-3’；
[0132]
primer 18 5
’‑
atccatcgcattttctagcat。
[0133]
pcr扩增程序如下：
[0134][0135]
2.1.6、候选基因全长cdna的扩增
[0136]
根据扩增的基因组dna序列设计引物，以2.1.4获得的cdna分别作为基因扩增的模板，设计引物进行基因全长cdna序列的扩增，扩增体系如下：
[0137][0138][0139]
其中，引物序列如下：
[0140]
primer 19 5
’‑
atgggggagcgagacgcg-3’；
[0141]
primer 20 5
’‑
cagaaggtgcccaacacaaac-3’；
[0142]
primer 21 5
’‑
ctcaactctcataccgacaatgc-3’；
[0143]
primer 22 5
’‑
gtcaaggagctcaacaatgtctg-3’；
[0144]
primer 23 5
’‑
aacaacatttctaccaaggggt-3’；
[0145]
primer 24 5
’‑
catgcagtagaattggtgtcct-3’；
[0146]
primer 25 5
’‑
tgaatgtcaccctctctgcc-3’；
[0147]
primer 26 5
’‑
ctcaagtgttgctggaggatca-3’；
[0148]
primer 27 5
’‑
gcatttggaattccaggctat-3’；
[0149]
primer 28 5
’‑
ttaacgctgatatgctgcagcg-3’；
[0150]
pcr扩增程序如下：
[0151][0152]
2.2、候选基因组dna以及cdna片段回收与测序
[0153]
2.2.1、候选基因组dna以及cdna片段回收
[0154]
片段回收参考北京诺唯赞生物技术股份有限公司的fastpure gel dna extraction mini kit说明书：
[0155]
1)向100ml tae溶液中加入1g的琼脂糖，在微波炉中加热煮沸，之后加入10ul的10000
×
gelstain染料，倒入插有梳子的平板中，制备琼脂1％琼脂糖凝胶，将加入loadingbuffer的2.1.5和2.1.6的pcr产物分别进行琼脂糖凝胶电泳(125v)25min，在长波紫外灯下分别切取目的条带放入1.5ml离心管中。
[0156]
2)向离心管中加入400ul的buffer gdp，用于溶胶。
[0157]
3)将离心管放入到55℃水浴锅中，水浴，每5min上下颠倒混匀一次，直到凝胶完全融化，溶液呈现为淡黄，室温下静置待其温度降至室温后进行下一步反应。
[0158]
4)将上一步离心管中的溶液转入吸附柱之中，将离心管放入离心机中，12000rpm离心30s，弃废液，再将吸附柱放回空的收集管中。
[0159]
5)向吸附柱中加入300ul的buffer gdp，静置1min，将离心管加入到离心机中，12000rpm离心30s，弃废液。
[0160]
6)把吸附柱置于收集管中，加入700ul buffer gw至吸附柱中，12000rpm离心30s；弃滤液。洗两遍。
[0161]
7)将吸附柱放回空的收集管中，12000rpm离心2min。
[0162]
8)取出吸附柱，放入干净的1.5ml无菌离心管中，室温下静置5min，在吸附膜的中间部位加入25ul的洗脱液，室温下静置5min，12000rpm离心2min，收集沉淀。
[0163]
9)重复步骤8。
[0164]
2.2.2、候选基因组dna以及cdna片段测序
[0165]
参考天根生物的plb零背景快速克隆试剂盒说明书，操作步骤如下：
[0166]
1)将2.2.1获得的dna回收片段连接到plb载体，轻弹离心管以混匀反应液。连接体系如下：
[0167][0168]
2)将混合反应液放入22℃恒温金属浴中反应15min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化实验。
[0169]
3)制备含有氨苄青霉素终浓度为100ug/ml的lb琼脂糖平板，将平板放置在37℃，预热20min。
[0170]
4)将10ul的连接产物加入到100ul的大肠杆菌top10感受态细胞中(感受态细胞从-80℃冰箱取出放置于冰上，待刚刚解冻时加入连接产物)，用手轻弹混匀，冰浴30min。
[0171]
5)之后将离心管放置于42℃水浴锅中90s，取出后立即冰浴5min。
[0172]
6)向离心管中加入500ul的lb(不含抗生素)培养基，150rpm、37℃震荡培养60min，使菌体复苏。
[0173]
7)将离心管中的菌液混匀，取100ul加到含氨苄青霉素的lb固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻地将菌液涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃恒温培养12h。
[0174]
8)取出平板，挑取乳白的阳性单克隆至600μl的lb液体培养基(含有100ug/ml的氨苄抗生素)上，37℃震荡培养8h，用plb载体通用引物进行菌液pcr，经琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的克隆进行测序验证，提取质粒用于后续实验。
[0175]
plb载体通用引物序列如下：
[0176]
forward primer：5'-cgactcactatagggagagcggc-3'；
[0177]
reverse primer：5'-aagaacatcgattttccatggcag-3'。
[0178]
其中zm00001d011140蛋白的氨基酸序列、编码序列以及基因组序列如表1所示：
[0179]
表1：
[0180]
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188][0189]
实施例3、zm00001d011140基因功能验证
[0190]
3.1、zm00001d011140基因突变体玉米的获得
[0191]
通过中国ems突变体库，网址为(https://www.elabcaas/memd/public/
index.html#/pages/search/geneid)，按基因编号zm00001d011140查询该基因的相关突变体，获得突变体编号分别为ems-1和ems-2突变体。
[0192]
ems-1突变体突变位置为8号染体140258537bp(玉米基因组v4版本)，为胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t(即序列表中序列3第5936位胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t，导致其编码序列即序列表中序列2的第3682位胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t)，该突变使密码子cga变为tga，从而使编码蛋白提前终止。
[0193]
ems-2突变体突变位置为8号染体140255414bp(玉米基因组v4版本)，为鸟嘌呤g突变为腺嘌呤a(即序列表中序列3第2813位鸟嘌呤g突变为腺嘌呤a，导致其编码序列即序列表中序列2的第2727位鸟嘌呤g突变为腺嘌呤a)，该突变使密码子tgg变为tga，从而使编码蛋白提前终止；
[0194]
ems-1和ems-2突变体的部分基因组序列如表2所示：
[0195]
表2：
[0196][0197]
3.2、zm00001d011140突变体株系的基因型与表型
[0198]
玉米自交系b73(wt)的种子、b73突变体株系ems-1和ems-2种子，每个材料种植2行，行长3米，植株间距为0.25米，行间距为0.6米，种植3个重复。
[0199]
取b73及ems-1和ems-2突变体材料的叶片，用于提取dna。dna的提取同2.1.2中的方法。从dna水平检测zm00001d011140基因突变体植株。提取突变体植株基因组dna，以其作为模板，利用forward prime3和reverse prime3作为引物对ems-1突变体进行单株pcr鉴定，同时利用forward prime4和reverse prime4作为引物对ems-2突变体进行单株pcr鉴定。野生型植株基因组dna和ddh2o为阴性对照。反应体系如下：
[0200][0201]
其中，forward prime3和reverse prime3的核苷酸序列分别是：
[0202]
forward prime3:5
’‑
cttaggtgatggacgattt-3’；
[0203]
reverse prime3:5
’‑
agtggctatgttggtctgtta-3’；
[0204]
forward prime4:5
’‑
ggaagaaggtaagggaact-3’；
[0205]
reverse prime4:5
’‑
gggaaatgggaaatagaca-3’。
[0206]
扩增反应程序为：第一轮：95℃变性5min；第二轮：95℃变性10sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，35个循环；第三轮：72℃延伸5min。程序结束后，通过2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标条带并测序，测序结果如图3所示。将ems突变体的测序结果分别与野生型b104进行比较，结果一致，与野生型b104相比：
[0207]
ems-1突变体突变为将序列表中序列3第5936位胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t，导致其编码序列即序列表中序列2的第3682位胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t，该突变使密码子cga变为tga，从而使编码蛋白提前终止。
[0208]
ems-2突变体突变为将序列表中序列3第2813位鸟嘌呤g突变为腺嘌呤a，导致其编码序列即序列表中序列2的第2727位鸟嘌呤g突变为腺嘌呤a，该突变使密码子tgg变为tga，从而使编码蛋白提前终止。
[0209]
统计ems-1和ems-2突变体纯合株系植株的穗位高。结果发现，ems-1和ems-2突变体纯合株系相比于野生型b73，突变体植株的穗位与相对穗位高降低(图4)。图4中a为ems-1和ems-2突变体纯合株系植株的穗位高表型照片；图4中b为ems-1和ems-2突变体纯合株系植株的玉米穗位高和相对穗位高统计结果及差异显著性分析。结果表明，zm00001d011140基因的突变可显著降低玉米穗位高和相对穗位高；从而证明目的基因在调控玉米穗位高中具有重要的生物学功能。
[0210]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：

1.蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：d1)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物穗位高中的应用；d2)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物穗位高的产品中的应用；d3)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育穗位低的植物中的应用；d4)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育穗位低的植物的产品中的应用；d5)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；所述蛋白质为如下a1)、a2)或a3)：a1)氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质；a2)seq id no.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物穗位相关的蛋白质；a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质。2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于玉米。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：b1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：b1)所述核酸分子为如下b1)至b3)任一项所示的dna分子：b1)编码链的编码序列是seq id no.2第130-7479位所示的dna分子；b2)编码链的核苷酸序列是seq id no.3所示的dna分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的dna分子。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：p1)单子叶植物；
p2)禾本目植物；p3)禾本科植物；p4)玉蜀黍属植物；p5)玉米。6.蛋白质，所述蛋白质为权利要求1-5中任一项所述的蛋白质。7.生物材料，所述生物材料为权利要求3-5中任一项所述的生物材料。8.一种降低玉米穗位高的方法，包括f1)或f2)f1)通过敲除玉米中权利要求1中所述蛋白质的编码基因来降低穗位高；f2)选用玉米基因组v4版本的140,251,860bp的基因型为gg的玉米作为亲本进行育种。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，敲除玉米中权利要求1中所述蛋白质的编码基因为将玉米中核苷酸序列是seq id no.3所示的dna分子进行下述至少一种突变：m1)将玉米基因组中序列3的第5936位胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t；m2)将玉米基因组中序列3的第2813位鸟嘌呤g突变为腺嘌呤a。10.权利要求8或9所述的方法在创制玉米突变体植株和/或玉米育种中的应用。

技术总结

本发明公开了蛋白质及其相关生物材料，以及该蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物穗位高和相对穗位高的应用；所述蛋白质为氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。通过中国EMS突变体库获得该蛋白编码基因的突变玉米植株，突变株系连续自交获得的纯合植株与玉米自交系B73鉴定和比较的结果表明，目的基因的突变可降低玉米自交系的穗位高，从而证明基因Zm00001d011140在穗位高表型中具有重要的生物学功能。物学功能。